步骤四，待滴涂的血红蛋白溶液干燥后，用二次蒸馏水将带有血红蛋白修饰的碳布表面浸洗2-3次，除去未固定的蛋白质，即得到基于磷化物/血红蛋白修饰的碳布，最后使用薄铝片作为导电线接触面应将薄铝片对折包裹在磷化物/血红蛋白修饰的碳布的一端制备磷化物/血红蛋白修饰的碳布电极(以下简称CC/CoP/Hb)。
[0041]使用时，CC/CoP/Hb电极不需要在称量纸上打磨光滑。当(CC/CoP/Hb电极不使用或测试结束后，均浸没在磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH = 7.0浓度为0.10M)中，4°C冰箱中保存。
[0042]本实施例中所使用的仪器和原料:
[0043]CHI832电化学工作站(上海辰华仪器公司)、电子分析天平(沈阳龙腾电子称量仪器有限公司)、pH计(北京大学化学系)、超声清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)、六水合硝酸钴(成都市科龙化工试剂厂)、氟化铵(郑州派尼化学试剂厂)、尿素(郑州派尼化学试剂厂)、次亚磷酸钠(广东光华科技股份有限公司)、碳布(上海河森电气有限公司)、30%过氧化氢(郑州派尼化学试剂厂，分析纯)、血红蛋白(Myoglobin Mb上海酶联生物科技有限公司)、磷酸二氢钾(郑州派尼化学试剂厂)、磷酸氢二钾(西安化学试剂厂)、1_ 丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体([BMH0BF4，IL，中科院兰州化学物理研究所)。测定时所用底液浓度为0.10M的PBS缓冲溶液，由0.10M的K2HP0jP KH 2P04储备液配制而成，其pH通过0.10M的H3P<VFP NaOH溶液调节。所用水为二次蒸馈水。
[0044]实施例1:
[0045]图1为不同电极在0.1M pH 7.0 PBS溶液中的循环伏安曲线。由图可以看出，CC和CoP/CC(curve a)在扫描范围内无氧化还原峰出现，说明电极表面未发生氧化还原反应。但随着Hb直接固定在的CC上，修饰电极的背景电流增大。在Hb-CC电极(curve b)上有一个极弱的还原峰出现，说明Hb在CC电极表面氧化还原反应很难进行。在Hb/CoP/CC (curve d)上，有一对的可逆的氧化还原峰，这说明Hb在CoP/CC电极表面电子转移速率升高，Hb的在电极表面形成了一层具有电化学活性的分子膜，一定程度上促进了电极表面电子的传递。Hb/CoP/CC上有一对可逆的氧化还原峰，还原峰电位(EP,J为-0.451V，氧化峰电位(Ep,a)_0.281V，式电位(E°’为(Ep,a+Ep,c)/2)为-0.366V, iPiC/iPi3= 2.78。
[0046]实施例2:
[0047]图2是K3Fe (CN) 6/K4Fe (CN) 6在CC及其修饰电极的循环伏安图。其中a为CC电极K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6氧化还原峰的曲线，相比其它电极具有较小的阻抗值。当将CoP生长在CC电极表面后，修饰电极表面的电子传递阻抗降低(曲线b)。这说明CoP良好的导电性可以促进电子在电极表面的传递，同时也说明CoP生长在CC表面，形成CC/CoP电极。然而在其上继续修饰Hb后(曲线c)，对于CC/Hb修饰电极，阻抗相对CC有所增大，表明Hb膜阻碍了铁氰化钾的电子转移，也表明Hb成功修饰到基体电极表面。
[0048]实施例3:
[0049]图3是考察了 CC/CoP/Hb电极在不同扫速下(0.1-1.0V s1)的循环伏安曲线。如图4所示，从图中可知随着扫描速度的增加，氧化还原峰电流也在不断地增加，在100-1000mV.s 1范围内，随着扫描速度的增加，还原峰电位负移，氧化峰电位正移。不同扫速下氧化峰与还原峰峰电流几乎峰形对称，峰高相等，并且峰电流大小与扫描速率呈线性关系，线性方程分别为氧化峰:iPi a = 0.95v-0.37 (R = 0.997)，还原峰:i Pi c=-1.2433v-0.085 (R = 0.998)。上述现象说明Hb在CC/CoP/Hb电极上的反应为表面控制过程，蛋白质被成功的固定在电极表面。
[0050]实施例4:[0051 ] 图4是修饰电极Hb/CoP/CC对H202的i_t图。使用电化学工作站对Η 202在修饰电极Hb/CoP/CC上的催化性能进行了研究。实验采用三电极体系，饱和甘汞电极做参比，Pt电极为对电极，Hb/CoP/CC修饰电极作为工作电极。采用计时电流法考察了 Hb/CoP/CC修饰电极对底物H202的电化学催化行为，选择工作电压为-0.35V，待背景电流稳定后，连续向浓度为0.10M、pH 7.0的PBS底液中添加H202溶液，测试结果表明，电流随着过氧化氢(H 202)浓度的增大而增大，并且响应时间短，均在10s内达到稳定，同时也说明修饰电极Hb/CoP/CC对H202的还原有良好的电催化作用。实验结果表明，固定在CoP/CC复合材料中的Hb不仅可以进行有效的电子转移，而且还保持其对H202还原的生物电催化活性。
[0052]实验中响应电流(Iss)与比02浓度(c)在2 μΜ?2670 μΜ范围内呈良好的线性关系，满足线性回归方程0.0562c ( μ Μ) +114.18 (R = 0.9987)，灵敏度为56.2 μ A/mM。信噪比为3时，可得该修饰电极Hb/CoP/CC对H202的检出限为0.67 μ Μ。
【主权项】
1.一种基于磷化钴/血红蛋白修饰的碳布电极的制备方法，其特征在于:该方法包括以下步骤: 步骤一，以硝酸钴、氟化铵和尿素溶解成混合水溶液，将碳布浸入混合水溶液中，加热反应，干燥后得到磷化钴/碳布的前躯体； 步骤二，将磷化钴/碳布的前躯体和次亚磷酸氢钠放在瓷舟的两端，在通有氮气的管式炉中加热，法制备得到碳布/磷化钴； 步骤三，在碳布/磷化钴电极表面滴涂一层血红蛋白溶液，冷干燥后得到带有血红蛋白修饰的碳布； 步骤四，将带有血红蛋白修饰的碳布表面浸洗，即得到基于磷化物/血红蛋白修饰的碳布，最后使用薄铝片作为导电线接触面制备磷化物/血红蛋白修饰的碳布电极。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于:所述的步骤一中，硝酸钴、氟化铵和尿素的质量比为12:7:12，加热温度为120°C。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于:所述的步骤二中，加热温度为600°C。4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于:所述的步骤三中，血红蛋白溶液的浓度为25mg/mL，滴涂量为10 μ L。5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于:该方法具体包括以下步骤: 步骤一，分别称取0.6g硝酸钴，0.35g氟化铵和0.6g尿素溶解到40mL去离子水中，在室温下剧烈搅拌30min，制得混合水溶液； 将混合水溶液转移到50mL Teflon不锈钢水热釜中，将3 X 4cm的碳布浸入水热釜内衬中。最终将水热釜放在温度为120°C的烘箱中加热6h。最后，将水热釜中的碳布用水冲洗，60 °C真空干燥后得到磷化钴/碳布的前躯体； 步骤二，将磷化钴/碳布的前躯体和1.0g次亚磷酸氢钠分别放在瓷舟的两端，在通有氮气的管式炉中300°C加热，其中次亚磷酸氢钠放在气流的上方，lh后在氮气气氛中冷却至室温，得到碳布/磷化钴； 步骤三，在碳布/磷化钴电极表面滴涂一层血红蛋白溶液，所述的血红蛋白溶液的浓度为25mg/mL，滴涂量为10 μ L，在冰箱中进行冷干燥，干燥时间为3h，得到带有血红蛋白修饰的碳布； 步骤四，待滴涂的血红蛋白溶液干燥后，用二次蒸馏水将带有血红蛋白修饰的碳布表面浸洗2-3次，除去未固定的蛋白质，即得到基于磷化物/血红蛋白修饰的碳布，最后使用薄铝片作为导电线接触面制备磷化物/血红蛋白修饰的碳布电极。6.如权利要求1至5任一权利要求所述的制备方法，其特征在于:所述的碳布使用之前需要将碳布依次在丙酮，去离子水和乙醇中分别超声清洗5min。7.如权利要求1至5任一权利要求所述的制备方法，其特征在于:所述的血红蛋白溶液的溶剂为磷酸盐缓冲溶液，磷酸盐缓冲溶液的pH = 7.0，浓度为0.ΙΟΜο8.如权利要求1至5任一权利要求所述的制备方法，其特征在于:所述的薄铝片作为导电线接触面时将薄铝片对折包裹在磷化物/血红蛋白修饰的碳布的一端。
【专利摘要】本发明提供了一种基于磷化钴/血红蛋白修饰的碳布电极的制备方法，以硝酸钴、氟化铵和尿素溶解成混合水溶液，将碳布浸入混合水溶液中，加热反应，干燥后得到磷化钴/碳布的前躯体；将磷化钴/碳布的前躯体和次亚磷酸氢钠放在瓷舟的两端，在通有氮气的管式炉中加热，法制备得到碳布/磷化钴；在碳布/磷化钴电极表面滴涂一层血红蛋白溶液，冷干燥后得到带有血红蛋白修饰的碳布；将带有血红蛋白修饰的碳布表面浸洗，即得到基于磷化物/血红蛋白修饰的碳布，最后使用薄铝片作为导电线接触面制备磷化物/血红蛋白修饰的碳布电极。该电极可用于H2O2的检测，其响应时间短、灵敏度高，对H2O2的检测线性范围为2μM～2670μM，且可重复使用。
【IPC分类】G01N27/327
【公开号】CN105403606
【申请号】CN201510760089
【发明人】董社英, 杨强旭, 刘丹, 黄廷林
【申请人】西安建筑科技大学
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2015年11月10日