和0.05 μπι的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水冲洗。
[0036]该实用新型的检测方式是电化学检测，利用传统的三电极体系。Ag/AgCl为参比电极，钼丝为对电极，修饰的金电极为工作电极。在检测之前，先通过Au-S键将captureprobe固定到电极表面。然后将反应后的均相溶液修饰到电极表面，然后在37°C孵育2h使均相中的RCA产物与电极表面的capture probe完成杂交反应，从而将RCA产物固定到电极表面。然后用三电极工作体系检测MB的氧化还原峰。以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为O到-0.5 V，脉冲宽度0.05 V，扫描速率为0.06 S，采用差分脉冲伏安技术读取MB电信号的变化，检测待测目标物。
[0037]本实用新型基于核酸适配体与目标物的特异性识别，具有链置换功能的DNA聚合酶的链延伸和置换作用，滚环放大作用以及亚甲基蓝的氧化还原特性构建了适体生物传感器。该传感器具有检测速度快，检测限低，特异性高等优点，可以弥补鼠伤寒沙门氏菌现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的定量检测。
[0038]本实用新型的有益效果:
[0039]1、利用了核酸适配体的特异型识别，利用鼠伤寒沙门氏菌的适体作为识别物质实现了对目标物鼠伤寒沙门氏菌的高特异性检测；
[0040]2、利用了连接酶的连接作用，实现了挂锁探针的成环；
[0041]3、利用聚合酶的聚合作用，实现了滚环复制过程，起到了信号放大的作用；
[0042]4、该传感器的反应条件温和，反应速度快；
[0043]5、由于使用金电极，其电极简便、小型化、易携带、可多次使用；
[0044]6、检测原理的主要过程均是在均相中实现的，提高的反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测；
[0045]7、制备方法简单，性能稳定，电极的重复性好，适用于食品安全中鼠伤寒沙门氏菌的检测和生物传感器产业化的实际应用；
[0046]8、制作电极的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。
【附图说明】
[0047]图1为生物传感器的横截面的结构示意图。
[0048]其中，I为金电极，2为capture probe层，3为RCA产物层。
【具体实施方式】
[0049]下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
[0050]实施例1
[0051]如附图1所示，一种检测鼠伤寒沙门氏菌的生物传感器，包括金电极1，在金电极I上从内往外依次修饰有capture probe层2和RCA产物层3。
[0052]本发明提供的生物传感器的制备方法如下:
[0053]a、金电极I首先在0.3和0.05 μm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水反复冲洗；
[0054]b、将10 yL的capture probe (10 μ Μ)滴加到电极表面，在室温下孵育2 h，通过Au-S键将巯基链固定到电极表面；至此电极的capture probe层2修饰过程先告一段落，后再在均相溶液中修饰RCA产物层3，均相反应中的修饰步骤如下:
[0055]a、将灭菌水，1X的缓冲液(buffer )适量，I yL HAP的DNA链(10 μΜ)和I yL不同浓度的目标(100 PM，500 PM，I nM，5 nM，10 nM，50 nM，100 nM，500 nM，
[0056]ΙμΜ)依次加入到预先准备好的灭菌的1-9号离心管中，震荡30 S，然后将混匀的混合液放入37°C的恒温箱中孵育2 h ；
[0057]b、向另外准备好的9个离心管中分别加入padlock probe(l yL，浓度为10 μΜ)、连接酶(I μ L)、ligat1n probe (I yL，浓度为10 μΜ)，震荡30 s，放入37°C的恒温箱中孵育2 h ；
[0058]c、继续向a步中1-9号离心管中加入b步所得孵育混合液(10 μΜ)，聚合酶(Iμ L)和dNTP (I μ L)，震荡30 S，然后将混匀的混合液继续放入37°C的恒温箱中孵育2 h ；
[0059]d、将c步反应后的溶液(10 μ L)滴加到预先修饰好capture probe的电极上，然后将电极继续放在37 °0的恒温箱中孵育2 h ；
[0060]e、将电极插入MB溶液(80 μ M)，37°C孵育10 min ;
[0061]f、用磁力搅拌器在PBS溶液中清洗电极，每次10 min，共清洗3次。
[0062]所述的生物传感器，HAP(摩尔)、padlock probe (摩尔)、ligat1n probe (摩尔)、聚合酶(活力)、连接酶(活力)和dNTP (活力)的摩尔与活性的比为1:1:1:2:40:2。
[0063]上述过程中用到的溶液的制备方法:
[0064]1、PBS 缓冲液是由方法配制:Na2HP04 (10 mM)，NaH2PO4 (10 mM), NaCl (140 mM),KCl (I mM), MgCl2 (I mM), CaCl2 (I mM),最终溶液的 pH 值为 7.4。
[0065]2、配置的PBS缓冲液与超纯水均需进行高温灭菌处理。具体方法是，将PBS和超纯水分别放置在不同的锥形瓶中，然后用锡箔纸和报纸进行封口。在高压灭菌锅中在120°C的温度下灭菌20 min。
[0066]以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为O到-0.5 V，脉冲宽度0.05 V，扫描速率为0.06 S，采用差分脉冲伏安技术读取MB电信号的变化，检测目标物。
[0067]检测发现，在目标物的浓度在10pM到I μ M时，目标物浓度的对数与电流大小成正比关系，同时，我们在10pM的浓度基础上继续向更低的浓度检测，经检测当浓度低于10pM时，电流与浓度的关系恰好不再符合拟合曲线规律，即电流最低点因此可得到该方法的检测下限为I X 10_16mol/ml。
[0068]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种检测鼠伤寒沙门氏菌的生物传感器，其特征在于，在金电极从里到外依次修饰有捕获探针层、滚环放大产物层。2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述的捕获探针层的厚度为10±2nm，滚环放大产物层的厚度为30±2 nm。
【专利摘要】本实用新型提供了一种检测鼠伤寒沙门氏菌的生物传感器，包括金电极及金电极外依次修饰的capture probe层和RCA产物层；本实用新型灵敏度和特异性高，可快速的检测鼠伤寒沙门氏菌。
【IPC分类】G01N27/327, G01N33/569
【公开号】CN204649747
【申请号】CN201520119390
【发明人】王玉, 邱婷婷, 黄加栋, 刘素, 徐伟, 王虹智, 郭玉娜, 许颖, 崔洁
【申请人】济南大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年2月28日