唾液外泌体的制备方法及其在分子诊断中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种唾液外泌体的制备方法及其在分子诊断 中的应用。
【背景技术】
[0002] 外泌体(Extracellular Vesicles)是指由细胞分泌到细胞外微环境的一种具有 膜结构的囊泡，是细胞在向外出芽和细胞膜裂变的过程中释放出的含有胞膜成分的微小颗 粒，能携带多种特异性蛋白质、microRNA、脂质等物质。外泌体的尺寸介于0.05~1 .ΟΟμπι之 间，近年来的癌症机理研究证实外泌体与细胞间的物质、能量、信息传递相关，特别是癌症 细胞之间或癌症细胞与正常细胞之间的相互影响。外泌体广泛存在于组织和体液中，在疾 病的临床诊断、预后推测、健康管理等方面具有重要的指导作用。特别是肿瘤细胞来源的外 泌体，其作为肿瘤细胞与外界环境信号交流的媒介，将肿瘤细胞所特有的蛋白、mRNA和 miRNA等生物活性物质传递给周围的环境和细胞，在入侵其他细胞的同时改造微环境，使其 向更有利于肿瘤发展的方向转变{]^.1^」-1^25^0^61^6七&1.，1'111110111'-(161'；[￥6(1 microvesicles carry several surface determinants and mRNA of tumour cells and transfer some of these determinants to monocytes.Cancer Immunology Immunotherapy 55，808-818(2006);K.Al-Nedawi，B.Meehan，J.Rak，Microvesicles Messengers and mediators of tumor progression.Cell Cycle 8,2014_2018(2009); N·S·Barteneva，N.Maltsev，I.A.Vorobjev，Microvesicles and intercellular communication in the context of parasitism.Frontiers in Cellular and Infection Microbiology 3,（2013).因此对于外泌体的研究已经成为癌症机理研究、疾 病途断的重要组成部分{E.Colombo，B.Borgiani，C.Verderio，R.Furlan，Microvesicles: novel biomarkers for neurological disorders.Frontiers in Physiology 3,63 (2012)；B.Frey?U.S.Gaipl?The immune functions ofphosphatidyl serine in membranes of dying cells and microvesicles. Seminars in Immunopathology 33， 497-516(2011);J.Conde_Vance11s，E.Gonzalez，S.C.Lu，J.M.Mato，J.M.Falcon-Perez， Overview of extracellular microvesicles in drug metabolism.Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology 6,543_554(2010).}0
[0003] 目前对外泌体的研究还处于初级阶段，由于对其组成成分尚不完全清楚，对其生 物学功能研究亟待加强。唾液作为一种含有大量生物信息的体液，其用于临床诊断优势明 显，因具有在于非侵入、安全、简便等特点，在疾病的分子诊断领域具有广阔的应用前景。同 时，唾液中蕴藏着丰富的外泌体，对其进行研究有望为各种疾病发现早期诊断的生物标志 物。
[0004] 目前，唾液外泌体的提取方法存在提取方法繁琐、提取效率较低、背景干扰严重等 不足。例如超高速离心方法需要的离心力为200000g以上，且需要30mL的大量生物样本才能 得到long的蛋白{M.Gonzalez-Begne et al ·，Proteomic Analysis of Human Parotid Gland Exosomes by Multidimensional Protein Identification Technology(MudPIT) ? Journal of Proteome Research 8,1304-1314(2009)·}。采用沉淀的方法虽然提高了提 取效率，但是却无法解决背景杂质的干扰问题。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服上述现有技术中存在的不足，提供一种唾液外泌体的制备 方法及其在分子诊断中的应用。具体而言，本发明使用亲和层析色谱技术与滤膜一体化技 术，去除了唾液中的高丰度蛋白和黏蛋白，再用冷冻离心的方法制备了唾液外泌体，并对其 在分子诊断中的应用进行了研究，如根据肺癌患者和健康人的蛋白组学差异寻找肺癌的生 物标志物。
[0006] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0007] 本发明涉及一种唾液外泌体的制备方法，所述方法包括如下步骤：
[0008] S1、通过亲和层析色谱法去除唾液中的高丰度蛋白，结合滤膜去除黏蛋白；
[0009] S2、对步骤S1处理后的唾液进行冷冻离心，提取唾液外泌体及唾液外泌体蛋白。
[0010] 在本发明中，上述冷冻离心可重复操作3~5次。所述高丰度蛋白包括唾液淀粉酶。
[0011] 优选的，所述亲和层析色谱法以淀粉为固定相，以磷酸盐缓冲液为流动相。洗脱速 度为 700 ~900yL/min。
[0012] 优选的，所述滤膜为1.0~5.Ομπι聚偏氟乙烯膜。该滤膜连接在亲和层析色谱柱后 以完成色谱和膜分离技术的一体化。在本发明中，采用该孔径的滤膜，可有效去除黏蛋白。 [00 13] 优选的，所述冷冻离心的条件为4°c、离心力10000~20000g、30~90分钟。更优选 为60~80分钟。
[0014] 优选的，提取唾液外泌体蛋白包括裂解释放唾液外泌体中的蛋白、对裂解液(上清 液)进行沉淀获得唾液外泌体蛋白的步骤。
[0015] 优选的，所述裂解为用聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-100)对所述唾液外泌体进行 冰上裂解30~90分钟。更优选每150yL唾液外泌体加入lyL Triton-100进行冰上裂解30~ 60分钟。裂解时，还加入了 2.5yL蛋白酶抑制剂(每150yL唾液外泌体）。裂解后，加入10倍裂 解液体积的冰乙醇过夜沉淀。
[0016] 优选的，步骤S2后，还包括采用液相色谱和质谱联用技术进行外泌体蛋白种类鉴 定的步骤。
[0017] 本发明还涉及一种上述方法制备的唾液外泌体在制备生物标志物中的用途。
[0018] 优选的，所述生物标志物为用于研究癌症用途的生物标志物。所述生物标志物为 用于研究癌症，同时不是用于诊断用途的生物标志物。
[0019] 优选的，所述生物标志物为肺癌、口腔癌、胃癌或肝癌的生物标志物。
[0020] 优选的，通过所述制备方法提取得到唾液外泌体蛋白，差异对比，获得相应癌症的 唾液外泌体生物标志物。
[0021] 本发明针对的是唾液样本，由于其中50~60%的蛋白为唾液淀粉酶和黏蛋白，严 重影响唾液外泌体的分离提取。为特异性地去除唾液淀粉酶，本发明选取淀粉为基质制成 亲和层析色谱柱，通过