一种同时测定果实或果酒中的有机酸和可溶性糖的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于果实或果酒中的检测领域，具体涉及一种同时测定果实或果酒中的有 机酸和可溶性糖的方法。
【背景技术】
[0002] 果实中的可溶性糖和有机酸含量是果实品质形成的重要基础，与其风味品质密切 相关，在果实的生物发育过程中不断变化，与果实中糖酸及其他物质的代谢、运转、合成及 转化等有密切的关系。果实糖酸的种类、含量及其动态变化也是目前高品质生产的研究热 点之一。近年来在柑橘、苹果、李、杏等主要果树上的相关研究已有报道。
[0003] 有机酸的测定方法有离子色谱法、毛细管电泳法、气相色谱法等。离子色谱法一般 要用稀强酸做淋洗液，对仪器会造成一定的腐蚀；毛细管电泳法分离度较高，但重复性不 好，精密度不高，所测的有机酸含量不准确;气相色谱法需要对难挥发的有机酸进行衍生化 处理，步骤繁冗。高效液相色谱是目前普遍采用的测定有机酸的方法，该方法简单、便捷、精 密度高，克服了以上的方法的不足。由于糖在紫外和可见光区没有吸收，因此采用高效液相 色谱法测定糖时，为了提高分析灵敏度，需经适当方法衍生后用UV或DAD检测。
[0004] 示差折光检测器(Refractive Index Detector，RID)是一种高度稳定和灵敏的液 相色谱和凝胶色谱用检测器。其原理是通过比较折光率的变化来检测流动相的样品峰。对 于只有紫外末端吸收的物质，用紫外检测灵敏度相对较低，同时易发生基线漂移，而用示差 折光检测器可取得较为理想的结果，如聚合物、糖、有机酸等。示差折光检测法(RID)分析 糖，样品毋需衍生，方法快速、直接，但RID无法进行梯度洗脱，检测灵敏度低。通用性质量浓 度型检测器(ELSD)对没有紫外吸收、荧光或电活性的物质以及产生末端紫外吸收的物质均 能产生响应，适于低含量糖类测定。如闫建荣掣采用ELSD2000蒸发光散射检测器-高效液相 色谱测定了鱼腥草中的果糖、葡萄糖、甘露糖等八种糖。
[0005] 现有技术中大多数是利用不同的色谱柱和前处理分别进行糖和酸的测定，还未出 现能够采用高效液相色谱DAD检测器串联示差检测器同时测定水果中的12个有机酸(草酸、 柠檬酸、酒石酸、奎尼酸、琥珀酸、苹果酸、富马酸、乙酸、丙酸、异丙酸、丁酸、苯甲酸)和3种 糖(果糖、蔗糖、葡萄糖)的相关文献或报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种同时测定果实或果酒中的有机 酸和可溶性糖的方法。本发明采用高效液相色谱DAD检测器-串联示差检测器能同时测定水 果中12种有机酸(分别为:草酸、柠檬酸、酒石酸、奎尼酸、琥珀酸、苹果酸、富马酸、乙酸、丙 酸、异丙酸、丁酸、苯甲酸)和3种糖(果糖、蔗糖、葡萄糖），操作简单快捷。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 一种同时测定果实或果酒中的有机酸和可溶性糖的方法，包括如下步骤： (1)标准样品溶液的制备 分别称取色谱纯的草酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、苹果酸、奎尼酸、富马酸、乙酸、丙酸、 异丁酸、丁酸、苯甲酸（12种有机酸），葡萄糖、果糖、蔗糖(3种糖），然会用流动相水相制备该 12种有机酸标准品不同浓度梯度在0.01-1 mg/mL的标准样品溶液、3种糖组分不同浓度梯 度在0.1-75 mg/mL的标准样品溶液； (2) 待测液的制备 鲜样的制备:称取10 g鲜样置于组织捣碎机中，并加入100 ml 80 wt%乙醇溶液匀浆1 min，取10 ml的勾衆以3000 rpm/min离心10 min后分出上清液，将上清液转入50 mL容量瓶 中，且离心的残渣再用80 wt%乙醇溶液洗涤两次，每次15 ml，离心10 min;合并上清液，用 80 wt %乙醇溶液定容混匀得提取液;取5.00 mL提取液于蒸发皿中，且于70 °C下恒温水浴 蒸发乙醇，蒸发获得的残留物用重蒸水定容到10 mL混匀得样液，将该样液过0.45 μπι滤膜 得待测液； 干样的制备:称2~3 g干样并研磨过60目，接着以80 wt%乙醇溶液为溶剂，于80 °C下 恒温水浴浸提30 min，并离心收集提取液，然后将提取液蒸干，蒸干获得的物质采用2 ml超 纯水溶解得样液，将该样液过0.45 μπι滤膜即获待测液； (3) 使用包括四元栗、柱温箱、DAD检测器/示差检测器以及工作站所组成的HPLC仪器， 在氢离子交换柱上，以乙腈-硫酸溶液为流动相等度洗脱分离各种有机酸，色谱条件如下： 分析柱：氢离子交换柱； 流动相:水相A: 0 · 001 mol/L-0 ·005 mol/L的硫酸溶液;有机相B:乙腈;且A的体积百分 比为100-96%，B的体积百分比为为0-4%; 流速:0.3-0.5 mL/min； 洗脱方式:等度洗脱； 检测波长：190 nm-280 nm; 温度：25-50 °C; 进样体积:5-20 yL; 检测时间:55 min; (4) 测定:分别取步骤（1)制备的标准样品溶液及步骤(2)制备的待测液，采用步骤(3) 的色谱条件进行进样检测，之后采用外标法定量分析计算水果中10种有机酸及3种糖的含 量。
[0008]步骤(3)中所述的氢离子交换柱为Rezex ROA-Organic Acid H+ New Column 250 X4.6 mm〇
[0009]所述的果实包括枇杷、葡萄、香蜜果、五味子、柑橘中的一种；所述的果酒为葡萄 酒。
[0010]本发明的有益效果在于： 本发明提供了一种同时测定果实或果酒中12种有机酸和3种糖组份含量的高效液相色 谱法，具有操作简单快捷的特点。
【附图说明】
[0011]图1是本发明标准样品溶液的高效液相色谱图；1-草酸，2-梓檬酸，3-酒石酸，4-苹果酸，5-琥珀酸，6-富马酸，7-乙酸，8-奎尼酸，9-丙酸，10-异丁酸，11-丁酸； 图2是本发明的示差检测器糖组份标准品图；13-葡萄糖，14-蔗糖，15-果糖； 图3是茂谷橘橙幼果果肉的高效液相色谱图。
【具体实施方式】
[0012] 本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实 施例。
[0013] 表1 12种有机酸、可溶性糖的标准曲线回归方程、相关系数、线性下限
实施例1 1.葡萄果酒和柑橘、枇杷果肉中的有机酸和可溶性糖测定 1材料与方法 1.1材料与试剂 草酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸、富马酸、乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸等有机酸购自 Sigma公司。
[0014] 1.2仪器与设备 L-2000型高效液相色谱仪（日本日立公司），配有二极管阵列检测器(DAD)、四元栗、柱 温箱、自动进样器等;Sartorius BS224S分析天平(德国赛多利斯）;FW100高速万能粉碎机 (天津泰斯特仪器有限公司）;ALLEGRATM64R高速冷冻离心机(美国BECKMAN公司）。
[0015] 1.3试验方法 1.3.1标准曲线的绘制 准确称取标准样品用80 wt%乙醇配制成1 mg/mL的标准液，用逐级稀释法配成不同浓 度的混合标样，_20°C保存备用； 1.3.2样品前处理 2 g冻干果实样品-20 mL80 wt%乙醇研磨-80 °C水浴30 min浸提-3000 rpm/min离 心10 min分出上清液-重复四次-收集提取液-蒸干-2 mL超纯水溶解，将样液过0.45 μ m滤膜，供液相色谱分析使用； 100 mL果酒样品（酒)减压浓缩-冻干-10 mL80 wt%乙醇溶解-定容-将样液过0.45 ym滤膜，供液相色谱