贝的外套膜组织游离细胞，其中含有外套膜表皮细胞和结缔组织细胞等构建珍珠囊所需的各种细胞。
[0045]7.将细胞浓度稀释至约5X 106细胞/mL，滴在珠核表面上，使细胞尽量均匀分布在整个珠核表面，然后将珠核放置于一种带有半球形凹槽的培养器皿中，缓慢加入少量含
20vol %蚌血清的1640培养液，尽量不要搅动细胞，使整个珠核浸泡在培养液中，于26°C恒温培养箱中培养2~4小时，使细胞贴附于支架材料上，然后再在培养皿中补加入新的培养液，使液面覆盖珠核2 mm以上。在26°C培养约3~5天，期间当培养液略变黄色时需更换培养液。在显微镜下检查，见细胞已大量增殖，组织工程支架纤维上充斥着大量细胞时，停止培养，倒去培养液，用PBS缓冲液冲洗珠核，去除未粘附在组织工程支架上的细胞。
[0046]8.将上述处理的珠核按常规有核珍珠培育方法进行插核处理、育珠蚌培育。
[0047]9.采用本方法试验培育100只育珠蚌，养殖2年，11例死亡，无一例发生吐核，收获的89粒珍珠87粒为圆形或近圆形珍珠，而对照组采用未含组织工程支架的普通珠核，100例死亡8例，13例发生吐核，圆形及近圆形珠仅有26粒。
[0048]参考文献
1.刘万磊.水生无脊椎动物细胞培养[J]。细胞生物学杂志，2006，28( 2): 173 —
178.2.李倩，施志仪，李文娟.三角帆蚌外套膜细胞体外培养优化及体内植入培养对细胞生长的影响[J].中国水产科学，2014，21 (2): 225 - 234.3.钱伟平，许梓荣，张明霞，等。注射法培育三角帆蚌有核珍珠的研究[J]。浙江农业学报，2002，14(2):82 ?86。
[0049]上述实施例只是本发明的部分实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，任何依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。
【主权项】
1.一种外套膜游离细胞与组织工程支架珠核在体外共培养后植核培育珍珠的方法，其特征是，将珍珠贝的外套膜组织用酶消化法分离成单个存在的游离细胞，配制成一定细胞密度的细胞悬液；在植入育珠蚌的珠核表面粘附一层厚度基本均匀的高分子聚合物组织工程支架，与游离的珍珠贝外套膜细胞在体外一起培养，使外套膜细胞粘附在珍珠核表面的组织工程支架纤维中分裂生长，待细胞在组织工程支架中生长、增殖，围绕珠核表面形成一个细胞基本均匀分布的珍珠囊后，将珠核移植到育珠蚌体内，在珍珠养殖场中养殖培养珍珠。2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，包括以下步骤: (1)在珠核表面粘附一层多聚赖氨酸膜:将打磨好的普通珍珠核高压灭菌处理，放入0.01wt %~0.1 wt %的多聚赖氨酸溶液或胶原蛋白中浸泡10~30分钟，取出，无菌条件下晾干； (2)制备珠核组织工程支架层模具:所述模具由模具I和模具II组成，模具I由两个结构一样的中空半球构成，每个半球的内侧面有3条突起的棱，其中2条棱分别位于半球两侧边缘，另一条棱位于半球的中间，棱的长度为球体周长的1/2，3条棱的末端在球的南北极端相交，南极端相交处的棱切除部分形成凹口作为注胶孔，棱的高度(H)为0.02~2mm，边缘棱宽度为中间棱的一半；棱的作用在于支撑珍珠核，使将珍珠核放入模具后珍珠核与半球内面之间的高度一致，棱的高度(H)就是要填充的组织工程支架的厚度；使用时，先将珍珠核放入一个半球中，然后将另一半球合拢，两个半球的边缘棱在两半球合拢后其侧面拼接在一起合为一条宽度与中间棱宽度一样的棱，两个半球合拢成一个球体，棱一端的球面是封闭的，而位于另一端的球面处留出一小孔作为注胶孔用于灌注组织工程支架液，此端对接处的棱切除部分，留出孔道使组织工程支架液能从此孔道同时灌注到模具中被棱隔开的4个空间中；模具I用于完成珍珠核组织工程支架制备的第一步，得到有凹槽的组织工程支架珍珠核； 模具II由两个中空的半球组成，其内侧表面无突起结构，半球内径为珍珠核直径和模具I棱高度的2倍之和，两半球合拢后留有一注胶孔用于灌注组织工程支架液，利用模具II完成凹槽的填补，得到组织工程支架层厚度相同的球形组织工程支架珍珠核； (3)无菌条件下配制组织工程支架液:无菌条件下将胶原蛋白配制成浓度为1.0wt%~3.0wt%的溶液，待胶原蛋白完全溶解后向其中加入2.5vol%的戊二醛溶液作为交联剂，使戊二醛终浓度为0.01vol%~0.05vol%，搅拌均匀； (4)支架制备:先将步骤(1)晾干好的珠核放置于模具I中，将步骤⑶制备的胶原蛋白液灌注入模具，振荡摇匀10分钟，室温下静置2~12小时使胶原蛋白交联，降温至4°C、10分钟后使珠核脱模；然后打开模具取出珠核，再放置入模具II中，使组织工程支架的凹槽的凹口处对准注胶孔，再注入步骤(3)制备的液态胶原蛋白溶液，以使第一次注胶时留下的凹槽填满胶原蛋白液，室温下静置2~12小时使胶原蛋白交联；然后取出，将注胶孔处的表面磨平，在一 20 °C条件下放置1~6小时冷冻成型，然后放入冷冻干燥机中真空干燥2~24小时，真空度为12~20 Pa，冻干温度为一 20~ — 70°C;将珠核浸泡于蒸馏水中洗去残留的戊二醛； (5)外套膜游离细胞获取:清洗蚌壳，撕取珍珠蚌的外套膜组织，切除边缘色线部分，洗涤消毒后剪成约1_2小块，采用胰酶消化法消化组织块，通常采用0.25 wt %的胰酶，在25~37°C范围内消化0.5~4小时，用200目絹网过滤去除残留的组织块，lOOOr/分钟离心分离出细胞，加入培养液吹散细胞沉淀，得到珍珠贝的外套膜组织游离细胞； (6)将步骤⑷处理后的珠核与外套膜分离的游离细胞一起在恒温培养箱中体外培养，培养液为完全培养液，采用RPM1640或M199或DMEM，加入10~30 wt %的血清，血清采用蚌血清、孕马血清或牛血清；培养温度26~37°C，培养时间3~6天，其间多次更换培养液以保证细胞分裂生长，细胞贴附在珠核表面的组织工程支架层中分裂增殖2~6次，使组织工程支架空间中充满细胞； (7)倒去培养液，用PBS缓冲液冲洗珠核，去除未粘附在组织工程支架上的细胞，然后直接将珠核植入育珠蚌体内的植核位置，按常规有核珍珠培育方法培育珍珠。3.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的高分子聚合物指的是生物可降解天然高分子材料和生物可降解的合成高分子材料，所述的生物可降解天然高分子材料，包括胶原蛋白、明胶、海藻酸钠、纤维蛋白、琼脂糖、壳聚糖、透明质酸或它们与其他材料组成的复合物；所述生物可降解的合成高分子材料，包括聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)和聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚乙烯醇(PVA)或它们与其他材料组成的复合物。
【专利摘要】本发明公开一种外套膜游离细胞与组织工程支架珠核在体外共培养后植核培育珍珠的方法，将珍珠贝的外套膜组织用酶消化法分离成单个存在的游离细胞，配制成一定细胞密度的细胞悬液；在植入育珠蚌的珠核表面粘附一层厚度基本均匀的高分子聚合物组织工程支架，与游离的珍珠贝外套膜细胞在体外一起培养，使外套膜细胞粘附在珍珠核表面的组织工程支架纤维中分裂生长，待细胞在组织工程支架中生长、增殖，围绕珠核表面形成一个细胞基本均匀分布的珍珠囊后，将珠核移植到育珠蚌体内，在珍珠养殖场中养殖培养珍珠。本发明解决了传统外套膜细胞小片植入法存在的细胞在珠核周围迁移后分布不均匀导致异形珍珠的问题，也使得珍珠核与育珠蚌的相容性很好。
【IPC分类】A01K61/00
【公开号】CN105309345
【申请号】CN201510304765
【发明人】林尧, 肖义军, 黄义德, 陈元仲, 王正朝, 肖宽诚
【申请人】福建师范大学
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2015年6月7日