利用高温与微波技术共同辅助生物酶水解竹粉的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用高温与微波技术共同辅助生物酶水解竹粉的方法，其步骤为：毛竹研磨成粉烘干，过筛，对竹粉进行有机抽提，抽提后的竹粉经去离子水清洗、自然风干后定为原竹粉，作为对照样；再经过先高温处理，后微波处理的工艺。经过高温与微波共同处理的竹粉表面的酶附着位点增加且竹粉内部分子结构有所改变，这就使生物酶可以更好的与竹粉接触并更易进入竹粉内部，生物酶水解竹粉效率提高，酶用量减少，成本降低。
【专利说明】
利用高温与微波技术共同辅助生物酶水解竹粉的方法
技术领域
[0001]本发明涉及生物酶对竹粉的水解，具体为利用高温与微波技术共同辅助生物酶水解竹粉的方法。属于生物酶水解木质纤维素领域。【背景技术】
[0002]竹子因种植广泛，生长周期短，可再生能力强等特点而作为一种资源逐渐被人们研究与应用。例如从竹材中获取的竹纤维具有天然抗菌，防紫外，吸湿快干等优点备受人们青睐。目前竹纤维制备方法主要有物理法、化学法、生物法及三种方法互相联合。为响应保护环境的号召，生物酶法成为了制备竹纤维的提倡方法。
[0003]竹材和所有的木质纤维素生物质相同，具有纤维素、半纤维素和木质纤维素三大部分，且这三种主要物质相互间的结构较为复杂。它们互相缠绕的结构导致在使用生物酶水解竹材时，生物酶很难进入竹材内部，水解效率难以得到提高。因此，在生物酶水解竹材之前，采用高温和微波共同处理竹材，以改变竹材结构，提高生物酶的吸附，增加生物酶水解还原糖的产量。
[0004]高温热处理作为一种传统的处理方法，加热时采用直接或间接的热源对容器内的物料进行加热，加热的效率主要由加热源的强度、环境对流、容器导热特性和加热材料的传导热的特性决定的。木质纤维素生物质在高温高压条件下及水环境中体积得到一定程度的膨胀，水的沸腾以及高温高压条件下产生的水蒸气，将毛竹的分子内氢键断裂和超分子结构破坏。竹材体积的膨胀及内部结构的改变增加了生物酶的附着位点，生物酶水解效率也就会有相应的提尚。
[0005]微波是一种厘米级的电磁波，又被叫为厘米波，频率范围一般为300MHz?300GHz， 一般可以采用2.45GHz进行微波处理，对应的波长为12.25cm。微波加热是通过与反应体系内的极性分子发生耦合作用，达到加热材料的效果，加热中容器常为玻璃等透波材料，可以形成与传导加热相反的温度梯度。微波预处理的条件相对比较温和，反应不需要高温高压， 常压下即可进行，相对的安全系数比较高，能耗比较小。而且不需要添加化学试剂，反应时间相对较短，不需要升压升温，节省了成本。经微波处理后的竹粉结构蓬松，毛竹内的晶质与非晶质(有序及无序)状态的分子的氢键断裂，同时毛竹粉末溶胀吸水，毛竹内部的羟基进一步展开，超分子结构被打开，可及度增加，为后续酶的作用提供了更多的作用位点。
[0006]本发明充分利用高温和微波技术各自作用于竹粉时的优点，将两者结合共同处理竹粉，以辅助生物酶水解竹粉，提高生物酶水解竹粉效率。
【发明内容】
[0007]本发明的发明目的是为了提供一种利用高温与微波技术共同辅助生物酶水解竹粉的方法。以提高生物酶水解竹粉效率，降低竹纤维生产成本。
[0008]本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:
[0009]—种利用高温与微波技术共同辅助生物酶水解竹粉的方法，其步骤为:
[0010](1) 一年生毛竹研磨成粉烘干，过100目筛，用甲苯和乙醇按体积比1:2混合，对竹粉进行有机抽提，抽提后的竹粉经去离子水清洗、自然风干后定为原竹粉，作为对照样；
[0011](2)高温处理:将步骤(1)中抽提后的竹粉与去离子水以l:10g/mL的固液比在烧杯中混合，将烧杯放入120 °C的高压灭菌锅中处理30min，取出冷却放入-4 °C冰箱储存备用；
[0012](3)微波处理:称取一定量的经步骤(1)和步骤(2)两步处理的竹粉置于锥形瓶中， 以1:10?1:50g/mL的固液比加入去离子水，使用微波作用l-35min;微波作用完毕后将竹粉取出，冷却后经去离子水清洗并自然风干，置于_4°C冰箱储存备用。[〇〇13](4)分别称取0.05g原竹粉及先高温后微波处理的竹粉置于容器中，分别加入15U纤维素酶和120U木聚糖酶，用pH为7.0的磷酸盐缓冲液定容至15mL，放入50 °C的恒温震荡水浴锅中反应，每个试验样需做三组平行试验；
[0014](5)分别于011，211，411，611，811，1011，1211，2411取0.311^反应液于离心管中，并经10000r/min的离心机离心5min，置于_4°C冰箱中备用；[〇〇15](6)用移液器取0.2mL离心后的上清液于试管中，加入0.15mLDNS，沸水浴中煮5min，加入2.15mL去离子水，用紫外分光光度计测520nm波长下的吸光度值，根据葡萄糖标准曲线换算为葡萄糖量;对比相同纤维素酶与木聚糖酶共同水解条件下，原竹粉及先高温后微波处理竹粉生成的还原糖量，并计算酶解效率提高率。[〇〇16]步骤(3)所述的微波处理功率为1?999W。[0〇17]步骤⑶中所述固液比为1:20g/mL。[〇〇18]本发明的有益效果为:经过高温与微波共同处理的竹粉表面的酶附着位点增加且竹粉内部分子结构有所改变，这就使生物酶可以更好的与竹粉接触并更易进入竹粉内部， 生物酶水解竹粉效率提高，酶用量减少，成本降低。纤维素酶与木聚糖酶的同时作用于竹粉时，两种酶具有协同作用而使生物酶水解效率更高。【具体实施方式】
[0019]下面结合实施例进一步说明本发明的技术方案，但本发明的应用不仅限于实施例描述内容。
[0020]对比例1:空白例
[0021]称取0.05g原竹粉于50mL具塞锥形瓶中，加入15U纤维素酶与120U木聚糖酶，用pH 为7.0的磷酸盐缓冲液定容至15mL，放入50°C的恒温震荡水浴锅中反应;分别于Oh，2h，4h， 6h，8h，10h，12h，24h取0.3mL反应液于离心管中，经10000r/min的离心机离心5min后置于-4 °C冰箱中备用；用移液器取0.2mL上清液于试管中，加入0.15mL DNS，沸水浴中煮5min终止反应，加入2.15mL去离子水，用紫外分光光度计测520nm波长下的吸光度值，经计算反应进行24h生成的还原糖量为29.62yg/mL。[〇〇22] 对比例2:高温单独处理[〇〇23]称取0.5g原竹粉于烧杯中，以l:10(g/mL)的固液比加入去离子水，将烧杯放入120 °C的高压灭菌锅中处理30min，取出冷却放入-4°C冰箱储存备用；称取0.05g经高温处理的竹粉于50mL具塞锥形瓶中，并加入15U纤维素酶与120U木聚糖酶，用pH为7.0的磷酸盐缓冲液定容至15mL，放入50 °C的恒温震荡水浴锅中反应;分别于Oh，2h，4h，6h，8h，1 Oh，12h，24h 取0.3mL反应液于离心管中，经lOOOOr/min的离心机离心5min后置于_4°C冰箱中备用；用移液器取0.2mL上清液于试管中，加入0.15mL DNS，沸水浴中煮5min终止反应，加入2.15mL去离子水，用紫外分光光度计测520nm波长下的吸光度值，经计算反应进行24h生成的还原糖量为 33.52yg/mL。[〇〇24]对比例3:微波单独处理[〇〇25]称取0.5g原竹粉于烧杯中，以1:20(g/mL)的固液比加入去离子，将烧杯放入超声波微波电脑联合萃取仪(南京先欧仪器制造有限公司)中，使用390W的微波处理23min。微波作用完毕后，将竹粉取出，冷却经去离子水清洗自然风干，置于-4°C冰箱储存备用。称取 0.05g经微波处理的竹粉于50mL具塞锥形瓶中，并加入15U纤维素酶与120U的木聚糖酶，用 pH为7.0的磷酸盐缓冲液定容至15mL，放入50°C的恒温震荡水浴锅中反应；分别于Oh，2h， 4h，6h，8h，10h，12h，24h取0.3mL反应液于离心管中，经10000r/min的离心机离心5min后置于-4°C冰箱中备用；用移液器取0.2mL上清液于试管中，加入0.15mL DNS，沸水浴中煮5min 终止反应，加入2.15mL去离子水，用紫外分光光度计测520nm波长下的吸光度值，经计算反应进行24h生成的还原糖量为34.69yg/mL。
[0026]对比例4:先微波后高温
[0027]称取0.5g原竹粉于烧杯中，以1:20(g/mL)的固液比加入去离子，将烧杯放入超声波微波电脑联合萃取仪(南京先欧仪器制造有限公司)中，使用390W的微波处理23min。微波作用完毕后，将竹粉取出，冷却经去离子水清洗自然风干，置于-4°C冰箱储存备用。称取一定量的经微波处理的竹粉于烧杯中，以1:1 〇 (g/mL)的固液比加入去离子水，将烧杯放入120 °C的高压灭菌锅中处理30min，取出冷却放入-4°C冰箱储存备用。称取0.05g先经微波后经高温处理的竹粉于50mL具塞锥形瓶中，并加入15U纤维素酶与120U的木聚糖酶，用pH为7.0 的磷酸盐缓冲液定容至15mL，放入50 °C的恒温震荡水浴锅中反应;分别于Oh，2h，4h，6h，8h， 10h，12h，24h取0.3mL反应液于离心管中，经lOOOOr/min的离心机离心5min后置于-4°C冰箱中备用；用移液器取〇.2mL上清液于试管中，加入0.15mL DNS，沸水浴中煮5min终止反应，加入2.15mL去离子水，用紫外分光光度计测520nm波长下的吸光度值，经计算反应进行24h生成的还原糖量为39.95yg/mL。[〇〇28]实施例5先高温后微波法[〇〇29]称取0.5g原竹粉于烧杯中，以1:10(g/mL)的固液比加入去离子水，将烧杯放入120 °C的高压灭菌锅中处理30min，取出冷却放入-4 °C冰箱储存备用。称取一定量的经高温处理的竹粉于烧杯中，以l:20(g/mL)的固液比加入去离子水，将烧杯放入超声波微波电脑联合萃取仪(南京先欧仪器制造有限公司)中，使用390W的微波处理23min。微波作用完毕后，将竹粉取出，冷却经去离子水清洗自然风干，置于-4°C冰箱储存备用。称取0.05g先经高温后经微波处理的竹粉于50mL具塞锥形瓶中，并加入15U纤维素酶与120U的木聚糖酶，用pH为 7.0的磷酸盐缓冲液定容至15mL，放入50 °C的恒温震荡水浴锅中反应;分别于Oh，2h，4h，6h， 8h，10h，12h，24h取0.3mL反应液于离心管中，经lOOOOr/min的离心机离心5min后置于_4°C 冰箱中备用；用移液器取〇.2mL上清液于试管中，加入0.15mL DNS，沸水浴中煮5min终止反应，加入2.15mL去离子水，用紫外分光光度计测520nm波长下的吸光度值，经计算反应进行 24h生成的还原糖量为41.31yg/mL。
[0030]由以上各实施例对比可以看出:
[0031](1)从实施例1和实施例2的数据对比可以看出，经过高温预处理之后的竹粉经纤维素酶与木聚糖酶共同水解生成的还原糖量较原竹粉经过纤维素酶与木聚糖酶共同水解生成的还原糖量百分率提高了 13.17%;[〇〇32](2)从实施例1和实施例3的数据对比可以看出，经过微波预处理之后的竹粉经纤维素酶与木聚糖酶共同水解生成的还原糖量较原竹粉经过纤维素酶与木聚糖酶共同水解生成的还原糖量百分率提高了 17.12%;[〇〇33](3)从实施例1和实施例4的数据对比可以看出，经过先微波后高温预处理之后的竹粉经纤维素酶与木聚糖酶共同水解生成的还原糖量较原竹粉经过纤维素酶与木聚糖酶共同水解生成的还原糖量百分率提高了34.88% ;[〇〇34](4)从实施例1和实施例5的数据对比可以看出，经过先高温后微波预处理之后的竹粉经纤维素酶与木聚糖酶共同水解生成的还原糖量较原竹粉经过纤维素酶与木聚糖酶共同水解生成的还原糖量百分率提高了39.47% ;[〇〇35]以上各实施例的数据对比结果表明，高温单独预处理，微波单独预处理，先微波后高温预处理及先高温后微波预处理对生物酶(纤纤维素酶+木聚糖酶)水解竹粉均有一定的辅助效果。通过实施例比较可见:先高温后微波的预处理对生物酶水解有预料不到的技术效果。
【主权项】
1.一种利用高温与微波技术共同辅助生物酶水解竹粉的方法，其特征在于:其步骤为:(1)一年生毛竹研磨成粉烘干，过筛，用甲苯和乙醇按体积比1: 2混合，对竹粉进行有机 抽提，抽提后的竹粉经去离子水清洗、自然风干后定为原竹粉，作为对照样；(2)高温处理:将步骤(1)中抽提后的竹粉与去离子水以l:10g/mL的固液比在烧杯中混 合，将烧杯放入120 °C的高压灭菌锅中处理30min，取出冷却放入-4°C冰箱储存备用；(3)微波处理:称取一定量的经步骤(1)和步骤(2)两步处理的竹粉置于锥形瓶中，以1: 10?l:50g/mL的固液比加入去离子水，使用微波作用l-35min;微波作用完毕后将竹粉取 出，冷却后经去离子水清洗并自然风干，置于-4°C冰箱储存备用；(4)分别称取0.05g原竹粉及先高温后微波处理的竹粉置于容器中，分别加入15U纤维 素酶和120U木聚糖酶，用pH为7.0的磷酸盐缓冲液定容至15mL，放入50°C的恒温震荡水浴锅 中反应，每个试验样需做三组平行试验；(5)分别于Oh，2h，4h，6h，8h，10h，12h，24h取0.3mL反应液于离心管中，并经 10000r/min 的离心机离心5min，置于-4 °C冰箱中备用；(6)用移液器取0.2mL离心后的上清液于试管中，加入0.15mL DNS，沸水浴中煮5min，加 入2.15mL去离子水，用紫外分光光度计测520nm波长下的吸光度值，根据葡萄糖标准曲线换 算为葡萄糖量;对比相同纤维素酶与木聚糖酶共同水解条件下，原竹粉及先高温后微波处 理竹粉生成的还原糖量，并计算酶解效率提高率。2.根据权利要求1所述的一种利用高温与微波技术共同辅助生物酶水解竹粉的方法， 其特征在于:步骤(3)所述的微波处理功率为1?999W。3.根据权利要求1所述的一种利用高温与微波技术共同辅助生物酶水解竹粉的方法， 其特征在于:步骤(3)中所述固液比为1:20g/mL。
【文档编号】G01N1/28GK105954211SQ201610252036
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年4月20日
【发明人】傅佳佳, 杜晓莹, 张群, 申申, 王鸿博, 高卫东
【申请人】江南大学