，使单克隆抗体的终浓度为40ng/ml，再 取20μ1的人血清样品（取自苏州大学第二附属医院，并且受试者签订了捐献声明），重复取 10次，作为平行样品，同时以取等量的降钙素原标准品和生理盐水，分别作为阳性对照和负 对照，然后将所取的样品，分别加入所述单克隆抗体标记的试剂反应液中，于37°孵育3min， 得到反应物混合液；
[0051] 2)然后，取60μ1聚苯乙烯乳胶微球，先将适量的抗单克隆抗体(具体为羊抗鼠 IgG 二抗)与适量的珠子结合，然后将与抗单克隆抗体结合的珠子加入聚苯乙烯乳胶微球中，得 到交联有抗单克隆抗体的聚苯乙烯乳胶微球，使单克隆抗体的终浓度为20ng/ml，珠子的终 浓度为200ng/ml;
[0052] 3)再将反应物混合液和交联有抗单克隆抗体的聚苯乙烯乳胶微球混合反应5min， 即得。
[0053] 4)将步骤3)中反应后的混合物加入比色杯中，在日立7020全自动生化仪，于600波 长下检测。然后使用含有人血清的校准品，通过非线性计算模式，如Logit或Spline建立多 点定标校准曲线等;再以校准品浓度对相应A A作校准曲线，样品中降钙素原的浓度通过样 品的ΔΑ从校准曲线上读出。
[0054] 结果表明，上述10个人血清样品中的降钙素原的浓度为平均值为0.145ng/ml，SD 值为0.006,而现有技术中一般只能检测到降钙素原的浓度为0.3ng/ml的人血清样品，也就 是说本发明的检测试剂进行检测能够明显提高检测下限，也就是能够很大的提高相同样本 的吸光度，提高试剂盒测试的灵敏度。
[0055] 实施例3肌钙蛋白（cTnl)的检测
[0056] 1)取180μ1试剂反应液，再取适量的鼠抗人单克隆抗体(具体为hytest的货号为 Ml8的抗体），得到单克隆抗体标记的试剂反应液，使单克隆抗体的终浓度为60ng/ml，再取 25μ1的人血清样品（取自苏州大学第二附属医院，并且受试者签订了捐献声明），重复取10 次，作为平行样品，同时以取等量的肌钙蛋白标准品和生理盐水，分别作为阳性对照和负对 照，然后将所取的样品，分别加入所述单克隆抗体标记的试剂反应液中，于37°孵育3min，得 到反应物混合液；
[0057] 2)然后，取60μ1聚苯乙烯乳胶微球，先将适量的抗单克隆抗体(具体为羊抗鼠 IgG 二抗)与适量的珠子结合，然后将与抗单克隆抗体结合的珠子加入聚苯乙烯乳胶微球，使单 克隆抗体的终浓度为25ng/ml，珠子的终浓度为250ng/ml;
[0058] 3)再将反应物混合液和交联有抗单克隆抗体的聚苯乙烯乳胶微球混合反应5min， 即得。
[0059] 4)将步骤3)中反应后的混合物加入比色杯中，在日立7020全自动生化仪，于500波 长下检测。然后使用含有人血清的校准品，通过非线性计算模式，如Logit或Spline建立多 点定标校准曲线等;再以校准品浓度对相应A A作校准曲线，样品中降钙素原的浓度通过样 品的ΔΑ从校准曲线上读出。
[0060] 结果表明，上述人血清样品中的降钙素原的浓度的平均值为〇.〇llng/ml，SD值为 0.0006,而现有技术中一般只能检测到降钙素原的浓度为0.1ng/ml的人血清样品，也就是 说本发明的检测试剂进行检测能够明显提高检测下限，也就是能够很大的提高相同样本的 吸光度，提高试剂盒测试的灵敏度。
[0061] 实施例4肌钙蛋白（cTnl)的检测
[0062] 1)取180μ1试剂反应液，再取适量的鼠抗人单克隆抗体(具体为hytest的货号为 M18的抗体），得到单克隆抗体标记的试剂反应液，使单克隆抗体的终浓度为50ng/ml，再取 25μ1人血清样品（取自苏州大学第二附属医院，并且受试者签订了捐献声明），重复取三次， 作为平行样品，同时以取等量的肌钙蛋白标准品和生理盐水，分别作为阳性对照和负对照， 然后将所取的样品，分别加入所述单克隆抗体标记的试剂反应液中，于37°孵育3min，得到 反应物混合液；
[0063] 2)然后，取60μ1聚苯乙烯乳胶微球，先将适量的抗单克隆抗体(具体为羊抗鼠 IgG 二抗)与适量的珠子结合，然后将与抗单克隆抗体结合的珠子加入聚苯乙烯乳胶微球，使单 克隆抗体的终浓度为30ng/ml，珠子的终浓度为300ng/ml;
[0064] 3)再将反应物混合液和交联有抗单克隆抗体的聚苯乙烯乳胶微球混合反应5min， 即得。
[0065] 4)将步骤3)中反应后的混合物加入比色杯中，在日立7020全自动生化仪，于500波 长下检测。然后使用含有人血清的校准品，通过非线性计算模式，如Logit或Spline建立多 点定标校准曲线等;再以校准品浓度对相应A A作校准曲线，样品中降钙素原的浓度通过样 品的ΔΑ从校准曲线上读出。
[0066]结果表明，上述人血清样品中的降钙素原的浓度的平均值为0.0478ng/ml，SD值 为0.002,而现有技术中一般只能检测到降钙素原的浓度为0.1ng/ml的人血清样品，也就是 说本发明的检测试剂进行检测能够明显提高检测下限，也就是能够很大的提高相同样本的 吸光度，提高试剂盒测试的灵敏度。
[0067] 对比例1
[0068] 取含有PCT的标准品，将该标准品稀释为0 · lng/ml、0 · 2ng/ml、0 · 3ng/ml、0 · 4ng/ ml、0.5ng/ml，然后将这些稀释后的标准样品分两组，一组通过现有技术中传统的比浊检测 试剂(试剂反应液和聚苯乙烯乳胶微球)进行检测，另外一组通过本发明的比浊检测试剂进 行检测，检测步骤和加的样品量与实施例1相同，结果如下述表1所示。
[0069] 表1本发明的比浊检测试剂和传统的比浊检测试剂的对比
[0070]
[0071 ]通过上述表1可看出，相比现有技术中传统的比浊检测试剂，本发明可以使相同样 本的吸光度能够明显提升，能提高试剂盒测试的灵敏度。
[0072] 对比例2
[0073] 将上述对比例1中低浓度样本0. lng/ml增敏后进行重复性(重复10次），结果如下 述表2所示。
[0074] 表2标识浓度为0. lng/ml的样本测吸光度（Δ值)数据如下：
[0075]
[0076] 从上述表2可看出，检测发现检测十次后变异系数(CV)为4.43%在10%以内，表明 本发明的比浊检测试剂具有良好的重复性。
[0077] 综上，本发明的超敏乳胶增强免疫比浊检测试剂，在传统的试剂反应液和聚苯乙 烯乳胶微球比浊检测试剂系统中，分别增加单克隆抗体和与其特异结合的抗单克隆抗体， 单克隆抗体、抗单克隆抗体分别能够与试剂反应液和聚苯乙烯乳胶微球结合，相当于抗原 在同抗体结合中增加了凝集位点(乳胶颗粒上的单抗与其对应的二抗），这样即使抗原在浓 度很低的时候也会遇到标记的颗粒时迅速凝集，更短的时间内形成更大的免疫复合物，从 而达到了增加试剂灵敏度的效果;并且本发明的检测试剂的检测下限低，检测灵敏度高，从 而能够更准确地检测病人是否患病。
[0078]以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明 的保护范围。
【主权项】
1. 一种超敏乳胶增强免疫比浊检测试剂，包括试剂反应液和聚苯乙烯乳胶微球，所述 试剂反应液中还含有与试剂反应液结合的单克隆抗体;所述聚苯乙烯乳胶微球中还含有抗 单克隆抗体，所述抗单克隆抗体为与所述单克隆抗体特异结合的抗体，并且所述抗单克隆 抗体与所述聚苯乙烯乳胶微球交联。2. 根据权利要求1所述的超敏乳胶增强免疫比浊检测试剂，其特征在于，所述试剂反应 液中含有浓度为40~60ng/ml的单克隆抗体，优选为50ng/ml。3. 根据权利要求2所述的超敏乳胶增强免疫比浊检测试剂，其特征在于，所述聚苯乙烯 乳胶微球中还含有浓度为20~30ng/ml的抗单克隆抗体，优选为25ng/ml。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的超敏乳胶增强免疫比浊检测试剂，其特征在于， 所述聚苯乙烯乳胶微球中还含有与抗单克隆抗体结合的珠子。5. 根据权利要求4所述的超敏乳胶增强免疫比浊检测试剂，其特征在于，所述聚苯乙烯 乳胶微球中含有浓度为200~300ng/ml的珠子，优选为250ng/ml。6. 根据权利要求1至5中任一项所述的超敏乳胶增强免疫比浊检测试剂，其特征在于， 所述单克隆抗体与所述待检测样品中的抗原结合，且所述单克隆抗体与抗原结合的位点， 不与单克隆抗体与抗单克隆抗体的结合位点重复。7. 根据权利要求6所述的超敏乳胶增强免疫比浊检测试剂，其特征在于，所述抗原为降 钙素原或肌钙蛋白；优选地，当所述抗原为降钙素原时，所述比浊检测试剂的检测下限为 0· 1~0· 15ng/ml，优选为0· lng/ml，或； 当所述抗原为肌钙蛋白时，所述比浊检测试剂的检测下限为0.01~〇.〇5ng/ml，优选为 0 · 01ng/ml〇8. 根据权利要求1至7中任一项所述的超敏乳胶增强免疫比浊检测试剂的检测方法，包 括以下步骤： 1) 将适量的单克隆抗体加入试剂反应液中，得到单克隆抗体标记的试剂反应液，再将 待检测样品加入所述单克隆抗体标记的试剂反应液中，得到反应物混合液； 2) 将适量的抗单克隆抗体加入聚苯乙烯乳胶微球中，得到交联有抗单克隆抗体的聚苯 乙烯乳胶微球;优选地，将适量的抗单克隆抗体加入聚苯乙烯乳胶微球中前，还包括添加适 量的珠子与所述单克隆抗体结合的步骤； 3) 再将所述反应物混合液和所述交联有抗单克隆抗体的聚苯乙烯乳胶微球混合反应， 即得。9. 根据权利要求8所述的超敏乳胶增强免疫比浊检测试剂的检测方法，其特征在于，在 步骤3)中，将所述反应物混合液和所述交联有抗单克隆抗体的聚苯乙烯乳胶微球混合反应 4~6min，优选反应5min 〇10. 根据权利要求1至7中任一项所述的超敏乳胶增强免疫比浊检测试剂在制备用于检 测生物样品的比浊试剂盒中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种超敏乳胶增强免疫比浊检测试剂及其检测方法和应用，所述检测试剂包括试剂反应液和聚苯乙烯乳胶微球，所述试剂反应液中还含有与试剂反应液结合的单克隆抗体；所述聚苯乙烯乳胶微球中还含有抗单克隆抗体，所述抗单克隆抗体为与所述单克隆抗体特异结合的抗体，并且所述抗单克隆抗体与所述聚苯乙烯乳胶微球交联。本发明中的比浊检测试剂抗原在同抗体的结合中增加了凝集位点(乳胶颗粒上的单抗与其对应的二抗)，这样即使抗原在浓度很低的时候也会遇到标记的颗粒时迅速凝集，更短的时间内形成更大的免疫复合物，从而达到了增加试剂灵敏度的效果。
【IPC分类】G01N33/68
【公开号】CN105548557
【申请号】CN201510894878
【发明人】王滨, 贾引军, 辛杰, 吴一凡
【申请人】苏州德沃生物技术有限公司
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2015年12月8日