一种定量检测透明质酸发酵液中透明质酸含量的方法
【专利摘要】本发明公开了一种定量检测透明质酸发酵液中透明质酸含量的方法，该方法先将透明质酸发酵液离心，用无机盐调节上清液的电导率，经无水乙醇沉淀后用水溶解，将溶解液经活性炭脱色、离心后，再对上清液进行咔唑显色分析检测。该检测方法可直接应用于成分复杂的透明质酸发酵液中检测透明质酸的含量。该方法既简单、方便、快速，又具有较高的准确度、精确度和重现性，可为透明质酸前期工艺开发筛选最优结果提供可靠的判断依据，在筛选透明质酸高产菌株、优化菌株前期的发酵工艺以及菌株应用于实际生产后对发酵工艺进行控制方面具有重大的意义。
【专利说明】
一种定量检测透明质酸发酵液中透明质酸含量的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及透明质酸的检测领域，具体涉及一种定量检测透明质酸发酵液中透明 质酸含量的方法。
【背景技术】
[0002] 透明质酸(Hyaluronic acid，简称HA)又名玻璃酸，是由（1-3)-2-乙酸氨基-2-脱 氧-D-葡萄糖（l-4)-D-D-葡萄醛酸双糖重复单位所组成的高分子量的直链粘多糖，由于其 独特的生理学活性，使其在化妆品工业、临床治疗等领域得到了广泛的应用。近年来，微生 物发酵生产透明质酸逐步取代了从动物组织中提取透明质酸的传统方法，如何高效、精确 的检测发酵液中透明质酸的含量在筛选透明质酸高产菌株、菌株前期的发酵工艺优化以及 菌株应用于实际生产后对发酵工艺进行控制方面显得至关重要。
[0003] 目前透明质酸的检测方法中，多利用分子与透明质酸的特异性结合来进行检测， 但此类方法操作复杂，另外抗体等可与透明质酸特异性结合的分子合成困难，且成本高。如 中国专利CN201010185144.0中合成了一种融合蛋白HABP-mKate，该融合蛋白和透明质酸具 有较强的特异性，可用于透明质酸的检测，且HABP-mKate的合成克服了之前常用的HABP等 结合蛋白只能依靠从组织中纯化、无法大规模生产且成本高等缺点，但该结合蛋白存在的 合成工艺复杂、成本高等缺点。
[0004] 除上述方法外，目前常用的检测方法还有HPLC法、比色法、CTAB比浊法和咔唑显色 法。但HPLC法对样品的纯度要求比较高，不适合大批量测定发酵液中透明质酸含量;比色法 通过透明质酸与相应的试剂产生颜色反应，根据其吸光值来测算透明质酸的含量，具有专 一性不强等问题，因此发酵液中含有大量杂质如发酵液中残留的小分子杂多糖、色素等，如 果不经过预处理去除，都会对测定结果产生很大的干扰导致检测结果不准;CTAB比浊法利 用其与透明质酸溶液反应产生混浊的特性，通过浊度与透明质酸的浓度的线性相关性测定 透明质酸的含量，该方法具有受发酵液中的葡萄糖等小分子杂糖、无机盐离子等干扰比较 小等优点，但该方法受发酵液中的蛋白干扰的影响比较大，因此专一性和准确性也不是很 好。
[0005] 咔唑显色法检测透明质酸被认为是最为广泛的方法，目前药典中检测透明质酸均 是采用该方法，但咔唑显色法的特异性差，透明质酸发酵液中的成分比较复杂，直接用发酵 液进行咔唑显色检测，干扰因素太多，特别是发酵工艺开发初期，采用不同培养基发酵出来 的透明质酸发酵液性质差别比较大，势必会影响结果的判断。因此需要建立一种既可减少 杂质的影响，又可快速而精确的检测出发酵液中透明质酸含量的简便可行方法。
【发明内容】
[0006] 本发明针对上述现有技术所存在的问题和缺陷，提供了一种在基本除去发酵液中 的残留杂糖、色素等干扰因素后，利用咔唑显色方法来定量检测透明质酸的方法，该方法可 直接应用于成分复杂的透明质酸发酵液中检测透明质酸的含量，既简单、快速和方便，又具 有较高的准确度、精确度和重现性，可为透明质酸前期工艺开发筛选最优结果提供可靠的 判断依据。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明提供了一种定量检测透明质酸发酵液中透明质酸含 量的方法，包括以下步骤：
[0008] (1)调节电导率:透明质酸发酵液经离心后取上清液，加入无机盐调节电导率至20 ~30mS/cm;
[0009] (2)乙醇沉淀：向上述调电导率后的发酵液中加入无水乙醇，摇匀后，置于4~20°C 下静置沉淀1~4h后离心，取沉淀物溶于水中得溶解液；
[0010] (3)脱色：向上述溶解液中加入活性炭，振摇后、离心得上清液；
[0011] (4)检测:取步骤(3)中的上清液采用咔唑显色定量法测定。
[0012]在本发明的一些实施方式中，发酵液中加入的无机盐选自Na+、K+、Ca2+的氯化盐、 硝酸盐或硫酸盐。
[0013] 在本发明的一些实施方式中，发酵液中加入的无机盐选自Na2S〇4、NaCl、NaN0 3、KCl 或CaCl2〇
[0014] 在本发明的一些实施方式中，无水乙醇的加入量为发酵液体积的1.5~3倍。
[0015] 在本发明的一些实施方式中，步骤(2)中水与步骤1)中发酵液的体积比为1:1。
[0016] 在本发明的一些实施方式中，步骤(3)中的振摇时间为1~30min。
[0017]在本发明的一些实施方式中，脱色处理时溶解液中活性炭的含量为10g/L~100g/ L〇
[0018] 在本发明的一些实施方式中，所用的水为纯化水。
[0019] 在本发明的一些实施方式中，所用的检测透明质酸的方法是采用的国家药业行业 标准中的咔唑测定医用透明质酸钠凝胶的方法进行咔唑显色定量法测定。
[0020] 在本发明的一些实施方式中，透明质酸损失率的计算方法为：
[0021] 配制一定浓度的HA标准品溶液，经过与处理HA发酵液相同的预处理工艺处理后， 用咔唑显色法测定处理前后透明质酸的浓度，从而计算得损失率(HA的实际值为处理前HA 的测定值）：
[0022] HA损失量(g/L)=处理前HA的测定值(g/L)_处理后HA的测定值(g/L);
[0024]同时，由此也可以得知依据本发明的方法所测定的透明质酸的实际值的计算方法 为：
[0026]本发明使用的术语"或"表示备选方案，如果合适的话，可以将它们组合，也就是 说，术语"或"包括每个所列出的单独备选方案以及它们的组合。例如，"发酵液中加入的无 机盐选自恥23〇4、恥(：1、恥勵 3、1((：1或0&(：12"表示发酵液中加入的无机盐可以是恥 23〇4、恥(：1、 NaN03、KCl或CaCl2之中的一种，也可以是其一种以上的组合。
[0027] 发酵液经过离心除菌体后的上清液通过加入无机盐调电导率后，可以保证每批次 发酵液的电导率相同，电导率相同的透明质酸溶液可以使得乙醇沉淀以及活性炭脱色过程 中透明质酸的损失率更接近，因此，本发明通过调控发酵液的电导率，可以有效降低因溶液 的电导率不同造成检测的误差偏差较大的问题，从而大大减小批次间的测定误差。
[0028]发酵液的电导率对透明质酸的检测有一定的影响。发酵液电导率太低，乙醇沉淀 处理时，发酵液中透明质酸不能完全沉淀下来，进而会导致测定结果偏低。而发酵液的电导 率过大，乙醇沉淀时，发酵液沉淀透明质酸的同时，与咔唑也能发生显色反应的杂多糖也会 被沉淀下来，导致测定结果偏高。
[0029]本发明的有益效果在于：
[0030] 本发明所提供的定量检测发酵液中透明质酸含量的方法可直接应用于成分复杂 的透明质酸发酵液中检测透明质酸的含量，既简单、方便、快速，又具有较高的准确度和精 确度，为透明质酸前期发酵工艺摸索中表达量的测定提供了可靠的依据，同时在筛选透明 质酸高产菌株、菌株前期的发酵工艺优化以及菌株应用于实际生产后对发酵工艺进行控制 方面具有重大的意义。
【具体实施方式】
[0031] 以下所述的是本发明的优选实施方式，本发明所保护的不限于以下优选实施方 式。应当指出，对于本领域的技术人员来说在此发明创造构思的基础上，做出的若干变形和 改进，都属于本发明的保护范围。实施例中所用的原料均可以通过商业途径获得。
[0032] 本发明中使用的透明质酸发酵液均为枯草芽孢杆菌构建的工程菌株有氧发酵生 产的。
[0033] 实施例1
[0034] 处理A:取15mL透明质酸摇瓶发酵液经过下列预处理方法处理：
[0035] (1)透明质酸发酵液经8000rpm、lOmin高速离心除菌体后，上清液中缓慢加入 Na2S〇4粉末，以调节发酵液的电导率至20mS/cm;
[0036] (2)发酵液中加入45mL的无水乙醇，摇匀后，置于4 °C条件下静置沉淀lh后，高速离 心机离心乙醇沉淀物，弃除上清液，沉淀物中加入15mL的纯化水，振摇至溶解；
[0037] ⑶溶解液中加入0.15g(l% )的活性炭，振摇lmin后，8000rpm、10min高速离心后， 弃除活性炭，得上清液；
[0038] (4)上清液进行咔唑显色定量测定。测定方法采用国家药业行业标准中的咔唑测 定医用透明质酸钠凝胶的方法。
[0039] 处理B:另取15mL同批次的透明质酸摇瓶发酵液，经下列预处理方法处理：
[0040] (1)测发酵液电导率值为7 · 89mS/cm;
[00411 (2)发酵液中加入45mL的无水乙醇，摇匀后，置于4 °C条件下静置沉淀lh后，高速离 心机离心乙醇沉淀物，弃除上清液，沉淀物中加入15mL的纯化水，振摇至溶解；
[0042] (3)溶解液中加入0.15g的活性炭，振摇lmin后，8000rpm、lOmin高速离心后，弃除 活性炭，得上清液；
[0043]分别用葡萄糖测定仪测定预处理前后发酵液中葡萄糖残留量;分光光度计测定经 2种方式处理前后发酵液的在420nm处的吸光值;采用国家药业行业标准中的咔唑测定医用 透明质酸钠凝胶的方法进行咔唑显色定量法测定透明质酸的含量。测定结果如表1所示。
[0044]表1透明质酸发酵液预处理前后分析测定结果
[0046]结果显示，原发酵液的葡萄糖残留量与色值均很高，葡萄糖残留量高达2.51g/L; 由于原发酵液的电导率太小，B预处理方式中未调节电导率直接进行乙醇沉淀，透明质酸没 有被完全沉淀下来，以致最终的测定结果偏小。而A方式经过添加无机盐适量调高发酵液的 电导率值，透明质酸可以被充分的沉淀下来，测定结果更加接近实际值。
[0047] 实施例2
[0048] 处理A:取20mL另一批次透明质酸摇瓶发酵液经过下列预处理方法处理：
[0049] (1)透明质酸发酵液经8000rpm、lOmin高速离心除菌体后，上清液中缓慢加入KC1 粉末，以调节发酵液的电导率至30mS/cm;
[0050] (2)发酵液中加入30mL的无水乙醇，摇匀后，置于20°C条件下静置沉淀4h后，高速 离心机离心乙醇沉淀物，弃除上清液，沉淀物中加入20mL的纯化水，振摇至溶解；
[0051 ] (3)溶解液中加入0.28(1%)的活性炭，振摇3〇111；[11后，8000印111、10111；[11高速离心后， 弃除活性炭，得上清液；
[0052] (4)上清液进行咔唑显色定量测定。测定方法采用国家药业行业标准中的咔唑测 定医用透明质酸钠凝胶的方法。
[0053] 处理B:另取20mL同批次的透明质酸摇瓶发酵液，经过下列预处理方法处理：
[0054] (1)透明质酸发酵液经8000rpm、lOmin高速离心除菌体后，上清液中缓慢加入KC1 粉末，以调节发酵液的电导率至30mS/cm;
[0055] (2)发酵液中加入30mL的无水乙醇，摇匀后，置于20°C条件下静置沉淀4h后，高速 离心机离心乙醇沉淀物，弃除上清液，沉淀物中加入20mL的纯化水，振摇至溶解；
[0056] (3)溶解液进行咔唑显色定量测定。测定方法同上实施例1，测定结果，见表2。
[0057]表2透明质酸发酵液预处理前后分析测定结果
[0059]原发酵液的葡萄糖残留量与色值均很高，葡萄糖残留量高达3.45g/L;B处理方式 未经过活性炭脱色只能除去部分的色素，因为色素的干扰使得测定结果值偏高，而A处理方 式基本可以除去发酵液中的色素和残糖，测定结果更加接近实际值。
[0060] 实施例3
[0061] 取20mL另一批次透明质酸摇瓶发酵液经过下列预处理方法处理：
[0062] (1)透明质酸发酵液经8000rpm、lOmin高速离心除菌体后，上清液中缓慢加入 NaN03粉末，以调节发酵液的电导率至30mS/cm;
[0063] (2)发酵液中加入40mL的无水乙醇，摇匀后，置于20°C条件下静置沉淀2h后，高速 离心机离心乙醇沉淀物，弃除上清液，沉淀物中加入20mL的纯化水，振摇至溶解；
[0064] (3)溶解液中加入2g(10% )的活性炭，振摇lOmin后，8000rpm、10min高速离心后， 弃除活性炭，得上清液；
[0065] (4)上清液进行咔唑显色定量测定。测定方法采用国家药业行业标准中的咔唑测 定医用透明质酸钠凝胶的方法。测定方法同上实施例1，测定结果，见表3。
[0066]表3透明质酸发酵液预处理前后分析测定结果
[0068] 实施例4
[0069] 取15mL另一批次透明质酸摇瓶发酵液经过下列预处理方法处理：
[0070] (1)透明质酸发酵液经8000rpm、lOmin高速离心除菌体后，上清液中缓慢加入 CaCl2粉末，以调节发酵液的电导率至25mS/cm;
[0071] (2)发酵液中加入30mL的无水乙醇，摇匀后，置于20°C条件下静置沉淀4h后，高速 离心机离心乙醇沉淀物，弃除上清液，沉淀物中加入20mL的纯化水，振摇至溶解；
[0072] (3)溶解液中加入0.75g(5%)的活性炭，振摇30min后，8000rpm、10min高速离心 后，弃除活性炭，得上清液；
[0073] (4)上清液进行咔唑显色定量测定。测定方法采用国家药业行业标准中的咔唑测 定医用透明质酸钠凝胶的方法。测定方法同上实施例1，测定结果，见表4。
[0074]表4透明质酸发酵液预处理前后分析测定结果
[0076] 对比例1
[0077]取20mL野生菌摇瓶发酵液(注意:该野生菌不表达透明质酸，在相同培养条件下得 到的发酵液)。
[0078] 经过下列预处理方法处理：
[0079] (1)野生菌发酵液经8000rpm、10min高速离心除菌体后，上清液中缓慢加入CaCl2 粉末，以调节发酵液的电导率至30mS/cm;
[0080] (2)发酵液中加入2倍体积(60mL)的无水乙醇，摇匀后，置于4°C条件下静置沉淀lh 后，高速离心机离心乙醇沉淀物，弃除上清液，沉淀物中加入20mL的纯化水，振摇至溶解； [0081 ] (3)溶解液中加入0 · 2g( 1 % )的活性炭，振摇10min，8000rpm、lOmin高速离心后，弃 除活性炭，得上清液；
[0082] (4)上清液进行咔唑显色定量测定。测定方法采用国家药业行业标准中的咔唑测 定医用透明质酸钠凝胶的方法。
[0083] 测试方法同实施例1，测定结果如表5所示。
[0084]表5野生菌发酵液预处理前后分析测定结果
[0086]结果显示，原野生菌发酵液中的葡萄糖残留量与色值均很高，另外，咔唑显色法检 测出了发酵液中含有很高浓度的透明质酸，然而，该野生菌是不产透明质酸的，由此可知， 咔唑显色检测出的均为能够和咔唑硫酸显色的杂质；预处理后的发酵液葡萄糖残留量、 420nm的吸光值均几乎为0,咔唑显色检测透明质酸的含量也几乎为0,说明发酵液经过预处 理后，几乎能够将发酵液中影响咔唑显色检测透明质酸的杂质去除。
[0087]本发明实施例中原发酵液中透明质酸的含量都是直接采用咔唑显色法测定的，且 实施例中测定的数据均为重复三次取平均值的结果。
【主权项】
1. 一种定量检测透明质酸发酵液中透明质酸含量的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 调节电导率：透明质酸发酵液经离心后取上清液，加入无机盐调节电导率至20~ 30mS/cm; (2) 乙醇沉淀：向上述调电导率后的发酵液中加入无水乙醇，摇匀后，置于4~20°C下静 置沉淀1~4h后离心，取沉淀物溶于水中得溶解液； (3) 脱色：向上述溶解液中加入活性炭，振摇后，离心得上清液； (4) 检测:取步骤(3)中的上清液采用咔唑显色定量法测定。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵液中加入的无机盐选自Na+、K+、Ca2+的 氯化盐、硝酸盐或硫酸盐。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，发酵液中加入的无机盐选自Na2S04、 NaCl、NaN03、KCl 或 CaCl2。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无水乙醇的加入量为发酵液体积的 1.5~3倍。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中的振摇时间为1~30min。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中水与步骤（1)中发酵液的体积比 为 1:1〇7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，脱色处理时溶解液中活性炭的浓度为10g/ L~100g/L。
【文档编号】G01N1/28GK106018391SQ201610178400
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年3月25日
【发明人】石江水, 王海刚, 林小鹊, 张鸿
【申请人】广东东阳光药业有限公司