外套膜游离细胞与组织工程支架珠核在体外共培养后植核培育珍珠的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种有核珍珠的培育方法，具体的说，涉及一种表面包裹有组织工程支架的珠核在有核珍珠培育中的应用。
【背景技术】
[0002]组织工程支架是人工合成的具有三维结构的适合细胞生长的框架，它模拟机体组织中细胞外基质的作用，使细胞能在这种三维结构上黏附、迀移、增殖，最终使组织得以重建。制备组织工程支架常用的材料有生物活性陶瓷、可降解高分子材料等。可降解的高分子材料可分为天然高分子材料和人工合成高分子材料。
[0003]目前有核珍珠的培养通常都是将外套膜细胞小片与珍珠核一起植入育珠蚌的插核部位，然后放入养殖场所中养殖。在珍珠蚌体内，从外套膜细胞小片游离出来的外表皮细胞会逐渐迀移至珍珠核表面，结缔组织细胞等一些其他类型细胞则围绕在外表皮细胞周围，并与育珠蚌自身的结缔组织之间建立连接，围绕珍珠核形成珍珠囊，外表皮细胞(可能还有分泌细胞等其他细胞)分泌珍珠质形成珍珠。这种方法由于开始时细胞小片只贴于珍珠核的一侧，在细胞迀移过程中，外套膜细胞容易在珍珠核周围分布不均，很多时候细胞小片所在位置的细胞大量堆积，已经开始珍珠质，但珍珠核远离细胞小片的部位细胞尚未迀徙到，导致培育的珍珠形状、色泽不均匀，圆形珍珠数量少，大量存在尾巴珠、瑕疵珠等问题，优质珍珠生产率低。我国是珍珠养殖大国，珍珠产量占全世界95%，但价值只占8%不到，原因就是我国生产的高质量珍珠少，一、二、三等珠仅占20 %左右，其中一等珠不足3 %。
[0004]为解决这个问题，对比文献1 “一种基于珍珠贝外套膜细胞培养生产珍珠的方法”(发明专利号:201310280635.7)公布了一种培养外套膜细胞后直接注入育珠蚌外套膜结缔组织部位培养珍珠的方法。但贝类生物的细胞体外大量和长期培养目前在技术上还存在很大困难(参考文献1，2)，该技术描述的在体外培养细胞传代45代技术上难以实现。通常细胞会随着分裂次数的增加而逐渐衰老直至凋亡。贝类生物的体细胞在体外培养条件下一般生存期不会超过30天左右。对比文献2 “游离细胞植入法培育有核珍珠”(发明专利号::200510110378.8)公布了一种通过将外套膜细胞与珍珠核共培养，使得外套膜细胞粘附在珍珠核的表面，然后将粘附了外套膜细胞的珍珠核插入育珠蚌的插核部位来培养珍珠。此方法存在以下3方面问题:⑴能贴附于珠核表面生长的细胞只有表皮上皮细胞，但珍珠囊的形成也需要来自外套膜的结缔组织细胞(参考文献3);⑵正常上皮细胞在人工培养的条件下只能贴壁生长成单层，细胞量过少。因此该发明通过在插核前后再另外滴入大量细胞液来解决细胞量不足和细胞种类单一的问题。⑶该方法还存在细胞无法贴附到珠核与培养皿的接触面，因此珠核表面存在无细胞区域的问题；此外球形珠核容易滚动，易于与其他珠核碰撞导致细胞损伤脱落(参考文献3)等问题。
[0005]本发明通过在普通珍珠核的外表面制备一层厚度均匀的可降解组织工程支架，在体外与自珍珠贝外套膜分离的游离细胞共培养，使外套膜细胞贴附在组织工程支架的纤维上生长分裂增殖，由于正常细胞沿贴附面呈单层生长的特点，这些粘附在外套膜上皮细胞和结缔组织细胞，会沿着支架材料纤维平铺分裂生长，在珍珠核周围厚度一样的支架中形成比较均匀的分布，围绕珠核形成一个细胞均匀分布的珍珠囊，然后将其植入育珠蚌中培育珍珠，这样的珠核在植入育珠蚌之前表面已形成了一个细胞均匀分布的珍珠囊，无需再另外植入外套膜细胞小片。由于珠核周围外套膜表皮细胞分布均匀，使得珠核周围新形成的珍珠层厚度一致。克服了细胞小片植入法存在的外套膜细胞在珠核周围分布不均，导致培育的珍珠形状、色泽不均匀的问题，达到生产优质珍珠的目的。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种表面粘附有组织工程支架的珠核在培育有核珍珠中的应用方法。通过在珍珠核的表面先覆盖一层可降解高分子聚合物作为组织工程支架，在珠核表面造成一个可以容纳细胞在其中大量生长的立体网络空间，然后在体外与分离的外套膜游离细胞共培养，使得培养的外套膜中各种细胞(例如表皮细胞、结缔组织细胞等)可以贴附在在珍珠核表面的组织工程支架纤维中分裂生长，待细胞在组织工程支架中增殖分裂围绕珠核形成一个细胞均匀分布的珍珠囊后，将珠核移植到育珠蚌体内培养珍珠。本发明通过体外培养在珠核表面形成一个具有类似珍珠蚌外套膜组织结构的珍珠囊，解决了对比文献2 “游离细胞植入法培育有核珍珠”(发明专利号::200510110378.8)的方法珠核表面只能覆盖单层上皮细胞的问题。使得珍珠核与育珠蚌的相容性更好，不易吐核；珠核周围均匀分布的外套膜表皮细胞使得培养出的珍珠基本为正圆形珠，珍珠表面珍珠质分布均匀。
[0007]为了实现上述发明目的，本发明采用了以下技术方案:本发明所述的一种外套膜游离细胞与组织工程支架珠核在体外共培养后植核培育珍珠的方法，其特征是，将珍珠贝的外套膜组织用酶消化法分离成单个存在的游离细胞，配制成一定细胞密度的细胞悬液；在植入育珠蚌的珠核表面粘附一层厚度基本均匀的高分子聚合物组织工程支架，与游离的珍珠贝外套膜细胞在体外一起培养，使外套膜细胞粘附在珍珠核表面的组织工程支架纤维中分裂生长，待细胞在组织工程支架中生长、增殖，围绕珠核表面形成一个细胞基本均匀分布的珍珠囊后，将珠核移植到育珠蚌体内，在珍珠养殖场中养殖培养珍珠。
[0008]本发明所述的方法，包括以下步骤:
(1)在珠核表面粘附一层多聚赖氨酸膜:将打磨好的普通珍珠核高压灭菌处理，放入
0.01 wt %~0.1 wt %的多聚赖氨酸溶液或胶原蛋白中浸泡10~30分钟，取出，无菌条件下晾干；
(2)制备珠核组织工程支架层模具:所述模具由模具I和模具II组成，模具I由两个结构一样的中空半球构成，每个半球的内侧面有3条突起的棱，其中2条棱分别位于半球两侧边缘，另一条棱位于半球的中间，棱的长度为球体周长的1/2，3条棱的末端在球的南北极端相交，南极端相交处的棱切除部分形成凹口作为注胶孔，棱的高度(H)为0.02~2mm，边缘棱宽度为中间棱的一半；棱的作用在于支撑珍珠核，使将珍珠核放入模具后珍珠核与半球内面之间的高度一致，棱的高度(H)就是要填充的组织工程支架的厚度；使用时，先将珍珠核放入一个半球中，然后将另一半球合拢，两个半球的边缘棱在两半球合拢后其侧面拼接在一起合为一条宽度与中间棱宽度一样的棱，两个半球合拢成一个球体，棱一端的球面是封闭的，而位于另一端的球面处留出一小孔作为注胶孔用于灌注组织工程支架液，此端对接处的棱切除部分，留出孔道使组织工程支架液能从此孔道同时灌注到模具中被棱隔开的4个空间中；模具I用于完成珍珠核组织工程支架制备的第一步，得到有凹槽的组织工程支架珍珠核；
模具II由两个中空的半球组成，其内侧表面无突起结构，半球内径为珍珠核直径和模具I棱高度的2倍之和，两半球合拢后留有一注胶孔用于灌注组织工程支架液，利用模具
II完成凹槽的填补，得到组织工程支架层厚度相同的球形组织工程支架珍珠核；
(3)无菌条件下配制组织工程支架液:无菌条件下将胶原蛋白配制成浓度为1.0wt%~3.0wt%的溶液，待胶原蛋白完全溶解后向其中加入2.5vol%的戊二醛溶液作为交联剂，使戊二醛终浓度为0.01vol%~0.05vol%，搅拌均匀；
(4)支架制备:先将步骤(1)晾干好的珠核放置于模具I中，将步骤⑶制备的胶原蛋白液灌注入模具，振荡摇匀10分钟，室温下静置2~12小时使胶原蛋白交联，降温至4°C、10分钟后使珠核脱模；然后打开模具取出珠核，再放置入模具II中，使组织工程支架的凹槽的凹口处对准注胶孔，再注入步骤(3)制备的液态胶原蛋白溶液，以使第一次注胶时留下的凹槽填满胶原蛋白液，室温下