专利名称：菌根真菌在石斛栽培中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种石斛菌根栽培技术，具体地说涉及一种菌根真菌在石斛栽培中的应用技术，它包括本发明所用的菌根真菌、菌根真菌的培养、石斛由原球茎发育至苗及其继代培养、菌根真菌在石斛栽培中的应用技术和对石斛的促生长效果及对有效成分含量的影响。
本发明的目的在于提供一种菌根真菌在石斛栽培中的应用技术，可以解决石斛繁殖及成活率低、栽培生长缓慢和周期长、有效成分含量低和药效差等问题。
为实现上述目的，本发明采用的技术是先分别培养菌根真菌和石斛苗，再将菌根真菌与石斛苗共生栽培。能够完成本发明的菌根真菌是一种小菇属(Mycena)真菌，具体为石斛小菇(Mycena dendrobii)，紫萁小菇(Mycena osmundicola)，兰小菇(Mycena orchidicola)，开唇兰小菇(Mycena anoectochila)等4种。上述4种真菌分别可从铁皮石斛、天麻、墨兰和花叶开唇兰获得，这4种真菌于2002年1月14日在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏编号为0685、0689、0688和0687。
具体地说，本发明所述技术的步骤方法如下(除有特殊说明外，本发明中所述的比例均为重量百分比)1、菌根真菌的培养将上述的菌根真菌自低温保藏的斜面试管菌种活化后，分别转接于PDA平皿中，于25℃恒温培养12d，分别在菌落边缘打孔成菌片，并以小碎块接入液体或固体培养基；菌根真菌的液体培养为培养基的配制葡萄糖2.5％；KH2PO40.15％；K2HPO40.1％；MgSO40.15％；天然物麦麸3％(煮汁)。高压灭菌后分别接入上述真菌。培养条件培养基pH5.6；三角瓶摇床培养瓶装量50％；转速120转/分钟；23℃培养30天收获。发酵罐培养接种量10％，其余参数同上。发酵培养结束时收获发酵物，用匀浆机打碎菌体及发酵物备用。
菌根真菌的固体培养为培养基的配制阔叶树锯末∶麦麸∶玉米粒＝1∶1∶0.5，加水量为原料的150-200％。高压灭菌后分别接入上述真菌。待菌丝从培养基顶部长入底部时(2个月左右)取出备用。
本发明可以采用上述4种菌根真菌中的任选一种，也可以是由其中任意两种或两种以上菌种组成。
2、石斛由原球茎到形成苗及其继代培养以1/2MS(Murashige and Skoog 1968)培养基为基本培养基，石斛原球茎增殖时附加萘乙酸(NAA)0.2mg/L、吲哚丁酸(IBA)0.2mg/L、细胞分裂素(KT)0.2mg/L；原球分化苗时附加IBA 0.5mg/L，KT 0.5mg/L；再生植株生长时附加NAA 0.5mg/L、IBA 0.5mg/L、KT 0.2mg/L；苗的继代基本培养基为1/2MS培养基，附加180g/L马铃薯提取液，20g/L蔗糖，8g/L琼脂。
3、菌根真菌与石斛苗共生栽培(1)石斛栽培基质蛭石∶砂子(4∶1)或森林腐殖土∶砂子(6∶1)或泥炭土∶砂子(5∶1)或泥炭土∶砂子∶蛭石(4∶1∶2)，以泥炭土∶砂子∶蛭石＝4∶1∶2或森林腐殖土∶砂子＝6∶1为佳。
(2)石斛与菌根共生栽培方法栽培工具各种硬质材料的托盘或花盆，立体栽培；硬质材料包括木制、不锈钢、塑料、玻璃、陶瓷等。在其容器的基部平铺一层2-3cm厚的基质，其上平铺3-5cm厚的小鹅卵石或小碎砖，其逢间用栽培基质填实。株行距各4-8cm栽培3-5株一丛的石斛苗，栽前每一株或一丛苗根的基部放置少量粉碎至0.5-1cm大小的湿栎树(山毛榉科Fagaceae)树叶，其上再放以上备好的液体菌根真菌2ml或固体菌根真菌约1.5g。使石斛的根与菌接触，用栽培基质将苗埋好，覆盖基质厚度视石斛幼苗的高度而定，一般2-3cm厚。栽后浇放置至室温的水。
(3)栽培条件塑料薄膜温室、玻璃温室、露天栽培遮阳网遮阴，环境温度为18-25℃，光照量为正常日光量的1/3，空气温度夏天应控制在25℃以下，冬天应控制在18℃以上，每天光照10h，光照量为正常日光量的1/3；避免直射光；照度2000Lx。
(4)石斛的收获石斛栽后6-15个月收获，收获时可连根取出洗净栽培基质，阴干或60(C以下烘干。
采用本发明提供的栽培技术，石斛生长周期可由传统栽培的5-7年缩短到1至2年；产量提高20％；与不接菌根真菌栽培的石斛苗(对照)相比，本发明使石斛苗中生物碱等化学成分含量提高至接近野生石斛含量水平。
2、菌根真菌的培养菌根真菌的液体培养培养基的配制葡萄糖2.5％；KH2PO40.15％；K2HPO40.1％；MgSO40.15％；天然物麦麸3％(煮汁)。高压灭菌后接入上述真菌。
培养条件培养基pH5.6；三角瓶摇床培养瓶装量50％；转速120转/分钟；温度23℃；培养30天收获。发酵罐培养接种量10％，其余参数同上。发酵培养结束时收获发酵物，用匀浆机打碎菌体及发酵物备用。
3、石斛原球茎分化及植株生长培养基石斛为通过组织培养得到的原球茎分化形成的苗，石斛苗株高0.7-1cm。以1/2MS(Murashige and Skoog 1968)培养基为基本培养基，促进石斛原球茎增殖时附加的最佳激素配比为NAA(萘乙酸)0.2mg/L，生长素IBA(吲哚丁酸)0.2mg/L，细胞分裂素(KT)0.2mg/L；原球茎分化苗时附加的最佳激素配比为IBA0.5mg/L，KT0.5mg/L；再生植株生长时附加的激素配比为NAA0.5mg/L，IBA0.5mg/L，KT0.2mg/L。
4、石斛苗的准备石斛为通过组织培养得到的原球茎，之后获得的石斛无菌苗，苗株高1.5-2.5cm。将石斛苗转入有培养基的三角瓶中，基本培养基组成为1/2MS培养基，180g/L马铃薯提取液+20g/L蔗糖，琼脂8g/L，pH6.0。121℃高压灭菌30分钟。每瓶接5-8株苗，培养温度23℃，每日光照10小时，光强为100Lx。培养至株高3.5-5.0cm以上的壮苗(50-60天后)即可进行栽培。
5、菌根真菌在石斛栽培中的应用(1)石斛栽培基质蛭石∶砂子(4∶1)或森林腐殖土∶砂子(6∶1)或泥炭土∶砂子(5∶1)或泥炭土∶砂子∶蛭石(4∶1∶2)。
(2)石斛菌根栽培方法栽培工具为18cm高的各种硬质材料的托盘或花盆，立体栽培；硬质材料包括木制、不锈钢、塑料、玻璃、陶瓷等。在其容器的基部平铺一层2-3cm厚的基质，其上平铺3-5cm厚的小鹅卵石或小碎砖，其逢间用栽培基质填实。株行距各5cm栽培3-5株一丛的石斛苗，栽前每一株或一丛苗根的基部放置少量粉碎至0.5-1cm大小的湿栎树(山毛榉科Fagaceae)树叶，其上再放以上备好的液体菌根真菌2ml或固体菌种1-1.5g。使石斛的根与菌接触，用栽培基质将苗埋好，覆盖基质厚度视石斛幼苗的高度而定，一般2-3cm厚。栽后浇放置至室温的自来水即可。
(3)栽培条件一般塑料薄膜温室、玻璃温室、露天栽培遮阳网遮阴均可采用菌根栽培方法栽培石斛。石斛适宜的环境温度为18-23℃，光照量为正常日光量的1/3，最忌夏秋中午前后的直射光，栽培地需架设遮阳网。石斛生长需较高的空气湿度，土壤不宜积水。但其空气温度夏天应控制在25℃以下，冬天应控制在18℃以上。每天光照10h，光照量为正常日光量的1/3；避免直射光；照度2000Lx。
(4)石斛的收获石斛一般栽后6-15个月收获，收获时可连根取出洗净栽培基质，阴干或60(C以下烘干。
实施例二、本实施例基本操作条件同实施例一，不同之处是1、本实施例用的菌根真菌为石斛小菇、紫萁小菇、兰小菇和开唇兰小菇。
2、采用固体培养基，该培养基的配制阔叶树锯末∶麦麸∶玉米粒＝1∶1∶0.5，加水量为原料的150-250％(重量比)。高压灭菌后分别接入上述真菌。待菌丝从培养基顶部长入底部时(2个月左右)取出备用。
比较例菌根真菌对石斛苗的促生长效果菌根真菌显著促进石斛苗的生长，小菇属菌根真菌促进石斛幼苗生长，接菌栽培的石斛比对照植株节间明显膨大，接菌的石斛的鲜重和干重较不接菌的均有提高，一般提高10％-25％。与不接菌根真菌栽培的石斛苗(对照)相比，该项技术使石斛苗中生物碱等化学成分含量提高至接近野生石斛含量水平。上述结果为在菌根真菌促进石斛苗生长作用基础上，为今后菌根真菌在石斛大规模栽培中应用，保证药材质量提供了科学依据。
从上述可以显然看出，本发明有如下优点小菇属这4种真菌对石斛的生长发育有明显促进作用；采用该项新技术，石斛生长周期可由传统栽培的5-7年缩短到1至2年；产量提高20％；与不接菌根真菌栽培的石斛苗(对照)相比，该项技术使石斛苗中生物碱等化学成分含量提高至接近野生石斛含量水平，从而保证了菌根共生后石斛药材的质量，为今后菌根真菌应用于石斛规范化栽培提供了科学依据。另外，该技术栽培方法简单、投资少、不施任何肥料和农药，生产出的石斛为绿色产品。
权利要求
1.一种菌根真菌在石斛栽培中的应用技术，采用小菇属4种真菌石斛小菇(Mycena dendrobii)、紫萁小菇(Mycena osmundicola)、兰小菇(Mycena orchidicola)、开唇兰小菇(Mycena anoectochila)中的任选一种或由其中任意两种或两种以上组成，其主要步骤及条件如下(所涉及的比例均为重量百分比)(1)菌根真菌的培养将上述的菌根真菌自低温保藏的斜面试管菌种活化后，分别转接于PDA平皿中，于25℃恒温培养12天，分别在菌落边缘打孔成菌片，并以小碎块接入液体培养基进行培养和发酵或接入固体培养基进行培养；其中所述的菌根真菌的液体培养为培养基的配制葡萄糖2.5％；KH2PO40.15％；K2HPO40.1％；MgSO40.15％；天然物为麦麸3％(煮汁)，高压灭菌后分别接入上述真菌；培养条件培养基pH5.6；三角瓶摇床培养瓶装量50％；转速120转/分钟；23℃培养30天；发酵罐培养接种量10％，其余参数同上；发酵培养结束时将发酵物用匀浆机打碎菌体及发酵物备用；其中所述的菌根真菌的固体培养为培养基的配制阔叶树锯末∶麦麸∶玉米粒＝1∶1∶0.5，加水量为原料的150-250％，高压灭菌后分别接入上述真菌，待菌丝从培养基顶部长入底部时取出备用；(2)石斛由原球茎到形成苗及其继代培养以1/2MS(Murashige and Skoog 1968)培养基为基本培养基，石斛原球茎增殖时附加萘乙酸(NAA)0.2mg/L、吲哚丁酸(IBA)0.2mg/L、细胞分裂素(KT)0.2mg/L；原球茎分化苗时附加IBA 0.5mg/L，KT0.5mg/L；再生植株生长时附加NAA 0.5mg/L、IBA 0.5mg/L、KT 0.2mg/L；苗的继代基本培养基为1/2MS培养基，附加180g/L马铃薯提取液，20g/L蔗糖，8g/L琼脂；(3)菌根真菌与石斛苗共生栽培(a)石斛栽培基质蛭石∶砂子＝4∶1或森林腐殖土∶砂子＝6∶1或泥炭土∶砂子＝5∶1或泥炭土∶砂子∶蛭石＝4∶1∶2；(b)石斛菌根共生栽培在硬质材料的盆中立体栽培，其容器的基部平铺一层石斛栽培基质，其上平铺一薄层小鹅卵石或小碎砖，其缝间用栽培基质填实，按株行距栽培一丛的石斛苗，在苗根的基部放置少量粉碎的湿栎树(山毛榉科Fagaceal)树叶，其上再放以上备好的液体菌根真菌2ml或固体菌根真菌1.5g，使石斛的根与菌接触，用栽培基质将苗覆盖2-3cm厚，浇放置至室温的水；(c)栽培条件采用塑料薄膜温室、玻璃温室、露天栽培遮阳网遮阴，环境温度为18-25℃，光照量为正常日光量的1/3；照度2000Lx；(d)石斛的收获连根取出洗净栽培基质；阴干或60℃以下烘干。
2.如权利要求1所述的菌根真菌在石斛栽培中的应用技术，其特征在于，所述石斛栽培基质为泥炭土∶砂子∶蛭石＝4∶1∶2或森林腐殖土∶砂子＝6∶1。
3.如权利要求1所述的菌根真菌在石斛栽培中的应用技术，其特征在于，所述栽培工具为各种硬质材料的托盘或花盆，立体放置。
4.如权利要求1或3所述的菌根真菌在石斛栽培中的应用技术，其特征在于，所述硬质材料包括木制、不锈钢、塑料、玻璃或陶瓷。
5.如权利要求1所述的菌根真菌在石斛栽培中的应用技术，其特征在于，所述容器基部平铺石斛栽培基质为2-3cm厚，其栽培基质上平铺的小鹅卵石或小碎砖为3-5cm。
6.如权利要求1所述的菌根真菌在石斛栽培中的应用技术，其特征在于，所述株行距为各4-8cm。
7.如权利要求1所述的菌根真菌在石斛栽培中的应用技术，其特征在于，所述粉碎的湿栎树叶大小为0.5-1cm。
8.如权利要求1所述的菌根真菌在石斛栽培中的应用技术，其特征在于，所述室温的水为放置至室温的自来水。
9.如权利要求1所述的菌根真菌在石斛栽培中的应用技术，其特征在于，所述石斛的收获为栽培后的6-15个月。
全文摘要
一种菌根真菌在石斛栽培中的应用技术，所用的小菇属4种真菌分别为石斛小菇(Mycena dendrobii)，紫萁小菇(Mycen osmundicola)，兰小菇(Mycena orchidicola)，开唇兰小菇(Mycena anoectochila)；先分别培养菌根真菌和石斛苗，再将菌根真菌与石斛苗共生栽培。采用该项新技术，可大大缩短石斛的生长周期；提高石斛产量和有效成分含量。该项技术栽培方法简单、投资少、不施任何肥料和农药，生产出的石斛为绿色产品。
文档编号A01H17/00GK1433669SQ0210077
公开日2003年8月6日 申请日期2002年1月25日 优先权日2002年1月25日
发明者郭顺星, 陈晓梅, 宋经元, 肖培根 申请人:中国医学科学院药用植物研究所