一种快速检测腈水解酶活性的方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于生物化学分析领域，涉及一种腈水解酶，具体来说是一种快速检测腈 水解酶活性的方法。
【背景技术】
[0002] 腈水解酶是一类非常重要的水解酶，它可直接将腈类物质水解为羧酸或胺，参与 多种生物体内重要物质的生物合成。此外，腈水解酶可作为一种生物催化剂，在羧酸及其衍 生物的不对称合成中占有重要的作用。
[0003] 过去几十年中，许多测定腈水解酶活性的方法被开发出来，包括高效液相色谱法、 气相色谱法和毛细管电泳等。但这些方法操作过程复杂，而且耗时较长(Appl Environ Microbiol，2007，73(19): 6053-6057)。在筛选腈水解酶的传统方法中，薄板层析法方法简 单快速，但是通量较低（Int J Biochem, 1985,17(6) :677-683) JeSantis等报道一种金属 基方法能检测浓度小于5.OmM的产物，然而这种方法不能应用于含有蛋白质等复杂体系中 臆水解酶活力的测定（J Am Chem 3〇(3,2002，124(31):9024-9025)。3&]11:〇 shkumar等用平 板法测定产酶菌株催化脂肪族腈反应中释放出氨所导致的pH变化，由于体系中有缓冲溶 液，反应中生成的弱酸或弱碱对pH变化影响小，因此该检测方法的灵敏性有待提高(J Ind Microbiol Biotechnol，2010，37( 1): 111-115)。拖等人在高氯酸羟胺和DCC存在条件下，用 高氯酸铁作为显色剂，测定了有机酸含量。然而，高氯酸羟胺在市场上很难买到，需要自己 制备合成，其制备过程繁琐，安全性低，而且高氯酸铁价格昂贵（Appl Microbiol Biotechnol.2011,89(3),817-823.)〇
【发明内容】
[0004] 针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种快速检测腈水解酶活性的方 法，所述的这种快速检测腈水解酶活性的方法解决了现有技术中检测腈水解酶活性的方法 通量低、灵敏度不高的技术问题。
[0005] 本发明提供了一种快速检测腈水解酶活性的方法，首先利用腈水解酶催化腈类化 合物发生水解反应，水解产物经终止反应、稀释后，加入含有盐酸羟胺和二环己基碳二亚胺 (DCC)的乙醇溶液，震荡混均，水浴加热后加入三氯化铁的乙醇溶液，待充分反应后，用紫外 分光光度计测定520nm处的吸光度值，根据吸光度值的大小可计算出腈水解酶活性的大小。
[0006] 进一步的，所述的腈类化合物为扁桃腈、烟腈、苯甲腈、1-氰基-环己基乙腈或乙 腈。结构式如下所述：
[0007]
[0008] 本发明还提供了上述的一种快速检测腈水解酶活性的方法，包括如下步骤：
[0009] 1)-个利用腈水解酶催化水解腈类化合物的步骤;采用磷酸盐缓冲溶液重新悬浮 静息细胞，然后加入底物腈，在摇床上转化反应；
[0010] 2)将催化水解腈类化合物的样品进行处理的步骤;将步骤1)的反应样品用甲醇终 止反应，离心，得上清，上清再用双蒸水稀释4~6倍，即为转化反应后的样品；
[0011] a)向步骤2)所得的反应样品中加入三倍体积的盐酸羟胺的乙醇溶液，所述的盐酸 羟胺乙醇溶液的浓度为1~9mM，接着加入样品体积五分之一体积的DCC的乙醇溶液，DCC的 乙醇溶液的浓度为〇. 2M;将该混合液震荡混匀，恒温加热，温度范围为20~80°C，加热10~ 40min，水浴完成后接着加入样品体积二十分之一体积的三氯化铁溶液的乙醇溶液，所述的 三氯化铁溶液的乙醇溶液的浓度为0.1~1.0M，显色反应lOmin，用紫外分光光度计测定 520nm处的吸光度值，根据吸光度值的大小可计算出腈水解酶活性的大小。
[0012]进一步的，所述的盐酸羟胺乙醇溶液的浓度为4禮。
[0013]进一步的，所述的恒温加热条件为60°C。
[0014] 进一步的，所述的三氯化铁溶液的乙醇溶液的浓度为0.5M。
[0015] 本发明还提供了上述的一种快速检测腈水解酶活性的方法，包括如下步骤：
[0016] 1) 一个利用腈水解酶催化水解腈类化合物的步骤;采用0.1M的磷酸盐缓冲溶液重 新悬浮静息细胞，使得静息细胞的浓度为l〇g/L，然后加入底物腈，使得底物腈的终浓度为 50mM，然后在摇床上转化反应；
[0017] 2)将催化水解腈类化合物的样品进行处理的步骤;将步骤1)的反应样品用甲醇终 止反应，离心，得上清，上清再用双蒸水稀释4~6倍，即为转化反应后的样品；
[0018] 3)向lmL步骤2)所得的反应样品中加入3倍体积的盐酸羟胺的乙醇溶液，所述的盐 酸羟胺乙醇溶液的浓度为1~9mM，接着加入DCC的乙醇溶液0.2mL，DCC的乙醇溶液的浓度为 0.2M;将该混合液震荡混匀，恒温加热，温度范围为20~80°C，加热10~40min，水浴完成后 接着加入〇 . 〇5mL三氯化铁溶液的乙醇溶液，所述的三氯化铁溶液的乙醇溶液的浓度为0.1 ~1.0M，显色反应lOmin，用紫外分光光度计测定520nm处的吸光度值，根据吸光度值的大小 可计算出腈水解酶活性的大小。
[0019] 本发明是一种利用羟聘酸铁比色法快速检测腈水解酶活性的方法，是以羟聘酸铁 比色法来检测腈水解酶水解腈类化合物产生有机酸的含量，进而获得腈水解酶活性的数 据。本发明利用含有腈水解酶基因的大肠杆菌静息细胞催化腈类化合物发生水解反应，水 解产物经适当处理后加入盐酸羟胺和N，N'_二环己基碳化二亚胺(DCC)的乙醇溶液，震荡混 均，水浴加热后加入三氯化铁的乙醇溶液，待充分反应后，即可得到体系均一且稳定的紫红 色羟肟酸铁络合物，用紫外分光光度计测定520nm处的吸光度值，根据吸光度值的大小可计 算出酶活性的大小。测定得到相对标准偏差（RSD)和回收率分别是1 %~2 %和99 %~ 105%，且其结果与HPLC法测定实验结果一致，说明此法操作简单，快速，安全，廉价，精确。
[0020]本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明以盐酸羟胺替代高氯酸羟 胺，三氯化铁替代高氯酸铁，所需的设备简单，操作过程简单，原料来源都已商品化容易得 至|J，价格廉价，安全性高。与目前所用的测定腈水解酶活性的基本方法-HPLC法相比较，检测 速度快，在腈水解酶的快速筛选及高通量筛选中有巨大的应用潜力，是一种腈水解酶活性 高通量筛选的方法。
【附图说明】
[0021 ]图1为羟肟酸铁比色法测定腈水解酶水解不同腈类化合物的活性。
【具体实施方式】
[0022]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0023]实施例1腈水解酶反应过程及样品处理
[0024]将50mg含有腈水解酶基因的大肠杆菌静息细胞重悬于5mL 0.1M磷酸盐缓冲溶液， 并加入适量1-氰基-环己基乙腈(终浓度50mM)，置于30°C、180r/min的摇床上反应8h。用甲 醇终止反应，4°C离心，得上清液，再用双蒸水稀释5倍，即为腈水解酶水解腈类化合物的样 品。
[0025]实施例2盐酸羟胺浓度优化
[0026]将稀释5倍的腈水解酶水解1-氰基-环己基乙腈的样品取lml于5ml EP管中，首先 加入3mL的盐酸羟胺的乙醇溶液，其浓度分别为ImM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM和9mM， 其次加入0.2mL DCC的乙醇溶液的，其浓度为0.2M。将该混合液震荡混均，水浴加热，在30°C 加热20min。水浴完成后接着加入0.05ml三氯化铁溶液的乙醇溶液，其浓度为0.8M，显色 lOmin后，用紫外分光光度计测定520nm处的吸光度值。结果如表1，其添加量从ImM升高到 4mM时，吸光度不断增大，继续增加其量至9mM，吸光度则不断降低。因此，其最佳添加量是 4mM〇
[0027] 表1盐酸羟胺浓度对吸光度值的影响
[0028]
[0029]实施例3三氯化铁浓度优化
[0030]将稀释5倍的腈水解酶水解1-氰基-环己基乙腈的样品取lml于5ml EP管中，首先 加入3ml的盐酸羟胺的乙醇溶液，其浓度分别为4mM，其次加入0.2ml DCC的乙醇溶液的，其 浓度为〇 . 20M。将该混合液震荡混均，水浴加热，在30°C加热20min。水浴完成后接着加入 0.05ml三氯化铁溶液的乙醇溶液，其浓度分别为0.10M、0.20M、0.30M、0.40M、0.50M、0.60M、 0.70M、0.80M、0.90M和l.OM mM，显色lOmin后，用紫外分光光度计测定520nm处的吸光度值。 结果表明，