一种植物病毒抑制剂的快速筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于病毒抑制剂筛选技术领域，尤其涉及一种植物病毒抑制剂的快速筛选 方法。
【背景技术】
[0002] 室内常用的植物病毒抑制剂的筛选方法大多采用枯斑半叶法，其方法是将病毒接 种到两片不同的半叶并通过对比统计枯斑数量处理前后枯斑数量来确定药剂药效，但传统 方法所用时间周期长，结果不够准确可靠，有时候还会与田间药效结果不一致。而对于没有 合适枯斑寄主的植物病毒，只能对病毒系统侵染的寄主进行病害分级，然后计算植物病毒 抑制剂药效，时间周期更长且结果不稳定。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种植物病毒抑制剂的快速筛选方法，旨在为植物病毒抑 制剂研发过程中初始抗病毒评价筛选提供新的手段。
[0004] 本发明是这样实现的，一种植物病毒抑制剂的快速筛选方法，所述植物病毒抑制 剂的快速筛选方法包括：
[0005] 制备含有TMV-GFP的农杆菌菌液，取培养至5-6叶期生长健壮的本氏烟，在叶片背 面用针头打一小孔，用去掉针头的2mL针管吸取含有TMV-GFP的农杆菌重悬液，注射到叶片 内，每个注射点注射5〇-10(^1^00 6〇()为0.4-〇.8的上述菌悬液；
[0006] 注射1天后，用待评价的植物病毒抑制剂喷雾处理注射叶片，植物病毒抑制剂为 0.5 %氨基寡糖素水剂400倍液，同时，利用清水喷雾处理做对照，2天后利用UV光照射，将药 剂处理叶片和清水对照处理叶片放在同一视野中拍照，并在图片分析软件中十字交叉测叶 片荧光扩散直径，以平均值为最终数据，对比分析植物病毒抑制剂对携带GFP的TMV抑制效 果。
[0007] 进一步，所述将含有TMV-GFP的农杆菌重悬液注射到4-6叶期本氏烟叶片，具体包 括：
[0008] 从-80 °C冰箱中取出含TMV-GFP全长载体的农杆菌菌液5yL;
[0009] 将5yL菌液加入5mL含有卡那霉素和链霉素 YEP培养基中，225rpm/min，30°C，培养 12-16h；
[0010] 从5mL菌液中取lmL加入浓度为20μΜ的乙酰丁香酮5yL，加入到25mL含有卡那霉素 和链霉素 YEP培养基中225rpm/min，30 °C培养12-16h;
[0011 ] 从25mL农杆菌菌液中取2mL加入到50mL离心管中，室温5000rpm/min离心15min，弃 上清；
[0012] 将沉淀用新配置的缓冲液重悬并调节OD600值至0.6，室温静置3h;
[0013] 取培养至5-6叶期生长健壮的本氏烟，在叶片背面用针头打小孔，用去掉针头的 2mL针管吸取农杆菌悬浮液注射到叶片内，每个注射点注射30yL 0D_为0.6的菌悬液。
[0014] 进一步，所述缓冲液为 lOmL 体系，包括：MgCl2(lM)0. lmL，MES(0.5M)0.2mL，AS (lOOmM) 10yL 加灭菌水至 10mL。
[0015] 进一步，所述病毒抑制剂的处理时间必须为含有TMV-GFP的农杆菌重悬液注射1天 后，激发波长为365nm的UV光照射并拍照记录时间必须为含有TMV-GFP的农杆菌重悬液注射 3天后。
[0016] 进一步，所述含有TMV-GFP的农杆菌菌液的制备方法如下：
[0017] 从-80 °C冰箱中取出含TMV-GFP全长载体的农杆菌菌液5-1 OyL;
[0018] 将5-10yL菌液加入5-10mL含有卡那霉素和链霉素 YEP培养基中，220-250rpm/min， 28-30°C，培养 12-16h;
[0019] 从5-10mL菌液中取l-2mL加入浓度为20μΜ的乙酰丁香酮(AS)5-10yL，加入到25-50mL含有卡那霉素和链霉素 YEP培养基中220-250rpm/min，28-30 °C，培养12-16h;
[0020] 从25_50mL农杆菌菌液中取2_4mL加入到50-100mL离心管中，室温，5000rpm/min离 心15min，弃上清；
[0021] 将沉淀用新配置的缓冲液重悬并调节OD600值至0.4-0.8，室温静置3_4h;缓冲液配 方 10mL体系：取 1M的MgChO. lmL，0.5M的MES0.2mL，lOOmM的AS 10yL，其余加灭菌水至 10mL。
[0022] 本发明提供的植物病毒抑制剂的快速筛选方法，利用农杆菌注射方法使含有GFP 标记的TMV侵染性克隆在本氏烟中表达侵染，Id后利用抗病毒药剂喷雾处理注射叶片，药剂 处理2d后利用激发波长为365nm的UV光照射叶片并观察记录病毒扩散情况，通过统计病毒 扩散荧斑的大小，并对比荧光斑的大小判断植物病毒抑制剂对病毒的抑制效果，从而建立 一种新的抗病毒抑制剂快速筛选方法本方法不但可以在3-4天内直观的观察到植物病毒抑 制剂对病毒的抑制效果，从而对植物病毒抑制剂进行快速的筛选评价，节省更多的时间，获 得更准确的结果，而且本方法的结果与传统方法和田间药效测定结果具有高度的一致性。 为植物病毒抑制剂研发过程中初始抗病毒评价筛选提供新的手段。
【附图说明】
[0023] 图1是本发明实施例提供的植物病毒抑制剂的快速筛选方法流程图。
【具体实施方式】
[0024]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明 进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于 限定本发明。
[0025] 下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
[0026] 如图1所示，本发明实施例的植物病毒抑制剂的快速筛选方法包括以下步骤：
[0027] S101:将含有的TMV-GFP农杆菌菌液注射到4-6叶期本氏烟叶片；
[0028] S102:注射接种1天后，用植物病毒抑制剂(0.5%氨基寡糖素水剂400倍液)喷雾处 理注射叶片，利用清水喷雾处理作为对照，2天后利用激发波长为365nm的UV光照射并拍照。
[0029] S103:在图片分析软件中十字交叉测叶片荧光扩散直径，以平均值为最终数据，对 比分析植物病毒抑制剂对携带GFP的TMV抑制效果。
[0030] 本发明的具体步骤如下：
[0031]制备含有TMV-GFP的农杆菌菌液，取培养至5-6叶期生长健壮的本氏烟，在叶片背 面用针头打一小孔，用去掉针头的2mL针管吸取含有TMV-GFP的农杆菌重悬液，注射到叶片 内，每个注射点注射50-10(^1^00600为0.4-0.8的上述菌悬液；
[0032]注射1天后，用待评价的植物病毒抑制剂喷雾处理注射叶片，植物病毒抑制剂为 0.5 %氨基寡糖素水剂400倍液，同时，利用清水喷雾处理做对照，2天后利用UV光照射，将药 剂处理叶片和清水对照处理叶片放在同一视野中拍照，并在图片分析软件中十字交叉测叶 片荧光扩散直径，以平均值为最终数据，对比分析植物病毒抑制剂对携带GFP的TMV抑制效 果。
[0033] 所述含有TMV-GFP的农杆菌菌液的制备方法如下：
[0034] 从-80 °C冰箱中取出含TMV-GFP全长载体的农杆菌菌液5-1 OyL;
[0035] 将5-10yL菌液加入5-10mL含有卡那霉素和链霉素 YEP培养基中，220-250rpm/min， 28-30°C，培养 12-16h;
[0036] 从5-10mL菌液中取l-2mL加入浓度为20μΜ的乙酰丁香酮(AS)5-10yL，加入到25-50mL含有卡那霉素和链霉素 YEP培养基中220-250rpm/min，28-30 °C，培养12-16h;
[0037] 从25_50mL农杆菌菌液中取2_4mL加入到50-100mL离心管中，室温，5000rpm/min离 心15min，弃上清；
[0038] 将沉淀用新配置的缓冲液重悬并调节OD600值至0.4-0.8，室温静置3_4h;
[0039] 缓冲液配方l〇mL体系：取 1M的MgCl20 · lmL，0 · 5M的MES0 · 2mL，100mM的AS 10yL，其 余加灭菌水至10mL。
[0040] 下面结合与传统方法对比试验和田间试验结果对本发明的应用优势做进一步的 说明。
[0041 ] 1.1农杆菌介导注射接种，TMV-GFP评价植物病毒抑制剂方法
[0042]将含有的TMV-GFP杆菌菌液注射到4-6叶期本氏烟叶片，具体操作步骤如下：
[0043] (1)从-80 °C冰箱中取出含TMV-GFP全长载体的农杆菌菌液5yL。
[0044] (2)将5yL菌液加入5mL含有卡那霉素和链霉素 YEP培养基中，225rpm/min，30°C，培 养12-16h。
[0045] (3)从5mL菌液中取lmL加入浓度为20μΜ的乙酰丁香酮(AS) 5yL，加入到25mL含有卡 那霉素和链霉素 YEP培养基中225rpm/min，30 °C培养12-16h。
[0046] (4)从25mL农杆菌菌液中取2mL加入到50mL离心管中，室温5000rpm/min离心 15min，弃上清。
[0047] (5)将沉淀用新配置的缓冲液重悬并调节0D600值至0.6,室温静置3h。
[0048] 缓冲液配方l〇〇mL体系:MgCl2( 1M)0 · lmL，MES(0 · 5M)0 · 2mL，AS( lOOmM) 10yL加灭菌 水至10mL。
[0049] (6)取培养至5-6叶期生长健壮的本氏烟，在叶片背面用针头打一小孔，用去掉针 头的2mL针管吸取农杆菌悬浮液注射到叶片内，每个注射点注射30yL 0D6QQ为0.6的上述菌 悬液(注射时带一次性手套，防止交叉污染)1天后在注射叶片喷抗病毒药剂〇. 5 %氨基寡糖 素水剂400倍液，3天后利用UV灯观察注射点周围病毒扩散情况并拍照。另取一批苗子注射 后喷清水作对照，同样利用UV灯观察并拍照，测定病毒扩增直径，统计分析，评价植物病毒 抑制剂对病毒的