g/只的剂量经皮下或肌肉注射清洁级山羊或新西兰大白兔3~4次，末次免 疫30天后，以ELISA测定其血清效价达到1:10000以上时，心脏或动脉采血，分离收集 高免血清，以饱和硫酸铵盐析法和亲和层析法提取羊抗小鼠或兔抗小鼠 IgG抗体，用于 β -conglycinin检测试纸质控线的喷点。
[0041] 6、免疫层析试纸的组装：
[0042] 将样品垫、结合垫、纤维素膜、吸水垫从左至右依次黏贴在带有粘合剂的支撑层 上，彼此交界处重叠2~3mm，然后切成3~4mm宽的试纸即可。
[0043] 7、免疫层析试纸的检测原理：
[0044] 当试纸测试端插入待测样品溶液后，待测溶液通过虹吸作用带动待测 β -conglycinin及结合垫中的金标抗体一起向纤维素膜扩散，并最终渗入手柄端的吸水材 料层。在扩散过程中，待测β-conglycinin可先与金标单抗相结合，进而与纤维素膜上喷 点的β-conglycinin兔源多克隆抗体检测印记结合，显示检测线，形成红色检测线带" I "； 纤维素膜上喷点的羊或兔抗小鼠 IgG抗体质控印记也可与金标抗体结合，形成红色质控线 带" I "，即两条红色线带" I I "表示为阳性；反之样品溶液中无 β-conglycinin时，则不 能与金标抗体结合，同样也不能与纤维素膜上喷点的β -conglycinin兔源多克隆抗体检 测印记结合，不显示红色检测线带，而纤维素膜上喷点的羊或兔抗小鼠 IgG抗体质控印记 可与金标抗体结合，显示红色质控线带" I "，形成一条红色带" I "表示为阴性。如果纤维 素膜上没有任何红色线带显示，则表明试纸已失效。
[0045] 以下用实例具体说明本实用新型试纸的结构、检测方法及特性。
[0046] 实施例一：参见图2和图3。图中1为支撑层，用塑胶薄片条制成；2为样品垫，用 玻璃纤维棉制成；3为结合垫，吸附有胶体金纳米颗粒标记的β -conglycinin鼠源单克隆 抗体的玻璃纤维棉；4为纤维素膜，采用硝酸纤维素膜；手柄端的吸水垫5用吸水滤纸制成。 将样品垫2、结合垫3、纤维素膜4、吸水垫5从左至右依次黏贴固定在支撑层1上，彼此之间 交界处纤维互相重叠。在纤维素膜4上设有隐形检测线6,用β-conglycinin兔源多克隆 抗体溶液制成；隐形质控线7用羊抗小鼠 IgG抗体溶液在纤维素膜上喷点制成，两条线带平 行排列，形成组合印迹带" I I"。
[0047] 8-1为覆盖在样品垫2和结合垫3上面的样品端白色保护膜，8-2为覆盖在吸水垫 5上面的其它颜色保护膜(如黄色)，9为样品标记线，该标记线位于样品垫2与结合垫3交 界处对应的白色保护膜上偏向样品垫2 -侧约0. 5cm处，在标记线左侧保护膜上印有箭头 及Max字样。
[0048] 待测样品的制备及检测步骤：
[0049] 检测脱脂奶粉：将样品用含有0.0 lmol/L NaHSO3的水溶液以1:15的料液比溶解 后，lmol/L的NaOH调pH至9. 0,在45°C水浴条件下搅拌lh，将混合溶液在常温下1000 Orpm 离心30min，分离上清液用于检测。
[0050] 操作方法：将β -conglycinin试纸样品端插入待测样品中，插入深度不超过标记 线，约10~20秒钟取出试纸，水平放置，IOmin后观察判定检测结果。
[0051] 结果判定：（a)阳性如果在纤维素膜上显示有两条红色印迹带" I I "，表示检测 结果为阳性，说明在待测样品中含有i3-c〇nglycinin;(b)阴性如果在纤维素膜上显示有 一条红色印迹带" I "，表示检测结果为阴性，说明在待测样品中不含0-conglycinin;(c) 失效如果在纤维素膜上没有红色带显示，则表明试纸已失效。
[0052] 实施例二：试纸结构和实施例一基本相同，不同之处在于：样品垫2用尼龙膜制 成，纤维素膜4采用纯纤维素膜。
[0053] 检测饲料：先将样品进行粉碎，过60目筛，再用石油醚对粉碎后的样品进行脱脂 处理。随后的样品制备、操作方法和结果判定同实施例一。
[0054] 实施例三：试纸结构和实施例一基本相同，不同之处在于：样品垫2用聚偏二氟乙 烯PVDF膜制成，隐形质控印迹7用兔抗小鼠 IgG抗体溶液在纤维素膜上制成，纤维素膜4 采用羧化纤维素膜。
[0055] 检测饲料：样品制备方法同实施例二；操作方法和结果判定同实施例一。
[0056] 实施例四：试纸结构和实施例一基本相同，不同之处在于：样品垫2用聚酯膜制 成，纤维素膜4采用羧化纤维素膜。检测样品、操作方法和结果判定同实施例一。
[0057] 实施例五：试纸结构和实施例一基本相同，不同之处在于：样品垫2用尼龙膜制 成，隐形质控印迹7用兔抗小鼠 IgG抗体溶液在纤维素膜上制成。检测样品、操作方法和结 果判定同实施例一。
[0058] 实施例六：本实用新型试纸的敏感性和特异性试验。
[0059] 敏感性：取十个梯度的β -conglycinin标准溶液，浓度分别为0ng/mL，50ng/mL， 100ng/mL，200ng/mL，400ng/mL，800ng/mL，1600ng/mL，3200ng/mL，6400ng/mL，12800ng/mL。 各取100 y L用实施例一中的试纸进行检测，IOmin后观察结果，以检测线显色结果评价试 纸的敏感性。结果表明，试纸的灵敏度可以达到l〇〇ng/mL。
[0060] 特异性：用该试纸检测分别检测高浓度的大豆凝集素、大豆Kunitz胰蛋白酶抑制 因子、花生凝集素、鸡卵清蛋白以及酪蛋白，浓度为20 μ g/mL，结果检测线均不显色，说明该 试纸与这几种致敏蛋白均没有交叉反应，具有良好的特异性。
【主权项】
1. 一种快速检测大豆致敏蛋白0-conglycinin的胶体金免疫层析试纸，底层为支撑 层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为样品垫、结合垫、纤维 素膜和吸水垫，其特征在于：在纤维素膜设有用P-conglycinin兔源多克隆抗体溶液喷点 的隐形检测线以及用羊抗小鼠IgG抗体或兔抗小鼠IgG抗体溶液喷点的隐形质控线；所述 结合垫吸附有胶体金纳米颗粒标记的0-conglycinin鼠源单克隆抗体。2. 根据权利要求1所述的免疫层析试纸，其特征是：所述支撑层用不吸水的韧性材 料制成；样品垫用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成；结合垫用玻璃纤维 棉、聚酯膜、醋酸纤维或尼龙膜制成。3. 根据权利要求1所述的免疫层析试纸，其特征是：所述纤维素膜用硝酸纤维素膜、纯 纤维素膜或羧化纤维素膜制成；吸水垫用吸水滤纸或滤油纸制成。4. 根据权利要求1所述的免疫层析试纸，其特征是：所述隐形检测线和隐形质控线为 平行排列的"II"直线式印记。5. 根据权利要求1-4任一项所述的免疫层析试纸，其特征是：在所述样品垫、结合垫及 吸水垫上覆盖有保护层，在样品垫与结合垫交界处对应的保护层上喷点有样品标记线。
【专利摘要】本实用新型涉及一种快速检测大豆致敏蛋白β-conglycinin的胶体金免疫层析试纸，该试纸基于双抗体夹心的原理检测β-conglycinin，试纸含有支撑层、吸附层、保护层，吸附层从测试端依次为样品垫、结合垫、纤维素膜和吸水垫，结合垫吸附有β-conglycinin的特异性抗体，纤维素膜设有用β-conglycinin兔源多克隆抗体溶液喷点的检测线以及用羊抗小鼠IgG抗体或兔抗小鼠IgG抗体溶液喷点的质控线，β-conglycinin的特异性抗体采用胶体金纳米颗粒标记的β-conglycinin鼠源单克隆抗体。本实用新型的免疫层析试纸特异性强、灵敏度高，检测简便、直观、准确，成本低，适用范围广，易于推广应用。
【IPC分类】G01N33/543, G01N33/558
【公开号】CN204903545
【申请号】CN201520487943
【发明人】胡骁飞, 王耀, 魏凤仙, 王方雨, 邢广旭, 孙亚宁
【申请人】河南省农业科学院
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年7月8日