一种多靶点的靶向药物对黑色素瘤细胞影响的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及医药检测方法技术领域，尤其涉及一种检测多靶点的靶向药物对黑色素瘤细胞生存及转移能力影响的检测方法。
【背景技术】
[0002]黑色素瘤是源于皮肤、粘膜、眼和中枢神经系统色素沉着区域的黑素细胞的恶性肿瘤，是死亡率最高的皮肤癌。据估计，2009年全美黑色素瘤患病68720例，约占皮肤癌患病的92.1%，死亡8650例，占皮肤癌死因的74.6%，且每年患病率在急速上升。黑色素瘤的发病原因目前尚不清楚，治疗方案以手术和放射治疗为主，辅以药物治疗，但中晚期患者治愈率很低。原因是中晚期肿瘤容易发生转移。肿瘤转移是恶性肿瘤最重要的特征之一，也是影响患者预后的主要因素，临床上90%的肿瘤病人是由于肿瘤转移而死亡。
[0003]肿瘤转移是指肿瘤细胞从原发部位扩散侵入血管或淋巴管或体腔，部分细胞被血流、淋巴流带到另一部位或器官，在该处繁殖生长，形成与原发瘤同样类型的肿瘤。肿瘤转移是一个复杂的多步骤过程，是肿瘤细胞和宿主细胞双方共同作用的结果:一方面，肿瘤细胞自身的特性(细胞膜表面的黏附能力，转移能力，细胞所释放的某些酶和抗原性物质)决定它能否完成转移的各个步骤；另一方面，宿主的内环境或免疫防御机制决定肿瘤的转移是否成功。
[0004]可喜的是，由拜耳和ONYX公司共同研制的一种多靶点的生物靶向药物索拉非尼(sorafenib,多吉美),被临床前研究和临床实验证实具有广泛的抗肿瘤作用。该药物最早被用于肾细胞癌的研究，后经多项临床和体外实验发现索拉非尼在其他诸如肺癌、肝癌等肿瘤的治疗中也能起到相当好的疗效。索拉非尼是一种多激酶抑制剂，能同时抑制多种存在于细胞内和表面的激酶，如RAF、VEGFR2、VEGF3、H)GFR-B、KIT和FLT3等。索拉非尼既可以通过抑制RAF/MEK/ERK信号传导通路，直接抑制肿瘤生长，又可通过抑制VEGFR和TOGFR而阻断肿瘤新生血管的形成从而间接抑制肿瘤细胞的生长和转移。
[0005]索拉非尼在其它肿瘤中的研究已得到深入开展，但是，在索拉非尼治疗黑色素瘤方面尚存在争议。研究显示在60 %的黑色素瘤患者组织中存在BRaf基因的突变，而索拉非尼可以抑制细胞RAF/MEK/ERK信号传导通路，因此推测索拉非尼有可能会改善晚期黑色素瘤患者的预后。而在Eisen等[18]对37例不能手术切除和已有远处转移的黑色素瘤患者II期临床试验研究发现，索拉非尼单药治疗黑色素瘤疗效甚微。
[0006]目前，靶向治疗已经成为最热门的肿瘤治疗研究领域之一，而肿瘤的发生发展是有多种基因和多种激酶共同参与的结果，因此，单靶点抑制剂远不能满足肿瘤的治疗。而索拉非尼具有独特的多靶点的抗肿瘤作用，是基于对肿瘤发生的分子生物学机理认识的基础上研制成功的新药。其作用主要为抑制肿瘤细胞的生长和血管形成，而非细胞毒效应，因此毒副反应较轻且耐受性较好，优于化疗药物。不仅如此，索拉非尼还具有潜在广谱的抗肿瘤作用，临床试验研究结果已证实索拉非尼对多种肿瘤治疗都有明显疗效，这为肿瘤的生物靶向治疗翻开了新的篇章。
【发明内容】
[0007]为了研究检测多靶点的靶向药物对黑色素瘤细胞生存及转移能力影响，本发明提出了一种新的检测多靶点的靶向药物对黑色素瘤细胞生存及转移能力影响的检测方法。
[0008]本发明提出的一种检测多靶点的靶向药物对黑色素瘤细胞生存及转移能力影响的检测方法，其检测过程分为以下步骤:
[0009]1、对黑色素瘤细胞分别常规化疗药物或多靶点的靶向药物的处理，并设置无处理对照组，观察各组细胞的细胞增值抑制率，细胞周期和凋亡率，考察多靶点的靶向药物对细胞生存能力的影响。
[0010]2、对黑色素瘤细胞施以步骤I处理后，RT-PCR检测细胞转移相关基因PERK的表达情况，在基因水平考察多靶点的靶向药物对肿瘤转移的影响。
[0011]3、对黑色素瘤细胞施以步骤I处理后，westernblot (蛋白质印迹)技术检测细胞转移相关蛋白PERK的表达情况，从蛋白质水平研究，多靶点的靶向药物对肿瘤转移的影响。
[0012]4、对黑色素瘤细胞施以步骤I处理后，transwell实验(细胞侵袭实验)观察各组细胞的侵袭和转移能力。
[0013]5、综合数据分析多靶点的靶向药物对黑色素瘤细胞的生存能力和转移能力的作用。
[0014]优选的:所述黑色素瘤细胞为A375。
[0015]优选的:所述多靶点的靶向药物为由拜耳和ONYX公司共同研制的一种多靶点的生物革G向药物索拉非尼(sorafenib,多吉美)。
【具体实施方式】
[0016]下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
[0017]1、药物处理对黑色素瘤细胞A375细胞增殖抑制率、细胞周期和凋亡率的影响
[0018]①取对数生长期不同肿瘤细胞，0.25%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液。
[0019]②调节细胞浓度(每孔1000-10000个细胞，按不同细胞生长的实际情况确定)接种于96孔培养板，每孔0.2ml。
[0020]③37°C、5% C02条件下培养24h，待生长到70_80%后，移去原培养液，将处理药物用DMSO (二甲基亚砜)配置成母液，再用相应的细胞培养液搅拌稀释成5 μ mol/L, 10 μ mol/L，20 μ mol/L, 40 μ mol/L,分别加到96孔板中，设空白对照组、细胞对照组、索拉非尼组、常规化疗药物组，每组设6个平行孔。
[0021]细胞增殖抑制率检测
[0022]④分别继续培养24h、48h、72h后，每孔中加入5mg/ml的MTT溶液20 μ 1，继续培养4h0
[0023]⑤小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150 μ 1DMS0,轻度震荡lOmin，充分溶解细胞内生成的紫色甲臜结晶，酶标仪570nm波长下测定每孔的吸光度值。
[0024]⑥重复测定三次，计算:生长抑制率=1_(实验组OD值一空白组OD值)/(对照组
OD值一空白组OD值)。
[0025]细胞周期和凋亡率检测
[0026]⑦分别继续培养24h、48h、72h，细胞用0.25%胰酶(不含EDTA)消化收集，用PBS洗涤细胞二次(离心2000rpm，5min)收集5 X 105细胞；
[0027]⑧加入500 μ L的结合缓冲液悬浮细胞；
[0028]⑨加入5 μ LAnnexinV-FITC 混勻后，加入 5 μ LPropidium1dide (碘化丙唆),混匀；
[0029]⑩室温、避光、反应5?15min，用流式细胞仪检测(Ex = 488nm ；Em = 530nm)细胞凋亡的情况，用荧光显微镜拍照观察细胞凋亡情况。实验重复三次。
[0030]2、RT-PCR检测各处理组中细胞转移相关基因PERK的表达情况
[0031]细胞mRNA的提取
[0032]①取对数生长期不同肿瘤细胞，0.25%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液。
[0033]调节细胞浓度(每孔1000-10000个细胞，按不同细胞生长的实际情况确定)接种于96孔培养板，每孔0.2ml。
[0034]37°C>5% C02条件下培养24h，待生长到70_80%后，移去原培养液，将处理药物用DMSO配置成母液，再用相应的细胞培养液搅拌稀释成5 μ mol/L, 10 μ mol/L, 20 μ mol/L，40ymol/L，分别加到96孔板中，设空白对照组、细胞对照组、索拉非尼组、常规化疗药物组，每组设6个平行孔