质；分装，于_20°C保存备用。
[0022]抗玉米赤霉稀酮单克隆抗体的制备:
(1)动物免疫
将步骤2得到的免疫原注入Balb/c小鼠体内，免疫剂量为160 μ g/只，使其产生抗血清。
[0023](2)细胞融合和克隆化
取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按8:1 (数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并发现，其中一株效价显著高于其它杂交瘤细胞株，将该抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体杂交瘤细胞株进行亚克隆化，并进行扩增，以备冻存保存。
[0024](3)细胞冻存和复苏
将杂交瘤细胞用冻存液制成1 X 106个/mL的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37°C水浴中速融，尚心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
[0025](4)单克隆抗体的制备与纯化
增量培养法:将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37°C条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20°C保存。
[0026]所述细胞培养基为向RPMI1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20%(质量分数)，碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为0.2%(质量分数)；所述细胞培养基的pH为7.4。
[0027]5、羊抗鼠抗抗体的制备
以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。
[0028]6、抗玉米赤霉稀酮单克隆抗体-胶体金标记物的制备 (1)胶体金的制备
用双蒸去离子水将1%氯金酸稀释成0.01% (质量分数)，取120ml置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入2.5mll%柠檬酸三钠，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4°C保存。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。
[0029](2)抗玉米赤霉稀酮单克隆抗体-胶体金标记物的制备
在磁力搅拌下，用0.2mol/L碳酸钾溶液调胶体金的pH值至7.0，按每毫升胶体金溶液中加入20?50 μ g的标准向胶体金溶液中加入抗玉米赤霉稀酮单克隆抗体，继续搅拌混匀30min，加入10%BSA，使其在胶体金溶液中的终浓度为1% (体积分数)，静置lOmin。12000r/min、4°C离心40min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4°C备用。
[0030]复溶缓冲液:含酪蛋白0.02%?0.1% (质量分数)、吐温-800.05%?0.2% (质量分数)、pH7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液。
[0031]7、结合物释放垫的制备
将结合物释放垫浸泡于含有牛血清白蛋白(牛血清白蛋白在缓冲液中的浓度为0.5%)、pH为7.2,0.5mol/L的磷酸盐缓冲液中，均匀浸湿lh，37°C烘3h备用。用Isoflow喷膜仪将制备好的抗玉米赤霉稀酮单克隆抗体-胶体金标记物均勾喷涂在结合物释放垫上，每1cm结合物释放垫喷涂0.01ml抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体-胶体金标记物后，置于37°C环境中(湿度< 20%) 60min后取出，置于干燥环境(湿度< 20%)中保存备用。
[0032]8、反应膜的制备
将玉米赤霉烯酮半抗原-卵清蛋白偶联物包被到反应膜上构成检测线，将羊抗鼠抗抗体包被在反应膜上构成质控线。
[0033]包被过程:用磷酸缓冲液将玉米赤霉烯酮半抗原-卵清蛋白偶联物稀释到10mg/ml，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线(T线)，包被量为0.8 μ 1/cm ;用0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠抗抗体稀释到200 μ g/ml，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线(C线)，包被量为1.0 μ 1/cmo将包被好的反应膜置于37°C条件下干燥2h，备用。
[0034]9、样品吸收垫的制备
将样品吸收垫置于含0.5%牛血清白蛋白(体积分数)、pH7.2,0.lmol/L磷酸盐缓冲液中浸泡2h，37°C烘2h备用。
[0035]10、试纸条的组装
将样品吸收垫1、胶体金结合物释放垫2、硝酸纤维素膜3、吸水垫4依次按顺序粘贴在背衬5上；胶体金结合物释放垫2从起始端有1/3区域被样品吸收垫1覆盖，胶体金结合物释放垫2的末端与硝酸纤维素膜3的始端连接，硝酸纤维素膜3的末端与吸水垫4的始端相连，样品吸收垫1的始端与背衬5的始端对齐，吸水垫4的末端与背衬5的末端对齐；所述硝酸纤维素膜3上有检测线6和质控线7，检测线6和质控线7均为与所述试纸条的长相垂直的条状带；检测线6位于靠近胶体金结合物释放垫2的末端的一侧；质控线7位于远离胶体金结合物释放垫2的末端的一侧；将试纸条用机器切成3_宽的小条，装在特制的塑料制卡中，4?30°C条件下可保存12个月。
[0036]本发明的试纸板具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点，操作简单、快速、安全，将反应所需的大部分原料整合到pvc背衬中，滴样后，抗原抗体反应在固相膜上快速进行，大大缩短检样时间，且样品无需特殊处理，成本低，易推广，生产成本低廉，投资少，收效快。
[0037]上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下作出各种变化。
【主权项】
1.一种检测玉米赤霉烯酮的试纸板，包括底板、背衬(5)和盖板，其特征在于，所述背衬(5)上依次紧密粘贴的样品吸收垫(1)、胶体金结合物释放垫(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸水垫(4)，所述样品吸收垫(1)、胶体金结合物释放垫(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸水垫(4)的相邻各部分间有1-2 mm的重叠，所述胶体金结合物释放垫(2)包被胶体金标记的抗体，所述硝酸纤维素膜(3)上具有检测线(6)和质控线(7)。2.根据权利要求1所述的检测玉米赤霉烯酮的试纸板，其特征在于，所述底板、背衬(5)和盖板由上而下依次压制为一体。3.根据权利要求1所述的检测玉米赤霉烯酮的试纸板，其特征在于，所述胶体金标记的抗体为玉米赤霉稀酮单克隆抗体。4.根据权利要求1所述的检测玉米赤霉烯酮的试纸板，其特征在于，所述检测线(6)包被玉米赤霉烯酮-BSA特异性结合抗原，所述质控线(7)包被羊抗鼠多克隆抗体。5.根据权利要求1所述的检测玉米赤霉烯酮的试纸板，其特征在于，所述胶体金结合物释放垫(2)的1/3-1/2被覆盖于样品吸收垫(1)下。6.一种如权利要求1-6任一所述检测玉米赤霉烯酮的试纸板的制备方法，其特征在于，具体步骤如下: 1)制备喷涂有胶体金标记的抗体的结合物释放垫(2)； 2)制备具有包被有玉米赤霉烯酮-BSA特异性结合抗原的检测线(6)和包被有羊抗鼠多克隆抗体的质控线(7)的硝酸纤维素膜(3); 3)将制备好的胶体金结合物释放垫(2)、硝酸纤维素膜(3)与样品吸收垫(1)、吸水垫(4 )、底板和盖板组装成试纸板。
【专利摘要】本发明公开了一种检测玉米赤霉烯酮的试纸板，包括底板、背衬和盖板，背衬上依次紧密粘贴的样品吸收垫、胶体金结合物释放垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，样品吸收垫、胶体金结合物释放垫、硝酸纤维素膜和吸水垫的相邻各部分间有1-2mm的重叠，胶体金结合物释放垫包被胶体金标记的抗体，硝酸纤维素膜上具有检测线和质控线。本发明的试纸板具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点，操作简单、快速、安全，将反应所需的大部分原料整合到PVC背衬中，滴样后，抗原抗体反应在固相膜上快速进行，大大缩短检样时间，且样品无需特殊处理，成本低，易推广，生产成本低廉，投资少，收效快。
【IPC分类】G01N33/543
【公开号】CN105319357
【申请号】CN201510776015
【发明人】赵春城, 李秀秀, 丁霜霜, 徐静, 李俊丽, 单金莲
【申请人】无锡艾科瑞思产品设计与研究有限公司
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2015年11月13日