ys )为主，有机砸比例达到86%，砸形态提取率为53%。
[0050]实施例5:富砸极大螺旋藻样品砸形态测定实施例选用的富砸钝顶螺旋藻总砸含量为355 mg/kg (Dff)o
[0051](1)样品的前处理:取0.2g的经过研磨的富砸极大螺旋藻干样，加入5ml 0.lmol/L磷酸缓冲液进行超声提取；
(2)样品破壁酶解:对上述经过前处理的样品体系调节pH值至5-7，然后向其中加入45mg的溶菌酶，然后将离心管水平放置于30?50°C恒温振荡摇床中培养12_18h。
[0052](3)样品酶解:将上述反应体系的pH值调节至1.5-2.5，加入45 mg的胃蛋白酶，然后将离心管水平放置于37°C恒温振荡摇床中18-24h。
[0053](4)样品分离后再酶解:将上述酶解后的样品于冷冻高速离心机中进行离心分离，转速为10000 rpm,离心时间15_30min，取离心后的上清液过0.22 μ m水系膜待测，将离心后的沉淀部分继续加入5ml缓冲液，调节pH值至7.0-8.0，加入45 mg的胰蛋白酶，然后将离心管水平放置于37°C恒温振荡摇床中18-24h。
[0054](5)样品分离:将上述酶解后的样品于冷冻高速离心机中进行离心分离，转速为10000 rpm，离心时间15_30min，取离心后的上清液过0.22 μ m水系膜待测。
[0055](6)上机测定:对上述两个个步骤中过膜后的酶解液采用高效液相色谱法与氢化物发生-原子荧光光谱法(HPLC-HG-AFS)联用上机测定样品中的砸形态。
[0056]实施效果:
经过形态测定分析，富砸极大螺旋藻形态以砸代半胱氨酸(SeCys )为主，有机砸比例达到85%，砸形态提取率为72%。
[0057]实施例6:富砸极大螺旋藻样品砸形态测定实施例选用的富砸极大螺旋藻总砸含量为987 mg/kg (Dff)o
[0058](1)样品的前处理:取0.lg的经过研磨的富砸螺旋藻干样，加入5ml 0.2mol/LTris-HCl缓冲液进行超声提取；
(2)样品破壁酶解:对上述经过前处理的样品体系调节pH值至5-7，然后向其中加入50mg的溶菌酶，然后将离心管水平放置于30?50°C恒温振荡摇床中培养12_18h。
[0059](3)样品酶解:将上述反应体系的pH值调节至7.5，然后加入3 mg的蛋白酶XIV，然后将离心管水平放置于37°C恒温振荡摇床中8-12h。
[0060](4)样品分离后再酶解:将上述酶解后的样品于冷冻高速离心机中进行离心分离，转速为10000 rpm,离心时间15_30min，取离心后的上清液过0.22 μ m水系膜待测，将离心后的沉淀部分继续加入5ml缓冲液，调节pH值至7.5，加入45 mg的胰蛋白酶，然后将离心管水平放置于37°C恒温振荡摇床中18-24h。
[0061](5)样品分离:将上述酶解后的样品于冷冻高速离心机中进行离心分离，转速为10000 rpm，离心时间15_30min，取离心后的上清液过0.22 μ m水系膜待测。
[0062](6)上机测定:对上述两个步骤中过膜后的酶解液采用高效液相色谱法与氢化物发生-原子荧光光谱法(HPLC-HG-AFS)联用上机测定样品中的砸形态。
[0063]实施效果:
经过形态测定分析，富砸极大螺旋藻形态以砸代半胱氨酸(SeCys )为主，有机砸比例达到82%，砸形态提取率为77%。
[0064]以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
【主权项】
1.一种富砸螺旋藻中砸形态测定的方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)样品的前处理:取经过研磨粉碎的富砸螺旋藻干样，加入缓冲液进行超声提取； (2)样品破壁酶解:对步骤(1)经过前处理的混合物，调节pH值至5-7，然后向其中加入溶菌酶，酶解； (3)样品酶解，包括以下步骤的其中之一或其依顺序的任意组合: a.将步骤(2)得到的混合物的pH值调节至7.5，加入蛋白酶K，酶解， b.将步骤a酶解后的混合物进行离心分离，取离心后的上清液过0.22 μπι水系膜待测，将离心后的沉淀部分继续加入缓冲液，调节pH值至7.5，加入蛋白酶XIV，酶解， c.将上一步酶解后的混合物进行离心分离，取离心后的上清液过0.22 μπι水系膜待测，将离心后的沉淀部分继续加入缓冲液，调节pH值至1.5-2.5，加入胃蛋白酶，酶解， d.将上一步酶解后的混合物进行离心分离，取离心后的上清液过0.22 μ m水系膜待测，将离心后的沉淀部分继续加入缓冲液，调节pH值至7.0-8.0，加入胰蛋白酶，酶解， 其中，若步骤b为样品酶解步骤中的第一步，则步骤b为将步骤(2)得到的混合物的pH值调节至7.5，加入蛋白酶XIV，酶解；若步骤c为样品酶解步骤中的第一步，步骤c将步骤(2)得到的混合物的pH值调节至1.5-2.5，加入胃蛋白酶，酶解；若步骤d为样品酶解步骤中的第一步，步骤d将步骤(2)得到的混合物的pH值调节至7.0-8.0，加入胰蛋白酶，酶解； (4)样品分离:将步骤(3)经样品酶解后得到的混合物，进行离心分离，取离心后的上清液过0.22 μ m水系膜待测； (5)上机测定:对步骤(3)和(4)中过水系膜后的酶解液采用高效液相色谱法与氢化物发生-原子荧光光谱法联用上机测定样品中的砸形态。2.根据权利要求1所述的富砸螺旋藻中砸形态测定的方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)样品的前处理:取经过研磨的富砸螺旋藻干样，加入缓冲液进行超声提取； (2)样品破壁酶解:对步骤(1)经过前处理的混合物，调节pH值至5-7，然后向其中加入溶菌酶，酶解； (3)样品酶解，包括以下步骤: a.将步骤(2)得到的混合物的pH值调节至7.5，加入蛋白酶K，酶解， b.将步骤a酶解后的混合物进行离心分离，取离心后的上清液过0.22 μπι水系膜待测，将离心后的沉淀部分继续加入缓冲液，调节pH值至7.5，加入蛋白酶XIV，酶解， c.将上一步酶解后的混合物进行离心分离，取离心后的上清液过0.22 μπι水系膜待测，将离心后的沉淀部分继续加入缓冲液，调节pH值至1.5-2.5，加入胃蛋白酶，酶解， d.将上一步酶解后的混合物进行离心分离，取离心后的上清液过0.22 μ m水系膜待测，将离心后的沉淀部分继续加入缓冲液，调节pH值至7.0-8.0，加入胰蛋白酶，酶解， (4)样品分离:将步骤(3)经样品酶解后得到的混合物，进行离心分离，取离心后的上清液过0.22 μ m水系膜待测； (5)上机测定:对步骤(3)和(4)中过水系膜后的酶解液采用高效液相色谱法与氢化物发生-原子荧光光谱法联用上机测定样品中的砸形态。3.根据权利要求1或2所述的富砸螺旋藻中砸形态测定的方法，其特征在于，所述缓冲液为磷酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液，浓度为0.1-0.2mol/L04.根据权利要求1或2所述的富砸螺旋藻中砸形态测定的方法，其特征在于，步骤(1)中所述富砸螺旋藻干样与缓冲液的质量体积比为0.1-0.2g:5mL。5.权利要求1或2所述的富砸螺旋藻中砸形态测定的方法，其特征在于，步骤(2)中溶菌酶与所述富砸螺旋藻干样的质量比为100~200:10-50,酶解温度为30-50°C，酶解时间为12?18h06.根据权利要求1或2所述的富砸螺旋藻中砸形态测定的方法，其特征在于，步骤(3)中蛋白酶K与所述富砸螺旋藻干样的质量比为20~50: 100-200, 37°C恒温酶解18~24h。7.根据权利要求1或2所述的富砸螺旋藻中砸形态测定的方法，其特征在于，步骤(3)中蛋白酶XIV与所述富砸螺旋藻干样的质量比为20~50: 100-200, 37°C恒温酶解18~24h。8.根据权利要求1或2所述的富砸螺旋藻中砸形态测定的方法，其特征在于，步骤(3)中胃蛋白酶与所述富砸螺旋藻干样的质量比为20~50: 100~200，37°C恒温酶解18~24h。9.根据权利要求1或2所述的富砸螺旋藻中砸形态测定的方法，其特征在于，步骤(3)中胰蛋白酶与所述富砸螺旋藻干样的质量比为20~50: 100~200，37°C恒温酶解18~24h。10.根据权利要求1或2所述的富砸螺旋藻中砸形态测定的方法，其特征在于，所述富砸螺旋藻样品是指经过液体培养得到的富砸螺旋藻，总砸含量在10?1000 mg/kg (DW)范围内。
【专利摘要】本发明公开了一种富硒螺旋藻中硒形态测定的方法，其通过对富硒螺旋藻样品利用溶菌酶进行破壁处理，然后利用处理过的样品，采用分步连续提取的方式进行酶解，然后将各步酶促反应得到的酶解液过膜后利用HPLC-HG-AFS上机测定硒形态。采用本法对富硒螺旋藻样品测定硒形态，其提取率高，且样品本身的硒形态稳定，反应过程中不会出现硒形态的变化。
【IPC分类】G01N30/88, G01N30/06
【公开号】CN105259284
【申请号】CN201510656830
【发明人】尹雪斌, 袁林喜, 侯遇珠
【申请人】中国科学技术大学苏州研究院
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年10月12日