专利名称：雄性不育植物及其保持系的培育方法以及所使用的表达载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用基因工程技术生产雄性不育性植物的方法以及该方法中所使用的表达载体。
利用基因工程创造雄性不育性植物的工作起始于80年代末。Mariani等于1990年在这一领域进行了开创性的工作。他们利用从烟草花药分离出的花药绒毡层特异表达的基因TA29的启动区与RNaseT1和Barnase基因连接，通过农杆菌法转入烟草和油菜中，均获得了雄性不育的转化株。随后将雄性不育基因紧密连锁到抗除草剂基因Bar上，通过喷洒除草剂来杀死敏感的可育株，达到保持和繁殖具有抗性的雄性不育株，从而得到保持系(Mariani et al.，Nature，1990，247737-741)。1992年，他们又根据Barnase的抑制因子Bastar能够与其形成一对一的复合体，使其失去核糖核酸酶活性的原理，采用Bastar基因代替Barnase构建成嵌合基因，并获得恢复系(Mariani et al，Nature，1992，357384-387)。他们建立的基因工程“三系”系统目前已经用于油菜、烟草、番茄、棉花、花椰菜、菊苣和芝麻等(Mariani et al.，Nature，1992，375(4)384-387；Leemans，InReproductive biology and plant breeding(Y Dattee et al eds)，Springer-Verlag，1992，pp82-86；Denis et al，Plant Physiol.，1993，101(4)1295-1304；Greef et al，1994；李胜国等，植物学报，1995，37(8)659—660；Phul PS et al.，Crop Improvement，1996，23(special issue)15-28；Chenet al.，Acta Agriculturae Boreali-Sinica，1996，11(4)33-38；Zhan et al.，Sex.Plant Reprod.，1996，9(1)35-43 1992；Hoyle，Nature-Biotechnology，1998，162，118)。利用Barnase/Bar系统，De Block等在小麦上获得雄性不育性(De Block et al.，TGA，1997，95(1-2)125-131)。这一系统的主要缺点是在转基因植物中引入了微生物来源的核糖核酸酶基因Barnase和核糖核酸酶抑制基因Bastar，使人们在接受转基因植物，特别转基因是食物植物有所顾虑。
Van de Meer等利用反义基因技术，通过封闭查尔酮(Chs)基因的表达，在矮牵牛上意外获得雄性不育性(Van de Meer et al，Plant Cell，1992，4253-262；Ylstra and van Tune，Prophyta，1993，46(1)56-58)。自这一开创性的工作后，出现了通过反义基因技术特异性地封闭或抑制某一或某些功能基因的表达来创造植物雄件不育的报道(综述见Xiao，InProc.China-Eu workshop on manipulating plant metabolism and agro-biotechnology，Oct.27-31，1997，Yang Tse River，China，pp49-50；李艳红等，InProc.the 1stinternational workshop on hybrid wheat.Nov.，1998，Beijing，China，pp197-203)。但是封闭或抑制某一或某些功能基因产生的雄性不育不彻底仍然是难以克服的问题。
通过细菌影响小孢子发育也可导致雄性不育。Schmulling等将Agrobacterium rhizogenes A4 T-DNA rol C基因与CaMV 35S启动子融合，转化到烟草、番茄、拟南芥中，结果得到了表现雄性不育的烟草转化株(Schmulling et al.，EMBO J.，1988，72621-2629)；当与rol C基因的反义基因与CaMV 35S构成的嵌合基因得到的转化株杂交时，育性得到恢复(Schmullinget al.，Mol.Gen.Genet，1993，237385-394)；用A.rhizogenes的rol B基因与金鱼草TapI启动子融合，转化烟草后发现花药生长素含量增加，导致花粉异常，造成雄性不育(Spena et al.，TAG，1992，84520-527)。将编码核酶的DNA克隆与绒毡层特异启动子相连，导入植物，可得到雄性不育株；通过提前降低胼胝质含量或利用转座子突变等其它方式也可创造雄性不育(Worrall et al.，Plant Cell，1992，4759-771)。然而，这些雄性不育性或不彻底，或改变了转基因植物的其它性状，包括重要的农艺性状，或引入了微生物基因作为目标基因而未能用于杂种生产实践。
植物细胞，包括花药和花粉细胞，除了含有细胞核和各种细胞器外，在细胞质中还有一个三维的细胞骨架(cytoskeleton)网络系统。细胞骨架由微丝(microfilament)、微管(microtubule)和中间纤维(intermediatefilament)组成。微丝由肌动蛋白(actin)和肌球蛋白(myosin)组成，微管主要由微管蛋白(tubulin)组成，中间纤维则由碱性和酸性角蛋白等蛋白组成。细胞骨架系统作为一个系统整体，对维持细胞形状、使细胞内各种细胞器和细胞本身行使各种功能起着重要的作用。组成细胞骨架的微丝、微管和中间纤维，除了作为主要成员贡献于整体系统的功能之外，还有它们各自的功能。微丝参与细胞质流动、细胞器运动、有丝分裂、胞质分裂、顶端生长、物质运输、花粉粒萌发和花粉管生长等(阎隆飞等，科学通报，1999，44(23)247l—2475)。微管参与细胞内囊泡和蛋白质颗粒的运动、有丝分裂过程中染色体的运动、细胞极性的确定以及信号传递等。中间纤维与细胞内微管的分布、结构和功能有关，与染色体的分布和动态有关，还与细胞核内的核膜骨架蛋白有关(徐是雄等编，植物细胞骨架。北京，科学出版社，1996，135页)。因此，特异性封闭或抑制骨架蛋白基因的表达不但能破坏三维细胞骨架系统的完整性，使花药和/或花粉细胞失形或畸形，导致其它细胞器丧失正常工作的“空间”，而且使细胞骨架的组份丧失其专有的功能，从而不能产生花粉或仅仅产生畸形的没有活力的花粉，最终导致彻底的雄性不育。植物的花药花粉发育过程涉及大量的基因表达。在烟草早期的花药中大约有25000个基因在表达，其中约有10000个基因是花药特异性(Kamalayand Goldberg，PNAS，1984，812801-2805；Mascarenhas，Ann.Rev.PlantPhysiol.Plant Mol.Biol.，1990，41317-338)。封闭或抑制其中任何一个基因的表达都将导致花药和/或花粉生长发育的不完全或失败，导致雄性不育(Xiao，InProc.China-EU workshop on manipulating plant metabolismand agro-biotechnology.Oct，1997，Yang-Tse River，China，pp49-50)。本发明就是利用这一原理，通过封闭或抑制植物花药花粉发育过程中的基因表达，来生产雄性不育植物的。
本发明的目的在于提供一种利用生物工程技术生产雄性不育植物及其保持系的方法以及该方法中所使用的表达载体，克服上述现有技术存在的缺陷，以便更好、更广泛地利用植物的杂种优势。
为了达到上述目的，本发明提供了一种培育雄性不育植物的方法，包括下列步骤(a).选择植物雄性器官细胞骨架蛋白基因(完整基因或其片段)为目标基因；(b).构建封闭或抑制所述目标基因表达的雄性不育基因表达盒；(c).将所述雄性不育基因表达盒导入植物细胞、愈伤组织、组织或器官中；(d).将经转化的植物细胞、愈伤组织、组织或器官培养成雄性不育植株。
上述方法中，所述雄性器官包括花药和/或花粉；所述骨架蛋白基因包括肌动蛋白基因、肌球蛋白基因和微管蛋白基因，其中肌动蛋白基因包括G—肌动蛋白基因亚族和F—肌动蛋白基因亚族；所述的细胞骨架蛋白基因的片段一般情况下最少具有10核苷酸残基，优选20-50个核苷酸残基，最优选约40个残基。所述封闭或抑制指利用目标基因(部分或完整基因)的反义基因进行封闭或抑制；所述表达盒由只在植物花药和/或花粉中驱动基因表达的启动子、目标基因编码区(ORF)全区或部分及终止子组成；所述导入可以通过基因转导的“直接法”(如，基因枪法、花粉管通道法、电激穿孔法、PEG法、激光穿孔法和超声波法等)和“介导法”(如，农杆菌介导法、农杆菌介导侵染法等)导入表达载体来进行，其中终止子包括Nos终止子、Ocs终止子或Ca MV35s终止子，启动子为花药或花粉特异性启动子，包括TA29、A3、A8、A9、AG、Amb aI、BA42、BA112、BA158、Bcp1，Bp4B.Bp4C，Bp19，BetvI，BetvIII，ca55，CDPK，ChiA，ChiB，ChsA，Def A，E1，E2，F2s，13#，17#，G10，KBG41，LAT52，LAT59，Lol PI，Lol Pib，Lec6，MS2，Osg6B，P2，SF1，SF2，SF3，SF5，SF6，SF9，SF16，SF18，SF19，TA13，TA20，TA32，TA56，T72，tap2，TUA1和Zm13等启动子；所说的目标基因编码区包括花药和/或花粉生长和/或发育所需要基因的编码区；所说的表达载体是含有雄性不育基因表达盒、抗除草剂基因表达盒、选择基因和/或报告基因表达盒的质粒，所说的质粒是经过人工改造已经除去可能对转基因植物的生长和发育不利的DNA片段的质粒，包括供“直接法”和“介导法”用的(植物表达)质粒；所说的雄性不育系是通过导入雄性不育基因表达盒或表达载体所获得的雄性不育的转基因植株及其所形成的株系、品系和品种，包括转基因单子叶植物和双子叶植物。
本发明还提供了培育所述雄性不育植物保持系的方法，是在上述培育雄性不育植物的过程中，在雄性不育基因表达盒上连锁抗除草剂基因表达盒，并将所获得的转基因雄性不育植物为母本与其相应的普通植株进行杂交，在杂种播种前后或苗期用相应的除草剂进行处理，存活植株为雄性不育保持系。
本发明的有益效果在于1、雄性不育性完全彻底，在生产杂交种时不用进行物理或化学去雄，省时省力无污染，能更好地发挥杂种优势。2、不会改变植物的优良性状和引入不良的农艺性状。3、所获得雄性不育性不会受到光温等影响，应用不受区域限止。4、不会给植物引入微生物基因。5、获得的雄性不育植物仅仅是雄性不育，雌蕊和营养体正常，可以避免白花授粉，并可以接受其它具有亲和力的花粉而结实，保证植物的生物产量和经济产量。6、雄性不育系的保持方法使得利用本发明所获得的植物雄性不育系可以用于杂种生产实践，克服了天然或自然发现的核雄性不育难以保持而无法用于杂种生产实践的障碍；同时也可以应用到其它基因工程方法创造的植物雄性不育的保持。
利用赛百盛公司的PCR试剂盒，按照说明，利用20μl反应体系扩增TA29片段(310bp。在0.5ml PCR反应薄壁管中加入5’端引物1(30pM)和3’端引物2(30pM)(见图2)各1μl，经HindIII过夜酶切的烟草总DNA20～50μg，加重蒸馏水至总体积20μl。在PCR仪(HybaidTOUTHDOWN)上扩增，循环参数为94℃变性5min，1个循；94℃变性1min，55℃退火1.5min，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min，1个循环。PCR产物用等体积酚、氯仿、酚各抽提一次，加0.1倍体积的3mol/L NaAc(pH6.0)、0.2倍体积的无水乙醇沉淀，去上清，用70％乙醇洗沉淀两次，空气干燥。用重蒸馏水溶解至浓度大约为150ng/μl，用KpnI＋BamHI双酶切2hr左右，连接到用KpnI＋BamHI双酶切的pUC18上，形成转化子。用得到的转化子连接物转化大肠杆菌(株系JM101)，经a-互补蓝白斑筛选，挑取白斑。提取质粒，用KpnI-BamHI双酶切，1.5％琼脂糖凝胶电泳，出现大约310bp和2.7kb两条带者为正确的转化子，记为p18TA29。(c).雄性不育基因(pGTAa)从p18TA29上用BamHI＋KpnI酶切回收TA29启动子。先用BamHI酶切p18TA29，再用Klenow大片段补平，然后用KpnI酶切，经琼脂糖凝胶电泳回收0.3kb的TA29启动子。从pSKActin(胡松年，中国农业大学博士论文，1996，69页)上用EcoRV＋BamHI酶切回收1.6kb的肌动蛋白基因(actin)片段。将回收的两片段先体外反向连接，再连接到用KpnI＋BamHI双酶切的pGEM-7Zf质粒，形成转化子。用所得到的转化子转化大肠杆菌，经蓝白斑筛选，挑取白斑。提取质粒，酶切鉴定。正确的转化子用KpnI＋BamHI酶切出2.9kb的载体和1.9kb的TA29＋Anti-actin带，用EcoRI酶切出2.9kb的载体、1.6kb的Actin和0.3kb的TA29启动子带，用BamHI酶切出4.8kb的质粒带。正确的转化子记为pGTAa，含构建的雄性不育基因(TA29＋Anti-actin)。(d).雄性不育基因表达盒(pSTAa)的构建将Nos终止子连接到所构建的雄性不育基因(TA29＋Anti-actin)下游，以构成完整的雄性不育基因表达盒(TA29＋Anti-actin＋Nos)。用XbaI＋BamHI酶切pGTAa，低熔点琼脂糖凝胶回收1.9kb的雄性不育基因片段(TA29-Anti-actin)；从pBARGUS上用BamHI＋HindIII酶切回收0.3kb的Nos终止子。将回收的两片段先体外连接，再连接到用XbaI＋HindIII双酶切的pSK质粒，形成转化子。用得到的转化子转化大肠杆菌，经蓝白斑筛选，挑取白斑。提取质粒，酶切鉴定。正确的转化子用XbaI＋HindIII酶切出2.9kb的载体片段和2.2kb的“TA29＋Anti-actin＋Nos”片段，即雄性不育基因表达盒；用KpnI＋BamHI酶切出2.9kb的载体、1.9kb的雄性不育基因(TA29＋Anti-actin)片段和0.3kb的Nos片段。含有这一表达盒的转化子记为pSTAa。3.雄性不育基因植物表达载体的构建本实施例的雄性不育植物表达载体除含有完整的雄性不育基因表达盒之外，还含有方便选择转基因植株和方便保持雄性不育性的抗除草剂基因表达盒。具体采用抗除草剂草丁膦(PPT)的基因Bar表达盒。Bar基因编码草丁膦乙酰转移酶(PAT)，该酶使PPT上的自由NH2基乙酰化，从而使PPT失活(Thompson等，EMBOJ.，1987.62519-2523)。
目前世界上用于农杆菌介导法转化植物的表达载体可分成双元载体(又称二元载体，binary vector)和共合载体(integrative vector)两大类。双元载体质粒在进入植物细胞后，能将其T-DNA部分转移和整合到寄主植物的染色体。本实施例用于农杆菌介导法转化植物的表达载体是双元载体类，但也可以利用共合载体。
从上节构建的pSTAa上用KpnI＋HindIII双酶切回收2.2kb的雄性不育基因表达盒(TA29＋Anti-actin＋Nos)，连接到用KpnI＋HindIII双酶切的双元载体质粒pBin19(10.9kb)的T-DNA，转化大肠杆菌，a-互补蓝白选择，挑取白斑，提取质粒，用KpnI＋HindIII双酶切，得到10.9kb的载体带和2.2kb的目标带，用HindIII酶单切，得到一条13.1kb的带。这一转化子记为pBTAa。从pBARGUS上，用HindIII酶切回收2.1kb的Bar表达盒，与HindIII酶切的pBTAa连接，转化大肠杆菌。挑取菌落，提取质粒，用HindIII酶切，切出2.1kb的Bar盒带和13.1kb的pBTAa带；用KpnI酶切，切出11.4kb和3.8kb两条带，用EcoRI＋HindIII酶切，得到12.8kb、2.2kb和1.6kb三条带。这一转化子记为pBTAaB，为农杆菌介导法转化植物的雄性不育基因表达载体，在其T-DNA区含有本发明所构建雄性不育基因表达盒、Bar基因表达盒和pBin19所带的NptII基因表达盒(NptII基因编码并表达新霉素磷酸转移酶，赋予卡那霉素抗性)。4.农杆菌的转化本实施例所选用的农杆菌株系为LBA4404、A281、EHA105和AGL1，也可以选用其它类型。各株系的培养方法基本相同，只是所用的抗生素有异。A281、EHA105和AGL1具有对利福平(Rif)的抗性(20μg/ml)、LBA4404对链霉素(Str)的抗性(50μg/ml)。本实施例选用的基本培养基为LB培养基(胰化蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L；固体培养时加琼脂15g/L)。菌株接种于附加有相应抗生素的固体LB培养基培养皿，倒置在37℃温育培养过夜，然后在4℃保存。(a).农杆菌感受态的制备(以株系LBA4404为例)挑取单菌落LBA4404，接种于5ml含100μg/ml Str的YEB液体培养基(每L10g蛋白胨，1g酵母粉，5g蔗糖，0.5g MgSO4·7H2O，pH7.0)中，于28℃，200rpm振荡培养过夜。取2ml过夜活化的菌液接种于50ml含100μg/ml Str的YEB中，同样条件培养至O.D.值大约为0.5，冰浴30min。于4℃，5000rpm离心5min，弃上清，用10ml0.15M NaCl悬浮菌体。于4℃，5000rpm离心5min，弃上清，用2ml 20mM CaCl2悬浮菌体，加入15％的甘油。每管100μl分装，液氮速冻，于-70℃保存。(b).农杆菌的转化参照An(Methods in Enzymology，1987，153293-305)方法，用冻融法将本发明所构建的用于农杆菌介导法转化植物的雄性不育植物表达载体(pBTAaB)转化到农杆菌中。
取1～2μg质粒，加到100μl于冰上溶化的感受态细胞中，冰浴30min。置于液氮中迅速冷冻5min，移入37℃水浴中溶化5min，迅速冰浴2min后加入1000μl YEB液体培养基，于28℃培养3～5hr。于4℃，5000rpm离心5min，沉淀菌体，弃掉上清后，重新悬浮菌体，均匀涂布于含Str 50μg/ml和Kan 50μg/ml的固体YEB培养基(在液体培养基中加入15g/L琼脂)上。于28℃倒置培养2～3天。5.植物细胞、愈伤组织、组织或器官的遗传转化(a).用农杆菌转化双子叶植物参照Horsch等的叶盘法(Science，1985，2271229-1231)，通过农杆菌介导转化双子叶植物，本实施例选用的双子叶植物为烟草和番茄。
挑取含有重组质粒(例如，pBTAaB)的农杆菌株系(例如，LBA4404)单菌落，接种于5ml含有相应抗生素的细菌液体培养基(例如，YEB)中，28℃振荡过夜培养活化农杆菌。取过夜培养活化的农杆菌，按1∶50的比例转接到含有相应抗生素的液体培养基中，继续培养至OD600为0.6～0.8。将培养物于5000rpm离心5min，收集菌体。用1/2液体植物培养基稀释10～20倍，备用。
切取7～8天苗龄的外植体(子叶或幼叶)，置于再生培养基上，预培养2～4天。将外植体投入预先准备好的农杆菌菌液中，室温下不时摇动，使外植体与农杆菌充分接触，侵染10～30min。取出外植体，置滤纸上吸去多余的菌液，转入表面铺有一层滤纸的再生培养基上。暗处共培养2天。经共培养的外植体，转入含有相应灭菌抗生素和选择抗生素的再生培养基上，每隔2～3周更换一次培养基，并逐渐降低灭菌抗生素的浓度。把再生的抗性芽接到含有低浓度灭菌抗生素和高浓度选择抗生素以及其它选择剂的生根培养基上。待幼苗生长较大生根，开瓶一周炼苗，再移苗入土，保湿一周后，于22～26℃的温室内生长。6.转基因植物的鉴定本实施例的转基因植株(植物)鉴定法包括生物法、化学法、组织化学染色法和分子生物学法。(a).化学法根据所构建和导入植体的载体质粒所携带的选择性基因(例如，抗抗生素基因、抗除草剂基因等)和/或诱导性基因，在植株再生阶段和生根阶段于培养基中加入足以杀死未转基因对照的相应的选择剂(例如，相应的抗生素、除草剂)和/或诱导剂。在幼苗阶段和成苗阶段，用浓度适当提高的相应的选择剂(例如，除草剂)和/或诱导剂处理，以排除在试管阶段筛选偷逃者。本实施例用于鉴定转基因番茄(品种丽春)和烟草(品种NC89)的Kan(卡那霉素)浓度都为50mg/L，在含有Kan50mg/L的培养基上，90％的转基因番茄和98％的转基因烟草的叶圆盘再生芽苗，而未转基因的对照叶圆盘全部黄化死亡，没有一片再生芽苗。将这些Kan-抗性芽苗移到含有Kan 50mg/L和PPT 5mg/L的延长生长和生根培养基上后，98％以上的芽苗都能正常生长和生根，而未转基因的对照芽苗则全部黄化死亡。(b).生物法对于双子叶转基因植物，取试管苗或温室苗的叶片或其它容易再生的组织或器官，在加有较高浓度选择压[对应于(a)的选择剂]的再生培养基上作植株再生，同时取未转基因的对照苗的相同组织或器官在加有较高浓度选择压[对应于(a)的选择剂]的再生培养基上作植株再生，以作为负对照。只有在这样的培养基上能再生植株者，其外植体的供体植株为真转基因植株。本实施例选用从上述化学法(a)筛选出的Kan-和PPT-抗性番茄和烟草试管苗上取幼叶作圆盘(直径0.8cm)，在含有Kan50mg/L和PPT5mg/L的再生培养基上培养，同时以未转基因的番茄和烟草的同龄叶圆盘作对照。培养4—6周后，抗性株的叶圆盘95％以上都再生出芽苗，而对照则没有一株芽苗再生。(c).组织化学染色法如果所构建和导入植体的载体质粒所携带的报告基因GUS或类似基因，常用Jefferson等(Jefferson等，EMBO J.，1987，63901-3907)报道的GUS染色法进行转基因愈伤组织和植株检测。只有转基因愈伤组织或植株的组织或器官被染成蓝色。本实施例所构建和导入植体的载体质粒所携带的报告基因GUS。通过上述化学法和生物法检测的抗性苗，取其叶片或无性系整株苗用GUS染色法染色后，93％的番茄和95％以上的烟草都能完全染成蓝色，3—5％能部分染色，有0—2％不能染色。对照株的则全部比能染色。(d).分子生物学鉴定---PCR法利用PCR方法对通过上述(a)、(b)和(c)检测或鉴定的转基因愈伤组织和/或植株进行鉴定是最快的分子生物学鉴定方法，一般利用目标基因和/或标志基因的核心片段为模板设计双端PCR引物，以待检测植株的DNA为模板扩增，同时以未转基因对照株的DNA模板扩增作为负对照。扩增出预期带者为转基因植株。本实施例利用反义目标基因anti-actin的核心序列设计的PCR两端引物5’端引物5′-GGATCCATGGAAGCATTTCCTGTG-3′3’端引物5′-TGATCAGCAGAAYCCGAAG-3′(序列4)在供试的通过上述(a)、(b)和(c)检测的10株转基因番茄和10株转基因烟草植株中都扩增出一条1.2kb的目标带，而在对照植株中没有扩增出这条带。---Southern Blot法Southern Blot法是更准确可靠的分子生物学鉴定方法。根据本说明提供的方法提取待检测植株的DNA[参见C(a)]。按照Southern(J.Mol.Biol.，98503-517)报道的方法，DNA用酶切后(用任意内切酶或所导入目标基因的酶切位点酶)，琼脂糖凝胶电泳分离，变性后转移到尼龙膜或纤维素膜。以载体上的目标基因片段合成探针(缺口平依法、随机引物法或PCR法)，用放射性同位素或地高辛(DIG)标记探针。再用标记的探针与所得到的尼龙膜或纤维素膜杂交。用放射性同位素标记者将杂交后的膜压X-片，用地高辛(DIG)标记者按照DIG说明书将杂交后的膜染色。具有阳性信号者为转基因植株。未转基因的对照植株呈阴性反应。本实施例以导入番茄和烟草的anti-actin基因片段为目标基因，通过PCR法制备探针，用地高辛(DIG)标记探针，转基因番茄和烟草的DNA中检测出一条1.6kb的带，而在未转基因的对照番茄和烟草中都没有检测到任何带。6.转基因植株的育性检测或检验转基因植株的育性检测或鉴定包括雄性育性鉴定和雌性育性鉴定。本实施例提供的雄性育性鉴定方法有雄性器官的显微形态观察、花粉的KI-I染色、花粉的FDA染色、花粉体外发芽、花粉授粉(自花授粉、给野生型植株授粉)；提供的雌性育性鉴定方法有雌性器官的显微形态观察、套袋白花授粉、用野生型植株的花粉授粉。(a).雌雄器官的显微形态观察取转基因植株和对照植株欲开发的花，去花瓣后在显微镜下观察花药的有无、多少、大小、形状、丰满程度和颜色；观察花丝的长短、粗细和曲直等；观察雌蕊的大小、花柱的高低等。雄性不育者花药少、小、不丰满、色较淡或近白色；花丝短粗、不超过柱头。本实施例观察到部分(60％)转基因烟草的花丝短粗、不超过柱头；部分转基因小麦的花药几乎完全退化，非常小而为白色，不含花粉；部分转基因小麦的花药虽然呈黄色，但较小，花丝短粗、远在柱头之下。(b).花粉的I-KI染色许多植物的正常花粉含有淀粉粒，特别是禾本科植物。淀粉与I反应形成黑色或黑紫色。不育花粉多不含或含有极少量淀粉粒，因此用I-KI染色时不显色或仅显非常浅的淡紫色。本实施例的转基因小麦的花粉99.5％以上不能被I-KI染色，而对照植株的花粉99.7％以上都能被染成黑色或黑紫色。(c).花粉的FDA染色将FDA用丙酮配成2mg/ml的母液，避光保存。用时先在载玻片上滴一滴B5液体培养基，随后用镊子夹取花药，轻轻挤出花粉粒，然后再滴上少量FDA母液，混匀，稍等片刻，盖上盖玻片，于Nikon荧光显微镜下观察花粉粒的颜色。具有生活力的花粉发出绿色或绿黄色荧光，没有生活力的花粉不发荧光或有暗红色荧光。本实施例转基因番茄花粉用FDA染色后，95％以上的花粉不发荧光或有暗红色荧光，而对照则只有不到1％的花粉不发荧光或有暗红色荧光，99％以上发出绿色或绿黄色荧光；转基因小麦的花粉99％以上不发荧光或有暗红色荧光，而对照则99％以上发出绿黄色荧光。(d).基因产物的标定基因产物的标定是指检测被特异性封闭或抑制的基因表达产物的标定。
将观察到的不育花粉和对照株的花粉进行肌动蛋白的标定，以分析雄性不育的转化株的花粉和对照植株花粉中肌动蛋白的含量及分布情况。本实施例采用共聚焦激光扫描显微镜观察。标定方法参见李岩(中国农业大学博士论文，1998)。转基因雄性不育小麦的花粉畸形，没有规则的细胞骨架网状结构，对照株的花粉则具有呈球形、规则的细胞骨架网状结构。(e).自交和杂交将对通过染色法检测出雄性不育的转化株在的部分花开花前2-3天直接套袋，观察其自交结实状况；另取大部分小花在去雄后进行人工授粉(父本为同样的基因型，未进行转化试验)后再套袋以便用于观察转化株的雌蕊的育性情况；同时取转化株的花粉对未转基因的野生型进行授粉，以确认花粉的育性。本实施例所得转基因雄性不育小麦的套袋自交结实率为零，但作母本在人工授粉后的结实率为80％(对照为85％)，以转基因雄性不育株的“花粉”给未转基因对照株授粉后的结效率也为零。7.转基因雄性不育性的保持本实施例在提供雄性不育基因植物表达载体时已经将抗除草剂基因表达盒与雄性不育基因表达盒紧密连锁。所以，本实施例的雄性不育株(系、品系或品种)在具有雄性不育的同时，还具有对除草剂的抗性。用转基因雄性不育基因型的野生型作父本与其杂交，获得的种子有1/2含有雄性不育基因和抗除草剂基因。因此，在种子播种前后或苗期用相应的除草剂处理，将会杀死1/2的不含雄性不育基因和抗除草剂基因者，保持含有雄性不育基因和抗除草剂基因者。这样，就可以得到雄性不育保持系。本实施例以0.1％Basta(除草剂，含PPT 150mg/L)处理小麦转基因雄性不育基因型的野生型作父本与转基因雄性不育植株杂交获得的种子，大约49.5％的种子能正常发芽，而未转基因植株的种子则100％不能正常发芽；上述杂交所得种子的苗期(3—5叶期)用0.03-0.05％Basta喷洒，大约48％的苗具有抗性而正常生长发育，而对照苗则全部黄化枯萎。实施例2利用农杆菌介导法转化雄性不育单子叶植物本实施例除了转化植物的步骤和生物法鉴定如下所述外，其它步骤同实施例1。1.转化植物转化植物是用农杆菌介导法转化单子叶植物小麦的，采用菌——愈伤组织共培养法。所说的愈伤组织可以来自花药、幼穗、幼花序、幼胚和成熟胚，或其它器管。
取上述一种或几中外植体置于愈伤组织诱导培养基上在暗处诱导愈伤组织。出愈后10-15天的淡黄色、颗粒状鲜嫩的愈伤组织用于农杆菌侵染。挑取淡黄色、幼嫩愈伤组织置于活化好的农杆菌液中。侵染1-2小时后取出愈伤组织用无菌、干燥的滤纸吸干，然后放在愈伤组织增殖培养基上，共培养2-4天。将共培养后的愈伤组织转接到具有相应灭菌抗生素的愈伤组织增殖培养基上恢复培养7-10天后，移至愈伤组织抗性筛选(加相应的选择抗菌素和/或其它选择剂)培养基上，25±2℃，黑暗条件下培养，筛选带有抗性的愈伤组织；2-3周继代一次。40-45天后，挑取颜色较新鲜的愈伤组织置于分化筛选培养基上，25±2℃，16hr/8hr光照下分化植株。分化筛选20-30天后，将得到的抗性试管苗移至新的生根筛选培养基上，25±2℃，16hr/8hr光照下使抗性苗生根。将生根的抗性苗移到温室中先闭瓶炼苗7天、再开瓶炼苗3天后进行移栽入盆。2.生物法鉴定取转化小麦试管苗或温室苗的叶片和不容易枯萎的组织或器官以及分蘖，在加有较高浓度选择压的愈伤组织诱导培养基和/或生根培养基上诱导愈伤组织和/或生根，同时取未转基因的对照苗的相同组织或器官在相同培养基上诱导愈伤组织和/或生根，以作为负对照。只有叶片和不容易枯萎的组织或器官在这样的培养基上保持1—2周有愈伤组织形成或不枯萎者，分蘖在这样的生根培养基上能正常生根者，其供体植株为真正的转基因植株。实施例3利用基因枪法转化雄性不育单子叶植物本实施例除了雄性不育表达载体的构建与植物的转化方式如下所述外，其它步骤均与实施例2相同，在转化的植物的鉴定过程中，最好利用实施例1所记载的PCR法。1.直接法转化植物的雄性不育基因表达载体(pSBTAa)的构建用HindIII酶切pBARGUS，回收2.1kb的Bar表达盒，它具有CaMV35S启动子、内含子、Bar编码区和终止子的完整高效表达盒(Thompson等，EMBO J.，1987，62519-2523)。将Bar盒与HindIII酶切的pSTAa连接，转化大肠杆菌。挑取菌落，提取质粒，用HindIII酶切出2.1kb Bar盒，再用KpnI酶切，得到2.9kb和1.5kb的带，用EcoRI酶切，得到5.0kb，1.6kb的actin及其它带0.4kb、0.3kb。正确的转化子记为pSBTAa。该表达载体含有pSK的骨架和雄性不育基因表达盒及Bar表达盒，总大小为7.2kb。2.基因枪法转化植物(1).基因枪微弹的制备本实施例提供的基因枪法转化单子叶植物小麦采用了美国Bio-Rad公司的PDS—1000/He型基因枪和金粉微弹。轰击对象为小麦愈伤组织。
微弹的制备基本按说明书进行。称取50mg直径为1um的金粉颗粒放入灭菌的离心管中，加入1ml无水乙醇振荡悬浮，放置过夜。5000rpm离心3分钟，去上清，收集金粉，无菌水冲洗3—4次至乙醇完全除去，最后加入1ml无菌水制成浓度为50mg/ml的金粉悬液。用前吸取50μl金粉悬液移至Eppendorf管中，加入5μl质粒DNA，充分振荡；然后分别加入2.5M CaCl250μl和0.1M亚精胺20μl，并充分混均；静置2分钟后，用140μl的70％乙醇洗涤；12000rpm离心2分钟，弃上清，加140μl 100％乙醇洗涤；12000rpm离心2分钟，弃上清，加入90μl 100％乙醇，4℃保存，备用；每枪上样10μl。(2)愈伤组织的前处理按照实施例2诱导愈伤组织，将出愈后15天的淡黄色、颗粒状鲜嫩的愈伤组织在轰前4-6hr移至含0.4M甘露醇的高渗培养基上，集中在直径9cm的培养皿的中央(直径2cm的范围内)，用于轰击。(3)轰击打开基因枪电源，将消毒后的可裂圆片装入固定盖，旋紧。取微弹悬浮液10μl点在消过毒的微弹载体中心区域，吹干，然后与阻挡网一并装入发射装置中。将待转化的材料放在样品板上(转化材料与微弹之间的距离为7cm，但可调整)，关上轰击室。抽真空，当真空度为27—28Pa时，将VAC键转到HOLD位置，按FIRE键使氦气压力达到可裂膜的压力(900psi和1100psi)时进行轰击。(4)植株再生与筛选将轰击12—16hr后的愈伤组织移至不加渗透压调节剂和选择压的普通愈伤组织诱导培养基上，继续暗培养两周后移至分化筛选培养基[参见(b)]，于25±2℃，16hr/8hr光照培养；约20天后将再生出的绿苗移至生根筛选培养基，于25±2℃，16hr/8hr光照培养，并将含有健壮根系的绿苗移栽到花盆中。实施例4利用花粉通道法转化雄性不育单子叶植物。
除了转化方法采用花粉通道法外，其它步骤与实施3相同。
权利要求
1.一种雄性不育植物的培育方法，包括(a).选择植物雄性器官细胞骨架蛋白基因或其片段为目标基因；(b).构建封闭或抑制所述目标基因表达的雄性不育基因表达盒；(c).将所述雄性不育基因表达盒导入植物细胞、愈伤组织、组织或器官中；(d).将经转化的植物细胞、愈伤组织、组织或器官培养成雄性不育植株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述雄性器官是花药和/或花粉。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述细胞骨架蛋白基因是肌动蛋白基因、肌球蛋白基因或微管蛋白基因。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述封闭或抑制是使用目标基因的反义基因进行的。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述表达盒由只在植物花药和/或花粉中驱动基因表达的启动子、目标基因编码区(ORF)全区或部分及终止子组成。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述导入是通过使用含有雄性不育基因表达盒的雄性不育表达载体来进行的。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述终止子是Nos终止子、Ocs终止子或Ca MV35s终止子。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述的目标基因编码区包括花药和/或花粉生长和/或发育所需要基因的编码区。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所说的表达载体是含有雄性不育基因表达盒、抗除草剂基因表达盒、选择基因和/或报告基因表达盒的质粒。
10.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所说的肌动蛋白基因包括G—肌动蛋白基因亚族和F—肌动蛋白基因亚族。
11.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述启动子是TA29、A3、A8、A9、AG、AmbaI、BA42、BA112、BA158、Bcp1，Bp4B.Bp4C，Bp19，BetvI，BetvIII，ca55，CDPK，ChiA，ChiB，ChsA，Def A，E1，E2，F2s，13#，17#，G10，KBG41，LAT52，LAT59，Lol PI，Lol Pib，Lec6，MS2，Osg6B，P2，SF1，SF2，SF3，SF5，SF6，SF9，SF16，SF18，SF19，TA13，TA20，TA32，TA56，T72，tap2，TUA1或Zm13启动子。
12.一种雄性不育基因，它是雄性器管的细胞骨架蛋白基因的反义基因。
13.一种雄性不育基因表达盒，其特征在于含有在植物花药和/或花粉中驱动基因表达的启动子、封闭和/或抑制雄性器管的细胞骨架蛋白基因表达的编码区(ORF)全区或部分及终止子。
14.一种雄性不育基因表达载体，其特征在于包括雄性不育基因表达盒和抗除草剂基因表达盒，其中所述的雄性不育基因表达盒由在植物花药和/或花粉中驱动基因表达的启动子、封闭和/或抑制雄性器管的细胞骨架蛋白基因表达的编码区(ORF)全区或部分及终止子组成。
15.根据权利要求14所述的雄性不育基因表达载体，其特征在于所述的抗除草剂基因是Bar基因。
16.根据权利要求15所述的雄性不育基因表达载体，其特征在于所述Bar基因是编码草丁膦己乙酰转移酶的基因。
17.一种培育雄性不育保持系的方法，其特征在于根据权利要求1-11之一的方法培育雄性不育系，其中的雄性不育基因表达盒上连锁抗除草剂基因表达盒；以这种转基因雄性不育系的植物为母本与其普通的植株作为父本进行杂交，将杂种播种前后或苗期用相应的除草剂进行处理，存活植株为雄性不育保持系。
全文摘要
本发明提供了一种雄性不育植物的培育方法,包括:选择植物雄性器官细胞骨架蛋白基因或其片段为目标基因;构建封闭或抑制所述目标基因表达的雄性不育基因表达盒;将所述雄性不育基因表达盒导入植物细胞、愈伤组织、组织或器官中;将经转化的植物细胞、愈伤组织、组织或器官培养成雄性不育植株。该方法产生的雄性不育性完全、彻底、稳定,既不会改变植物的优良性状也不会引入不良的农艺性状,不会受到光、温等影响,不会给植物引入微生物基因。
文档编号A01H1/04GK1326674SQ00109108
公开日2001年12月19日 申请日期2000年6月7日 优先权日2000年6月7日
发明者肖兴国, 阎隆飞, 张爱民, 李艳红, 赵广荣 申请人:中国农业大学