于大量样品的筛查，能应用于疾病诊断、细菌检测和环境检测等领域。本发 明在保障食品安全、保护消费者健康方面具有极其重要意义，具有明显的经济效益和社会 效益。
[0026]本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明的试纸及其检测方法简单， 特异性强，灵敏度高，直观，准确，可进行定性和半定量检测，最低可检测lCFU/mL的痕量污 染，适用范围广，成本低，易于推广应用。
【附图说明】
[0027]图1含FITC培养基培养的大肠杆菌0157: H7显微镜照片。
[0028] 图2直接型试纸原理图。
[0029]图3直接型试纸的结构示意图。
[0030] 图4直接型试纸的俯视图结构示意图。
[0031] 图5直接型试纸的灵敏度检测结果。
[0032]图6直接型试纸半定量分析结果。
[0033] 图7直接型试纸交叉反应实验结果。
[0034] 图8直接型试纸模拟带菌实验结果。
【具体实施方式】 [0035] 实施例1:
[0036]本发明试纸条的制备过程包括:大肠杆菌0157:H7单克隆或多克隆抗体的制备、吸 附纤维层的制备、纤维素膜层的制备和试纸条的组装等步骤。
[0037] (1)抗大肠杆菌0157 :H7单克隆抗体或多克隆抗体的制备
[0038] 单抗制备：以灭活的浓度为108cfu/mL的大肠杆菌0157:H7全菌免疫6~8周龄 Balb/C小鼠3~4次，每次免疫间隔时间3~5周，确定抗体效价符合要求后超强免疫，之后3 ~4天，将免疫小鼠眶下窦采血，分离阳性血清;脱颈致死，用75%的酒精浸泡小鼠5~lOmin 消毒体表，无菌取其脾脏，将脾脏剪碎并研磨，经120目尼龙纱布过滤，lOOOrpm离心10min， 收集脾细胞。将1X10 8的脾细胞与NS0骨髓瘤细胞按10:1的比例混合，lOOOrpm离心10min， 弃上清，细胞沉淀物于37°C水浴中缓缓加入0.7~1. OmL大肠杆菌0157 :H7的50%PEG4000， 作用lmin，然后缓缓加入无血清1640培养基15mL，以终止PEG的作用，37°C水浴5~lOmin， lOOOrpm离心10min，弃上清，将细胞沉淀物重悬于HAT选择培养基中，并加入96孔细胞培养 板孔（l〇〇yL~200yL/孔），置于37°C、5%C0 2培养箱中培养10~14天，用间接ELISA法进行阳 性孔筛选，选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行3次有限稀释克隆化，而后扩大培 养，建立杂交瘤细胞株所制备的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体可特异地与大肠杆菌0157: H7反应，亲和力常数达到101()~1012,针对大肠杆菌0157:H7特异抗原决定簇的单克隆抗体， 用于T线的印制。（本实施例只是为了描述单克隆抗体的制备过程，任何市售的与大肠杆菌 0157:H7反应的单克隆抗体在本发明中都可以使用）。
[0039]多抗制备：用灭活的大肠杆菌0157:H7免疫新西兰白兔，免疫原浓度为108cfu/mL， 背部皮下分4~6点注射。首免，免疫原中加入弗式完全佐剂，充分乳化;加强免疫，免疫原中 加入弗氏不完全佐剂，充分乳化，首免后2~3周进行连续免疫4~5次，每次间隔2~3周，最 后一次免疫后10~15天，以间接ELISA测其定效价达到10 5以上时，采血并分离收集高免血 清。以饱和硫酸铵盐析法提取IgG抗体，即取1份高免血清加2份PBS(pH7.2)混匀，加等体积 饱和硫酸铵溶液混匀，置4 °C冰箱12h，4 °C、2500rpm离心15min，弃上清；再以适量PBS (p Η 7.2)溶解沉淀，加饱和硫酸铵溶液至终浓度3 3 %，置4 °C冰箱2 h，4 °C、2 5 0 0 r p m离心 15min，弃上清；以适量PBS (pH7.2)溶解沉淀，置4 °C冰箱内用PBS (pH7.2)透析48~72h，中间 换液数次，4°C、12000rpm离心15min，收集上清，得纯化的抗大肠杆菌0157: H7多克隆抗体，-20°C冻存，用于T线的印制。
[0040] (2)吸附纤维层的制备
[0041]测试端吸附纤维层用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯PVDF膜或聚酯膜制备，将 纤维材料剪成宽1.5cm的条带，将其放入样品垫处理液中浸泡30min，于37 °C烘干，备用。 [0042] (3)纤维素膜层的制备
[0043] 纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜，剪切成宽1.5cm规格的 条带，用点样仪在纤维素膜上喷点大肠杆菌〇157:H7单克隆抗体或多克隆抗体，制作隐形的 检测印迹带，于37°C烘干备用。
[0044] (4)直接型试纸的组装:将吸附纤维层、纤维素膜层、吸水材料层从左至右依次贴 在带有粘合剂的支撑层上，依次将支撑层、吸附层和保护层组装成试纸(如图2B所示）。 [0045] (5)本发明试纸条的检测反应原理：
[0046]当检测大肠杆菌0157:H7试纸测试端插入待测样品溶液后，待测溶液通过虹吸作 用带动待测发光大肠杆菌〇157:H7向纤维素膜层扩散，并最终渗入手柄端的吸水材料层。在 扩散过程中，待测大肠杆菌〇157:H7可与T线上大肠杆菌0157:H7抗体结合从而显示检测印 迹，在紫外线激发下(或使用荧光阅读器直接读值)形成黄绿色对照印迹带?"，即一条黄绿 色带?"印迹为阳性表示;反之样品溶液中无大肠杆菌〇157:H7时，则不能与纤维素膜上的 大肠杆菌〇157:H7抗体检测印迹结合，不显示黄绿色检测印迹带?"，即为阴性表示(如图2C 所示）。
[0047] 本发明的直接型免疫层析试纸的检测方法如下：
[0048] (1)样品前增菌:样品采集后应尽快检验。若不能即使检测，可在2_4°C保存18h。无 菌操作取样25g(mL)加入到含有FTIC溶液的225mLEC或NB肉汤中，将上述溶液放入均质器 中，在拍击式均质器上连续均质l-2min，或放入盛有225mLEC或NB肉汤（含FITC)的均质杯 中，8000-10000r/min均质l-2min，于37°C培养若干小时（如图2A所示）。同时做阳性及阴性 对照。
[0049] (2)试纸检测:将试纸插入样品溶液，10~20秒后拿出平放，5-10min后通过观察检 测试纸的检测线有无荧光，判断样品中是否含有大肠杆菌〇157:H7,或通过荧光读条仪进行 半定量分析。
[0050]以下实施例具体说明试纸条的结构和检测方法。
[0051 ]实施例2:参见图3、图4。图中，1为支撑层，用塑胶薄片条制成，2为吸附纤维层，用 玻璃纤维棉制成，纤维素膜层3采用硝酸纤维素膜，手柄端的吸水材料层4用吸水滤纸制成， 将吸附纤维层2、纤维素膜层3、吸水材料层4各层从左至右粘贴固定在支撑层1上，各层彼此 之间交界处的纤维互相交叉渗透。在纤维素膜层3上设有隐形检测印迹5，用大肠杆菌0157: H7单克隆抗体制成;形成印迹带制成"Γ。
[0052] 6-1为覆盖在吸附纤维层2上面的样品端白色保护膜，6-2为覆盖在吸水材料层4上 面的其它颜色保护膜(如黄色），7为样品标记线，在标记线右侧保护膜上印有箭头及max字 样。
[0053] (1)本发明试纸灵敏度检测：将大肠杆菌0157: H7单菌落接种于含有0.4mg/mL的 FITC培养基中培养，采用平板计数法计数，将菌液分别稀释为108-104CFU/mL，用直接型试纸 检测，5-10min后在紫外灯下观察检测结果，目测最低检测限(L0D)为T线可见时的最低菌浓 度，结果如图5所示，试纸的L0D为10 6CFU/mL。用荧光读条仪对试纸进行半定量分析，结果如 图6所示，试纸在菌浓度为105-10 8CFU/mL时呈线性相关，且L0D为105CFU/mL。
[0054] (2)本发明试纸特异性检测：采用交叉反应试验鉴定其特异性。将浓度为108CFU/ mL的常见食源性致病菌，如表1所示，用直接型试纸检测，若为阳性即有交叉，检测结果如图 7所示，大肠杆菌直接型试纸只能检出三株大肠杆菌，其他常见食源性致病菌均不能检出， 即该试纸具有较好的特异性。
[0055] 表1交叉