抑制效果。用已经农杆菌介导成功接种的TMV-GFP毒源汁液摩擦法接种到 4-6叶期本氏烟叶片。
[0050] 1.2汁液摩擦接种
[0051 ]摩擦接种1天后，用0.5%氨基寡糖素水剂400倍液喷雾处理注射叶片，对照利用清 水喷雾处理，2天后利用UV光照射并拍照，观察荧光斑扩散情况，评价植物病毒抑制剂对病 毒的抑制效果。
[0052] 1.3传统枯斑寄主方法评价植物病毒抑制
[0053]用实验室保持的TMV毒源接种4-6叶期的三生烟，1天后用0.5%氨基寡糖素水剂 400倍液喷雾处理注射叶片，对照利用清水喷雾处理，6-7天后观察统计接种叶片枯斑数量 和农杆菌介导注射接种TMV-GFP 1天后用0.5 %氨基寡糖素喷雾处理注射4-6叶期本氏枯斑 大小，对比评价植物病毒抑制剂对病毒的抑制效果。
[0054] 1.4田间药效试验评价植物病毒抑制剂
[0055]选发病期的烟田，做A、B、C、D 4个处理(A:0.5%氨基寡糖水剂400倍(河北奥德植 保药业有限公司）；B:24%混脂?硫酸铜水剂600倍(北京市东旺农药厂）；C:20%吗啉胍· 乙酸铜可湿性粉剂800倍（山东绿士农药有限公司）；D:清水对照。），每个处理30株。于选点 当天进行首次喷药，并调查发病基数，每7d喷药1次，连续3次。以后每7天调查一次病情，共 调查7次。根据病情分级标准计算防治效果，具体如下：
[0056] 1)病情分级标准
[0057] 0级:全株无病；
[0058] 1级：心叶脉明或轻微花叶，或上部1/3叶片花叶，但不变形，植株无明显矮化；
[0059] 2级：1/3-1/2叶片花叶，或少数叶片变形，或主脉变黑，植株矮化为正常株高的2/3
[0060] 3级：1/2-2/3叶片花叶，主侧脉坏死或变形，或植株矮化为正常株高的1/2-2/3;
[0061] 4级:整株叶片花叶，严重变形或坏死，病株矮化为正常株高的1/3-1/2。
[0062] 以上发病率、病情指数、相对防效等统计方法如下：
[0063] (2)发病率/% =(发病株数/调查总株数）X 100%。
[0064] (3)病情指数=[(各级病株数X相应病级数）/调查总株数X最高分级级数]X 100〇
[0065] (4)相对防效/% = [(对照区病情指数一防治区病情指数)/对照区病情指数]X 100%〇
[0066] 2.结果与分析
[0067] 2.1用抗病毒药剂处理后注射点周围病斑扩散情况
[0068]农杆菌介导注射接种TMV-GFP 1天后用0.5%氨基寡糖素喷雾处理注射4-6叶期本 氏烟叶片，对照利用清水喷雾处理，2天后利用UV光照射并拍照，观察荧光斑扩散情况，并与 空白对照做对比。结果发现经抗病毒药剂处理后，TMV-GFP明显受到抑制，扩散荧光斑直径 0 · 8cm，病毒扩散斑明显小于清水对照2 · 6cm〇
[0069] 2.2摩擦法接种药剂效果分析
[0070] 烟草摩擦接种携带GFP的病毒，接种后利用0.5 %氨基寡糖素处理，2天后观察结 果，0.5%氨基寡糖素处理的植株上病毒荧光斑点与清水处理相比，单斑荧光面积明显小， 并且荧光强度明显弱。表明在药剂胁迫下病毒复制效率运动扩散能力都有所降低，而第3天 观察后可明显观察到清水处理植株荧光斑点扩大，并且病毒已经移动至植株根部随液流转 移至新叶。而药剂处理后的叶片荧光斑虽有所增长，但病毒尚未发生明显转移。该方法与农 杆菌注射接种方法相比同样能评价植物病毒抑制剂对病毒的抑制效果，但是汁液摩擦接种 不易准确控制接种病毒的量，并且荧光斑扩散不规则，不易进行统计分析。
[0071 ] 2.3传统枯斑寄主方法评价植物病毒抑制
[0072]用实验室保持的TMV毒源汁液摩擦接种4-6叶期的三生烟，1天后用0.5%氨基寡糖 素水剂400倍液喷雾处理注射叶片，对照利用清水喷雾处理，5天观察统计接种叶片枯斑数 量和枯斑大小。〇 . 5 %氨基寡糖素处理的叶片枯斑数量和大小都明显小于清水对照处理叶 片的枯斑数量和大小。表明该方法与上述两种方法结果一直。但该方法需要7-8天时间才能 完成，并且该方法也是采用汁液摩擦接种，不能够准确控制各叶片接种等量的病毒，所以结 果不及农杆菌介导的携带GFP的病毒侵染性克隆准确。
[0073] 2.4田间药效试验评价植物病毒抑制剂
[0074] 从调查期间的发病率和病情指数的趋势图看出，吗啉胍?乙酸铜在发病后施药不 能降低花叶病的发病率，但病情指数比清水处理低一些。而0.5%氨基寡糖素、24%混脂· 硫酸铜不但可以降低烟草花叶病的发病率，也可以降低病情指数。大田烟株发病后开始喷 药，首次喷药后，24%混脂·硫酸铜处理防效达到76.32. %，防治效果最好，此后虽然继续 施药，但防效有所下降，处理吗啉胍?乙酸铜防治效果较差。将各次调查病指进行方差分 析，处理F值分别达5%和1%显著水平，新复极差(LSR)测验证明：吗啉胍?乙酸铜与0.5% 氨基寡糖素、24%混脂?硫酸铜间差异达极显著，0.5%氨基寡糖素与24%混脂?硫酸铜间 不显著（表1)。田间试验结果与上述三种结果完全一致，均显示0.5%氨基寡糖素具有良好 的抑制植物病毒作用。说明农杆菌介导的病毒接种TMV-GFP后用植物病毒抑制剂处理来筛 选评价植物病毒抑制剂抑制效果的方法结果可靠。
[0075] 表1 3种药剂对烟草花叶病病情指数防效新复极差测验
[0076]
[0077] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种植物病毒抑制剂的快速筛选方法，其特征在于，所述植物病毒抑制剂的快速筛 选方法包括： 制备含有TMV-GFP的农杆菌菌液，取培养至5-6叶期生长健壮的本氏烟，在叶片背面用 针头打一小孔，用去掉针头的2mL针管吸取含有TMV-GFP的农杆菌重悬液，注射到叶片内，每 个注射点注射50-100yL OD600为0.4-0.8的上述菌悬液； 注射1天后，用待评价的植物病毒抑制剂喷雾处理注射叶片，植物病毒抑制剂为0.5% 氨基寡糖素水剂400倍液，同时，利用清水喷雾处理做对照，2天后利用UV光照射，将药剂处 理叶片和清水对照处理叶片放在同一视野中拍照，并在图片分析软件中十字交叉测叶片荧 光扩散直径，以平均值为最终数据，对比分析植物病毒抑制剂对携带GFP的TMV抑制效果。2. 如权利要求1所述的植物病毒抑制剂的快速筛选方法，其特征在于，所述将含有TMV-GFP的农杆菌重悬液注射到4-6叶期本氏烟叶片，具体包括： 从-80 °C冰箱中取出含TMV-GFP全长载体的农杆菌菌液5yL; 将5yL菌液加入5mL含有卡那霉素和链霉素 YEP培养基中，225rpm/min，30°C，培养12-16h； 从5mL菌液中取lmL加入浓度为20μΜ的乙酰丁香酮5yL，加入到25mL含有卡那霉素和链 霉素 YEP 培养基中 225rpm/min，30 °C 培养 12-16h; 从25mL农杆菌菌液中取2mL加入到50mL离心管中，室温5000rpm/min离心15min，弃上 清； 将沉淀用新配置的缓冲液重悬并调节OD600值至0.6，室温静置3h; 取培养至5-6叶期生长健壮的本氏烟，在叶片背面用针头打小孔，用去掉针头的2mL针 管吸取农杆菌悬浮液注射到叶片内，每个注射点注射30yL OD600为0.6的菌悬液。3. 如权利要求2所述的植物病毒抑制剂的快速筛选方法，其特征在于，所述缓冲液为 10mL体系，包括:MgCl2( 1M)0 · lmL，MES(0 ·5M)0 · 2mL，AS(lOOmM) 10yL加灭菌水至 10mL。4. 如权利要求1所述的植物病毒抑制剂的快速筛选方法，其特征在于，所述病毒抑制剂 的处理时间必须为含有TMV-GFP的农杆菌重悬液注射1天后，激发波长为365nm的UV光照射 并拍照记录时间必须为含有TMV-GFP的农杆菌重悬液注射3天后。5. 如权利要求1所述的植物病毒抑制剂的快速筛选方法，其特征在于，所述含有TMV-GFP的农杆菌菌液的制备方法如下： 从-80 °C冰箱中取出含TMV-GFP全长载体的农杆菌菌液5-1 OyL; 将5-10yL菌液加入5-10mL含有卡那霉素和链霉素 YEP培养基中，220-250rpm/min，28-30°C，培养 12-16h; 从5-10mL菌液中取l-2mL加入浓度为20μΜ的乙酰丁香酮(AS)5-10yL，加入到25-50mL含 有卡那霉素和链霉素 YEP培养基中220-250rpm/min，28-30 °C，培养12-16h; 从25_50mL农杆菌菌液中取2_4mL加入到50-100mL离心管中，室温，5000rpm/min离心 15min，弃上清； 将沉淀用新配置的缓冲液重悬并调节〇D6QQ值至0.4-0.8，室温静置3-4h;缓冲液配方 10mL体系：取 1M的MgCh 0.1mL，0.5M的MES 0.2mL，100mM的AS 10yL，其余加灭菌水至 10mL。
【专利摘要】本发明公开了一种植物病毒抑制剂的快速筛选方法，利用农杆菌注射方法使含有GFP标记的TMV侵染性克隆在本氏烟中侵染表达，1天后利用抗病毒药剂处理注射叶片，药剂处理2天后利用UV光照射叶片并观察记录病毒扩散情况，通过统计病毒扩散荧斑的大小，并对比荧光斑的大小判断植物病毒抑制剂对病毒的抑制效果，从而建立一种新的抗病毒抑制剂快速筛选方法，并且与传统的枯斑统计方法和田间药效实验进行对比，明确所建立方法与传统方法和田间药效实验的一致，为植物病毒抑制剂研发过程中初始抗病毒评价筛选提供新的手段。
【IPC分类】G01N21/64
【公开号】CN105572089
【申请号】CN201610026321
【发明人】孙现超, 许博文, 张旺, 魏周玲, 赵城钢, 杜利娟, 青玲
【申请人】西南大学
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2016年1月15日