一种基于微型阵列的高通量纳升电喷雾分析系统及其应用的制作方法

本发明属于质谱分析领域，特别涉及一种基于微型阵列的高通量纳升电喷雾分析系统及其应用。

背景技术：

传统的色谱-质谱联用的分析方法是通过复杂的样品前处理技术，将目标物从样品基质中萃取出来，然后将萃取物通过净化后，再进行仪器分析。常用的萃取方法包括固相萃取，液液萃取，固相微萃取，磁性萃取等技术，在基于此类技术的样品处理过程中，由于往往要经过多步处理，使用大量的有机试剂，会对环境造成污染；此外，对于小体积样品，复杂的处理过程往往会造成样品或者样品中目标物的损失或交叉污染等等问题，对于分析结果的准确度会有较大的影响，而且实验用时间较长，浪费人力和物力。

基于质谱直接分析的方法相对简单，能够有效地提高分析效率，如解吸电喷雾技术以及萃取电喷雾等。但是传统的反射式解吸电喷雾技术结构参数复杂，且不同类型的样品对于结构参数要求不同；透射式解吸电喷雾采用网式结构负载样品，虽然操作相对简单，但是存在样品表面浓度低和信号不稳定等缺点，有必要开发新的技术去提高表面的样品分子的浓度。纳升电喷雾直接分析技术虽然相对传统的电喷雾技术对于样品量需求少，但是样品转移和处理过程复杂，会带来样品的损失和可能的交叉污染，而且较难实现高通量分析。因此，急需建立一种适合小体积样品直接质谱分析的离子源装置，实现快速分析。

技术实现要素：

本发明的目的就是为了解决上述问题，提供一种基于微型漏斗阵列纳升级电喷雾质谱分析方法。本发明通过微针在膜表面制作漏斗装置进行喷雾研究，利用其对多肽，蛋白质，以及酶解样品进行了分析。

其基本原理如下：将小体积的液体样品直接加在样品承载器的微型漏斗(微漏斗)中，通过在质谱进样口设置加载高电压(-4.5kV)，产生一次喷雾，并在样品承载器漏斗中逐渐累积，形成高电荷液膜，液膜持续溶解和萃取漏斗表面沉积的待分析物，在电场的影响下，向质谱进样口方向移动，在孔口形成二次喷雾，带电离子进入质谱，采集获得谱图(如图1所示)。本装置样品在承载器表面浓度高，不仅增加了系统的灵敏度，而且具有较好的实用性，避免了复杂的参数优化过程和样品转移过程，通过发明的阵列制备方法，可以实现微漏斗阵列的快速制作，成本低，操作简单，适用于多肽/蛋白质分子，农药分子，聚合物以及糖类和抗生素分子的纳升电喷雾质谱分析。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于微型漏斗状样品承载器阵列的高通量纳升级电喷雾质谱分析装置，包括：电喷雾装置、质谱仪、漏斗状微型样品承载器/漏斗状微型样品承载器阵列、支架；在所述电喷雾的毛细管尖端与质谱仪进样口之间设置有漏斗状微型样品承载器/漏斗状微型样品承载器阵列，所述漏斗状微型样品承载器/漏斗状微型样品承载器阵列位于所述支架上；

其中，所述漏斗状微型样品承载器阵列由以环形阵列的方式均匀排布在同一平面上的所述微型漏斗状样品承载器组成。

优选的，所述漏斗状微型样品承载器(微漏斗)中心点与质谱进样口的距离S1、所述漏斗状微型样品承载器中心点与所述喷针(毛细管尖端)的距离S2，其中，S1/S2＝3～3.2：5～5.1。

上述的一次喷雾过程中，毛细管中需要加载溶剂，但是样品在漏斗中，抽取1mL溶剂(甲醇/水＝1：1方式)，也可以根据需要调整溶剂的类型。

优选的，所述漏斗状微型样品承载器孔口的直径小于<200μm。

本发明中所述“漏斗状微型样品承载器孔口的直径”是指：“微漏斗咀部较细小部份的端口直径”。

优选的，所述漏斗状微型样品承载器的轴心线与质谱仪进样口的中心线位于同一直线上。

优选的，所述漏斗状微型样品承载器的孔口突出处位于质谱仪进样口一侧；

优选的，所述漏斗状微型样品承载器的进样量为50～60nL。

本发明还提供了一种用于高通量纳升级电喷雾质谱分析的微型漏斗状样品承载器，所述漏斗状微型样品承载器为漏斗状，通过支架设置于高通量纳升级电喷雾质谱分析装置的电喷雾的毛细管尖端与质谱仪进样口之间。

优选的，所述漏斗状微型样品承载器孔口的直径小于<200μm；

优选的，所述漏斗状微型样品承载器中心点与质谱进样口的距离S1、所述漏斗状微型样品承载器中心点与所述喷针(毛细管尖端)的距离S2，其中，S1/S2＝3～3.2：5～5.1。

本发明还提供了一种用于高通量纳升级电喷雾质谱分析的微型漏斗状样品承载器的制备仪，包括：可水平移动的平台Ⅰ、膜支架、可垂直移动的平台Ⅱ、冲压针、步进电机以及控制器，其特征在于，所述膜支架安装在所述平台Ⅰ上，所述平台Ⅰ的上部设置有所述平台Ⅱ，所述平台Ⅱ上设置有所述冲压针，所述冲压针轴心线与所述平台Ⅰ相交且垂直于所述平台Ⅰ；工作时，通过所述步进电机和控制器控制平台Ⅰ和平台Ⅱ分别进行水平和垂直移动。

优选的，所述膜支架的底部还设置有中空的金属管。

本发明还提供了上述微型漏斗状样品承载器的制备方法，包括：

1)将膜基底固定于膜支架上，直接被安装在平台Ⅰ上；冲压针安装在平台Ⅱ上；

2)通过控制器控制平台Ⅰ、平台Ⅱ的移动，实现微漏斗的分离以及冲压针的冲压深度调控；

3)在膜基底的底部设置中空的金属管，来对接产生漏斗状样品承载器。

本发明还提供了一种基于微型漏斗状样品承载器阵列的高通量纳升级电喷雾质谱分析装置检测方法，包括：

1)采集质谱前，将样品稀释或者处理后，使用进样针将样品置于漏斗状微型样品承载器中，待分析；

2)漏斗状微型样品承载器与质谱仪对接；

3)采用质谱仪进行的样品采集和分析。

优选的，所述样品的进样量为50～60nL。

本发明的有益效果

(1)本发明利用微漏斗阵列作为纳升级样品的承载器。解决了小体积复杂基质样品中痕量目标物的快速分析的难题。对比传统的纳升级喷雾装置，具有操作简单，成本低廉等特点，对比传统解吸电喷雾技术，具有信号稳定，持续时间长，灵敏度高，拓展型强等优点，适用于多肽/蛋白质分子，农药分子，聚合物以及糖类分子的质谱分析。

(3)本发明装置结构简单、操作方便、检测效率高、实用性强，易于推广。

附图说明

图1微型漏斗直接电喷雾装置系统示意图；

其中，1.接地2.喷雾溶剂3.蠕动泵4.毛细管喷针5.主喷雾6.样品承载板7.微漏斗8.次级喷雾9.质谱进样口；

图2微型漏斗阵列；

图3微型漏斗阵列制作装置；

其中，a.摄像头b.步进电机c.冲压针d.阵列支架e.顶针f.步进电机；

图4微型固相萃取阵列纳升电喷雾分析方法的应用：(a)500fmol溶菌酶的质谱图；(b)1pmol碳酸酐酶的质谱图；(c)500fmol牛血清白蛋白的质谱图；

图5微型固相萃取阵列纳升电喷雾分析方法的应用：(a)牛胰岛素B链的质谱图；(b)细胞色素c的质谱图；

图6微型固相萃取阵列纳升电喷雾分析方法的应用：(a)克伦特罗的质谱图；(b)马拉硫磷的质谱图，(c)麦芽三糖的质谱图，(d)聚乙二醇-1000的质谱图。

图7微型阵列纳升电喷雾分析方法采集的氧氟沙星质谱图。

图8微型阵列纳升电喷雾与传统解吸电喷雾的多肽(SubP)信号比较。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明特征及其它相关特征作进一步详细说明，以便于同行业技术人员的理解：

实施例1

一种基于微型漏斗直接电喷雾质谱分析方法。所述装置由一个平台、膜支架d、汉针c、步进电机b、f以及控制器和质谱组成。装置的设计步骤如下：

(1)基于膜漏斗型样品承载器的喷雾分析源制作方法如下：将柔性胶粘膜被固定于塑料支架d上，直接被安装在一个二维的移动自动平台上，同时具备一个水平调节系统。冲压汉针c安装在垂直移动的平台上，机动平台通过一个自制的软件程序控制,实现其微漏斗的分离以及控制冲压针c的冲压深度。将柔性胶粘膜在制作过程中可能会变形，导致微漏斗存在差别。为了保证冲压针c制备的开口的均匀性，中空的金属管/顶针e置于底部用来对接柔性膜漏斗。

(2)基于膜漏斗型样品承载器的喷雾分析源-质谱对接：装置由一个平台，样品支架和喷雾系统构成。完成样品转移后，微型膜负载固相萃取池系统被安置在支架台上。采用手动的线性移动台和二轴电动平台用来调整和校准萃取池开口和质谱进样口9的距离和位置。喷雾系统喷针4由石英毛细管组成(内经50μm，外径150μm)。连接于一个三维的可移动平台来调整其位置。蠕动泵3接于石英毛细管用来产生喷雾。喷针4喷雾处外接摄像头用来监视离子源的喷雾状况，并确保一次喷雾的稳定性和持续性。

(3)质谱条件：采用傅立叶变化离子回旋共振质谱仪。利用电喷雾，流速设定为30uL/hr的，分别采用正负两种模式进行离子化，毛细管电压设为3kV，传输毛细管的温度为220℃。采用前端四极杆进行母离子选择，质量宽度设为5m/z，离子聚集时间设置为1-2s。采用宽带模式进行数据采集，质量范围设为50-1000。

1、仪器和试剂

所有的试剂均为购买，使用前进行进一步的处理。实验用蛋白质/多肽(包括Angiotensin II,Insulin chain B oxidized,Ubiquitin,Cytochrome c,Lysozyme,Carbonic anhydrase,Bovine serum albumin(BSA))以及胰蛋白酶购买于Sigma Aldrich(St.Louis,MO,USA).乙酸和碳酸氢铵购买于Riedel-de Han(Seelze,Germany).HPLC级别的甲醇由Labscan(Bangkok,Thailand)提供.Parafilm“M”膜(Pechiney Plastic Packaging,Chicago,IL,USA)用作微型膜负载固相萃取池的制作材料.FTICR-MS(4.7Tesla APEX III和9.4Tesla Solarix,Bruker Instrument Inc.,Billerica,MA)进行的样品采集和分析，样品采用(Model 7000.5KH SYR,Hamilton Company,Switzerland)进行转移处理。

2、样品准备

样品储存液由水或者甲醇-水(1:1体积比)配置，在实验前，根据需要稀释成相应的浓度。酶解实验通过溶解蛋白质/多肽于100mM的碳酸氢铵溶液中。胰蛋白酶溶于50mM的乙酸中。按照1:50比例混合两种溶液，至于37℃恒温过夜。酶解过程通过添加10％的乙酸溶液终止。蛋白质/多肽的混合液最终浓度为100μM。实验前再做进一步的稀释。50nL的样品通过进样针置于阵列微型漏斗7内待分析；其他样品稀释至所需浓度后，直接加载于阵列中进行质谱分析。

3、基于膜漏斗型样品承载器的喷雾分析源-质谱对接见发明内容部分。

4、质谱系统

采用FTICR-MS(4.7Tesla APEX III和9.4Tesla Solarix,Bruker Instrument Inc.,Billerica,MA)进行的样品采集和分析。典型的设置为N2(at～150to 250℃)用来加热毛细管和辅助去喷雾液滴溶剂化。产生的离子在六极杆内累积1-2s后进入质量分析器。数据采集以5-20次的信号合计。

5、应用

采用9.4T FTICR-MS结合微型固相萃取阵列-直接离子化质谱分析方法在生物分子分析应用方面进行了研究。如图4(a)500fmol溶菌酶的质谱图；(b)1pmol碳酸酐酶的质谱图；(c)500fmol牛血清白蛋白的质谱图；图5微型固相萃取阵列纳升电喷雾分析方法的应用：(a)牛胰岛素B链的质谱图；(b)细胞色素c的质谱图；图6微型固相萃取阵列纳升电喷雾分析方法的应用：(a)克伦特罗的质谱图；(b)马拉硫磷的质谱图，(c)麦芽三糖的质谱图，(d)聚乙二醇-1000的质谱图。可见本装置可以应用于农药分子，聚合物分子以及多肽/蛋白质等生物分子的质谱分析。

实施例2

一种基于微型漏斗状样品承载器阵列的高通量纳升级电喷雾质谱分析装置，包括：电喷雾装置、质谱仪、漏斗状微型样品承载器(微漏斗)7、支架(样品承载板)6；在所述电喷雾的毛细管(毛细管喷针)4尖端与质谱仪进样口9之间设置有漏斗状微型样品承载器7，所述漏斗状微型样品承载器7位于所述支架6上。

实施例3

一种基于微型漏斗状样品承载器阵列的高通量纳升级电喷雾质谱分析装置，包括：电喷雾装置、质谱仪、漏斗状微型样品承载器(微漏斗)7、支架(样品承载板)6；在所述电喷雾的毛细管(毛细管喷针)4尖端与质谱仪进样口9之间设置有漏斗状微型样品承载器7，所述漏斗状微型样品承载器7位于所述支架6上。

所述漏斗状微型样品承载器7中心点与质谱进样口9的距离S1、所述漏斗状微型样品承载器7中心点与所述喷针(毛细管尖端)4的距离S2，其中，S1/S2＝3～3.2：5～5.1。

实施例4

一种基于微型漏斗状样品承载器阵列的高通量纳升级电喷雾质谱分析装置，包括：电喷雾装置、质谱仪、漏斗状微型样品承载器(微漏斗)7、支架(样品承载板)6；在所述电喷雾的毛细管(毛细管喷针)4尖端与质谱仪进样口9之间设置有漏斗状微型样品承载器7，所述漏斗状微型样品承载器7位于所述支架6上。

所述漏斗状微型样品承载器7孔口的直径小于<200μm。

实施例5

一种基于微型漏斗状样品承载器阵列的高通量纳升级电喷雾质谱分析装置，包括：电喷雾装置、质谱仪、漏斗状微型样品承载器(微漏斗)7、支架(样品承载板)6；在所述电喷雾的毛细管(毛细管喷针)4尖端与质谱仪进样口9之间设置有漏斗状微型样品承载器7，所述漏斗状微型样品承载器7位于所述支架6上。

所述漏斗状微型样品承载器7的轴心线与质谱仪进样口9的中心线位于同一直线上。

实施例6

一种基于微型漏斗状样品承载器阵列的高通量纳升级电喷雾质谱分析装置，包括：电喷雾装置、质谱仪、漏斗状微型样品承载器(微漏斗)7、支架(样品承载板)6；在所述电喷雾的毛细管(毛细管喷针)4尖端与质谱仪进样口9之间设置有漏斗状微型样品承载器7，所述漏斗状微型样品承载器7位于所述支架6上。

所述漏斗状微型样品承载器7的孔口突出处位于质谱仪进样口9一侧。

实施例7

一种基于微型漏斗状样品承载器阵列的高通量纳升级电喷雾质谱分析装置，包括：电喷雾装置、质谱仪、漏斗状微型样品承载器(微漏斗)7、支架(样品承载板)6；在所述电喷雾的毛细管(毛细管喷针)4尖端与质谱仪进样口9之间设置有漏斗状微型样品承载器7，所述漏斗状微型样品承载器7位于所述支架6上。

所述漏斗状微型样品承载器7的进样量为50～60nL。

实施例8

一种基于微型漏斗状样品承载器阵列的高通量纳升级电喷雾质谱分析装置，包括：电喷雾装置、质谱仪、漏斗状微型样品承载器阵列、支架(样品承载板)6；在所述电喷雾的毛细管(毛细管喷针)4尖端与质谱仪进样口9之间设置有漏斗状微型样品承载器阵列，所述漏斗状微型样品承载器阵列位于所述支架6上；

其中，所述漏斗状微型样品承载器阵列由以环形阵列的方式均匀排布在同一平面上的所述微型漏斗状样品承载器7组成。

实施例9

一种基于微型漏斗状样品承载器阵列的高通量纳升级电喷雾质谱分析装置，包括：电喷雾装置、质谱仪、漏斗状微型样品承载器阵列、支架(样品承载板)6；在所述电喷雾的毛细管(毛细管喷针)4尖端与质谱仪进样口9之间设置有漏斗状微型样品承载器阵列，所述漏斗状微型样品承载器阵列位于所述支架6上；

所述漏斗状微型样品承载器阵列中心点与质谱进样口9的距离S1、所述漏斗状微型样品承载器阵列中心点与所述喷针(毛细管尖端)4的距离S2，其中，S1/S2＝3～3.2：5～5.1。

实施例10

一种基于微型漏斗状样品承载器阵列的高通量纳升级电喷雾质谱分析装置，包括：电喷雾装置、质谱仪、漏斗状微型样品承载器阵列、支架(样品承载板)6；在所述电喷雾的毛细管(毛细管喷针)4尖端与质谱仪进样口9之间设置有漏斗状微型样品承载器阵列，所述漏斗状微型样品承载器阵列位于所述支架6上；

所述漏斗状微型样品承载器阵列中各孔口的直径皆小于<200μm。

实施例11

一种基于微型漏斗状样品承载器阵列的高通量纳升级电喷雾质谱分析装置，包括：电喷雾装置、质谱仪、漏斗状微型样品承载器阵列、支架(样品承载板)6；在所述电喷雾的毛细管(毛细管喷针)4尖端与质谱仪进样口9之间设置有漏斗状微型样品承载器阵列，所述漏斗状微型样品承载器阵列位于所述支架6上；

所述漏斗状微型样品承载器阵列的轴心线与质谱仪进样口9的中心线位于同一直线上。

实施例12

一种基于微型漏斗状样品承载器阵列的高通量纳升级电喷雾质谱分析装置，包括：电喷雾装置、质谱仪、漏斗状微型样品承载器阵列、支架(样品承载板)6；在所述电喷雾的毛细管(毛细管喷针)4尖端与质谱仪进样口9之间设置有漏斗状微型样品承载器阵列，所述漏斗状微型样品承载器阵列位于所述支架6上；

所述漏斗状微型样品承载器阵列的各孔口突出处皆位于质谱仪进样口9一侧。

实施例13

一种基于微型漏斗状样品承载器阵列的高通量纳升级电喷雾质谱分析装置，包括：电喷雾装置、质谱仪、漏斗状微型样品承载器阵列、支架(样品承载板)6；在所述电喷雾的毛细管(毛细管喷针)4尖端与质谱仪进样口9之间设置有漏斗状微型样品承载器阵列，所述漏斗状微型样品承载器阵列位于所述支架6上；

所述漏斗状微型样品承载器阵列中各微漏斗7的进样量皆为50～60nL。

实施例14

一种用于高通量纳升级电喷雾质谱分析的微型漏斗状样品承载器，所述漏斗状微型样品承载器7为漏斗状，通过支架(样品承载板)6设置于高通量纳升级电喷雾质谱分析装置的电喷雾的毛细管(毛细管喷针)4尖端与质谱仪进样口9之间。

实施例15

一种用于高通量纳升级电喷雾质谱分析的微型漏斗状样品承载器，所述漏斗状微型样品承载器7为漏斗状，通过支架(样品承载板)6设置于高通量纳升级电喷雾质谱分析装置的电喷雾的毛细管(毛细管喷针)4尖端与质谱仪进样口9之间。

所述漏斗状微型样品承载器7孔口的直径小于<200μm；

实施例16

一种用于高通量纳升级电喷雾质谱分析的微型漏斗状样品承载器，所述漏斗状微型样品承载器7为漏斗状，通过支架(样品承载板)6设置于高通量纳升级电喷雾质谱分析装置的电喷雾的毛细管(毛细管喷针)4尖端与质谱仪进样口9之间。

所述漏斗状微型样品承载器7中心点与质谱进样口9的距离S1、所述漏斗状微型样品承载器7中心点与所述喷针(毛细管尖端)4的距离S2，其中，S1/S2＝3～3.2：5～5.1。

实施例17

一种用于高通量纳升级电喷雾质谱分析的微型漏斗状样品承载器的制备仪，包括：可水平移动的平台Ⅰ、膜支架(阵列支架)d、可垂直移动的平台Ⅱ、冲压针c、步进电机b、f以及控制器，所述膜支架d安装在所述平台Ⅰ上，所述平台Ⅰ的上部设置有所述平台Ⅱ，所述平台Ⅱ上设置有所述冲压针c，所述冲压针c轴心线与所述平台Ⅰ相交且垂直于所述平台Ⅰ；工作时，通过所述步进电机b、f和控制器控制平台Ⅰ和平台Ⅱ分别进行水平和垂直移动。

实施例18

一种用于高通量纳升级电喷雾质谱分析的微型漏斗状样品承载器的制备仪，包括：可水平移动的平台Ⅰ、膜支架(阵列支架)d、可垂直移动的平台Ⅱ、冲压针c、步进电机b、f以及控制器，所述膜支架d安装在所述平台Ⅰ上，所述平台Ⅰ的上部设置有所述平台Ⅱ，所述平台Ⅱ上设置有所述冲压针c，所述冲压针c轴心线与所述平台Ⅰ相交且垂直于所述平台Ⅰ；工作时，通过所述步进电机b、f和控制器控制平台Ⅰ和平台Ⅱ分别进行水平和垂直移动。

所述膜支架d的底部还设置有中空的金属管(顶针)e。

实施例19

一种微型漏斗状样品承载器的制备方法，包括：

1)将膜基底固定于膜支架d上，直接被安装在平台Ⅰ上；冲压针c安装在平台Ⅱ上；

2)通过控制器控制平台Ⅰ、平台Ⅱ的移动，实现微漏斗的分离以及冲压针c的冲压深度调控；

3)在膜基底的底部设置中空的金属管(顶针)e，来对接产生漏斗状样品承载器。

实施例20

一种基于微型漏斗状样品承载器阵列的高通量纳升级电喷雾质谱分析装置检测方法，包括：

1)采集质谱前，将样品稀释或者处理后，使用进样针将样品置于漏斗状微型样品承载器中，待分析；

2)漏斗状微型样品承载器与质谱仪对接；

3)采用质谱仪进行的样品采集和分析。

实施例21

一种基于微型漏斗状样品承载器阵列的高通量纳升级电喷雾质谱分析装置检测方法，包括：

1)采集质谱前，将样品稀释或者处理后，使用进样针将样品置于漏斗状微型样品承载器中，待分析；

2)漏斗状微型样品承载器与质谱仪对接；

3)采用质谱仪进行的样品采集和分析。

其中，所述样品的进样量为50～60nL。

最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。