专利名称：一种菊花悬浮细胞培养获得再生植株的方法
技术领域：
本发明一种菊花悬浮细胞培养获得再生植株的方法，属于生物技术领域，专用于组织培养获得再生植株。
二、技术背景菊花(Dendranthema Xgrandiflora Ramat.)是我国十大名花和世界四大切花之一，是盆栽、切花和园林美化的重要花卉种类，在花卉生产中占有十分重要的地位。杂交和诱变是目前菊花育种的主要手段。但是，杂交和诱变育种带有一定的盲目性，缺乏遇见性和可控性，而且工作量很大；诱变育种局限于个体或组织水平，其后代往往产生大量嵌合体，这对优良性状的纯化鉴定和稳定遗传带来很大的困难。
以单细胞或小细胞团作为对象进行菊花细胞、基因工程等研究具有很大的优势，因为单细胞或小细胞团受周围细胞和微环境的影响较小，且可以得到单细胞起源、遗传上稳定的同质体再生植株。在细胞水平进行诱变育种和遗传转化时，可从大群培养细胞中较快地筛选出所需的突变细胞或转化细胞，再生植株一般为纯合突变体，通过生化或分子生物学手段对突变株或转化植株进行选择，能大大缩短育种年限。利用生物技术改良菊花的观赏性状、抗性已引起广泛重视。能否成功地将这一方法应用于菊花育种与生产，关键是要建立菊花组织、细胞培养的再生体系。菊花茎尖、茎段、叶片、花瓣、花托、花萼、雌雄蕊、花蕾再生植株都已有成功报道。但关于菊花悬浮细胞培养的研究，尚未有报道。
发明内容
技术问题本发明的目的是提供一种菊花悬浮细胞培养获得再生植株的方法，建立小菊细胞悬浮培养再生体系，成功获得植株并移栽成活，用于小菊组织培养获得再生植株，同时为小菊的细胞、基因工程提供获得再生植株的技术。
技术方案本发明是一种菊花悬浮细胞培养获得再生植株的方法，包括1)愈伤组织的诱导1.1基因型的选择取不同品种的顶端幼嫩叶片，用75％酒精灭菌30s，再用0.1％升汞灭菌10min，无菌水冲洗5次，切成约0.5×0.5cm2小块，接到MS+2.0mg·L-12，4-D+0.2mg·L-16-BA+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂，pH6.2的培养基上；30天后，将诱导的愈伤组织转接到MS+2.0mg·L-16-BA+0.1mg·L-1NAA+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂，pH6.2的分化培养基上，30d后选出平均每块愈伤组织分化芽数大于5个的品种；1.2愈伤组织的获得以选择品种的无菌苗为试材，取植株中上部0.2-0.5cm长嫩茎段作外植体，接种到以MS、B5作基本培养基，添加0.2mg·L-16-BA和浓度为1.0mg·L-12，4-D的诱导愈伤组织培养基上，30d后统计愈伤组织的诱导率为100％，获得诱导的愈伤组织为浅绿色、颗粒大小为0.05-0.15cm、外观湿润、质地松软的愈伤组织；
2)悬浮系的建立和植株再生2.1悬浮培养取2～3g上述诱导出的浅绿色、颗粒大小为0.05-0.15cm、外观湿润、质地松软的愈伤组织放入MS+0.2mg·L-1KT+0.2mg·L-1NAA+0.2mg·L-12，4-D液体培养基中进行悬浮培养3天，将培养的悬浮液用高温高压灭菌过的300目的尼龙网过滤，收集过滤液进行继代培养，继代时，把培养物摇匀，分装到无菌三角瓶中，再加入同等体积的新鲜培养基，培养条件为摇床转速100转/分钟，25±1℃，1000lux弱光下培养，共培养30-50d；2.2植株再生将上述培养的悬浮液用300目尼龙网过滤，收集过滤液转移到MS+0.2mg·L-1KT+0.2mg·L-12，4-D+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂，pH6.2的固体培养基上，每瓶装有25～30ml固体培养基的100ml三角瓶中加1ml过滤液，在25±1℃，1000lux弱光下培养，4周后获得0.2-0.4cm大小的愈伤组织；把获得的愈伤组织转移到分化培养基MS+2.0mg·L-16-BA+0.1mg·L-1NAA+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂上，在25±1℃，3000lux下培养，每天12小时黑暗，一个月后获得0.8-1.5cm高度的再生植株。
上述方法中最好将将获得的愈伤组织转到MS/B5+2mg·L-16-BA+0.1mg·L-1NAA+琼脂0.7g·L-1，以MS为基本培养基的添加30g·L-1蔗糖，B5加20g·L-1蔗糖，pH值6.2，高温高压灭菌前的分化培养基；30d后统计分化情况，每块愈伤组织分化芽数达0.5-1.0个，确定以上获得的愈伤组织可以于下一步悬浮培养。悬浮培养初期，每隔3天继代换液1次，继代2次，以后可每隔7～10d继代换液1次。
有益效果本发明提供的一种菊花悬浮细胞培养获得再生植株的方法，与现有技术相比具有如下优点和积极效果①本研究以小菊为材料，建立悬浮细胞培养与植株再生体系，为小菊的细胞、基因工程等的深入研究奠定了基础。比较不同基因型在分化培养基上的分化率，筛选出分化能力最强的基因型为‘七月红’，每块愈伤组织30d天可诱导出9个芽，，筛选出茎段最易诱导出愈伤组织，同时再生能力较理想，愈伤组织的诱导率为100％，平均每块愈伤组织分化芽数0.7个；②本发明悬浮培养的单个细胞在3～5d内即可见到细胞分裂，约6d即可形成小细胞团，培养过程中，整个生长曲线为上升的半抛物线型，可分为延迟期(2d)、对数生长期(6～9d)，减慢期(2d)等阶段；试验表明，悬浮细胞在7种培养基上，植板率有明显差异，本发明选择培养基即MS+0.2mg·L-1KT+0.2mg·L-12，4-D培养基上悬浮细胞的植板率最大，为9.2×10-4；悬浮细胞再生愈伤组织时，都需要添加生长素和细胞分裂素，本发明2，4-D效果较好，植板率也相应提高到30×10-4；③本发明进行短期的低温预处理，可以提高悬浮细胞的植板率，4℃处理2h，植板率增加0.3×10-4，并采取悬浮培养初期，每隔3天继代换液1次，继代2次，以后可每隔7～10d继代换液1次，共继代4次，植板率为9.5×10-4。
④本发明成功获得1cm左右高度的再生植株(图5)。再生植株驯化至根长度达0.5-1cm时移栽成活(图6)。本发明建立了小菊细胞悬浮培养再生体系，成功获得植株并移栽成活，可用于小菊组织培养获得再生植株，同时为小菊的细胞、基因工程提供获得再生植株的技术。
四
图1‘七月红’细胞悬浮培养(×100) 不规则细长细胞； 椭圆形细胞； 细胞团图2‘七月红’细胞悬浮培养的细胞团(×200)图3悬浮细胞培养所得的愈伤图4悬浮细胞培养所得愈伤的变化图5悬浮培养所得的愈伤分化出芽图6悬浮培养再生植株生根五、具体实施方案本发明所提供的菊花悬浮细胞培养和植株再生的方法，其实施方案如下1愈伤组织的诱导1.1基因型的选择取不同品种的顶端幼嫩叶片，用75％酒精灭菌30s，再用0.1％升汞灭菌10min，无菌水冲洗5次，切成约0.5×0.5cm2小块，接到MS+2.0mg·L-12，4-D+0.2mg·L-16-BA+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂，pH6.2的培养基上。30天后，将诱导的愈伤组织转接到MS+2.0mg·L-16-BA+0.1mg·L-1NAA+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂，pH6.2的分化培养基上，30d后选出平均每块愈伤组织分化芽数大于5个的品种。结果表明，‘七月红’叶片在15d后就开始形成愈伤组织(速度最快)，且愈伤组织在转到分化培养基上分化率最高，每块愈伤组织可诱导出9个芽。
1.2愈伤组织的获得以‘七月红’品种的无菌苗为试材，取植株中上部的叶片切成三部分叶片上部、叶片下部、叶柄及约0.3cm长嫩茎段作外植体，分别接种到以MS、B5作基本培养基，添加0.2mg·L-16-BA和不同浓度2，4-D(0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，4.0mg·L-1)的诱导愈伤组织培养基，每瓶接种5个外植体，每个处理重复3次；30天后获得诱导的愈伤组织；将愈伤组织转到MS/B5+2mg·L-16-BA+0.1mg·L-1NAA+琼脂0.7g·L-1，以MS为基本培养基的添加30g·L-1蔗糖，B5加20g·L-1蔗糖，pH值6.2(高温高压灭菌前)的分化培养基。30d后统计分化情况，筛选出适于诱导悬浮培养用愈伤组织[浅绿色、颗粒细小(愈伤组织表面形成0.1cm左右大小的细小颗粒)、外观湿润、质地松软的愈伤组织]的外植体。
结果表明，最适合的外植体为幼嫩茎段，最适合的培养基为MS+0.2mg·L-16-BA+1.0mg·L-12，4-D+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂，pH6.2。其愈伤组织的诱导率为100％，平均每块愈伤组织分化芽数0.7个。
2悬浮系的建立和植株再生2.1悬浮培养取2～3g上述诱导出的浅绿色、颗粒细小(愈伤组织表面形成0.1cm左右大小的细小颗粒)、外观湿润、质地松软的愈伤组织放入MS+0.2mg·L-1KT+0.2mg·L-1NAA+0.2mg·L-12，4-D液体培养基中进行悬浮培养，3d后，培养的悬浮液用高温高压灭菌过的300目的尼龙网过滤，收集过滤液进行继代培养。继代时，把培养物摇匀，分装到无菌三角瓶中，再加入同等体积的新鲜培养基，培养条件为摇床转速100转/分钟，25±1℃，1000lux弱光下培养。
悬浮培养初期，每隔3天继代换液1次，继代2次，以后可每隔7～10d继代换液1次，共培养40d左右。
2.2植株再生将上述培养40d后的悬浮液用300目尼龙网过滤，收集过滤液转移到MS+0.2mg·L-1KT+0.2mg·L-12，4-D+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂，pH6.2的固体培养基上，每瓶装有25～30ml固体培养基的100ml三角瓶中加1ml过滤液，在25±1℃，1000lux弱光下培养。四周后获得0.3cm左右大小的愈伤组织。
把获得的愈伤组织转移到分化培养基MS+2.0mg·L-16-BA+0.1mg·L-1NAA+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂上，在25±1℃，3000lux下培养(每天12小时黑暗)，一个月后获得1cm左右高度的再生植株(图5)。
再生植株在MS+0.5mg·L-1NAA+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂培养基(pH6.2)上诱导生根，培养条件为25±1℃，弱光(约1000lux)。20d后，当根长度达0.5-1cm时驯化移栽成活(图6)。
上述悬浮培养的单个细胞在3～5d内即可见到细胞分裂，约6d即可形成小细胞团，培养过程中，整个生长曲线为上升的半抛物线型，可分为延迟期(2d)、对数生长期(6～9d)，减慢期(2d)等阶段；试验表明，悬浮细胞在7种培养基上，植板率有明显差异，本发明选择培养基即MS+0.2mg·L-1KT+0.2mg·L-12，4-D培养基上悬浮细胞的植板率最大，为9.2×10-4；悬浮细胞再生愈伤组织时，都需要添加生长素和细胞分裂素，本发明2，4-D效果较好，植板率也相应提高到30×10-4；高温(38℃)条件下，无论来自何种愈伤组织所得的悬浮细胞，其植板率都会下降，38℃处理6h、48h，其植板率分别下降7.3×10-4、9.0×10-4；本发明进行短期的低温预处理，可以提高悬浮细胞的植板率，4℃处理2h，植板率增加0.3×10-4，但处理时间超过4h时植板率开始降低，随着继代次数的增加，植板率下降，继代6次后，植板率降低1.9×10-4，继代9次时，植板率降为1.9×10-4，继代次数达到12次时植板率降为0。采用悬浮培养初期，每隔3天继代换液1次，继代2次，以后可每隔7～10d继代换液1次，共继代4次，植板率为9.5×10-4。
权利要求
1.一种菊花悬浮细胞培养获得再生植株的方法，包括1)愈伤组织的诱导1.1基因型的选择 取不同品种的顶端幼嫩叶片，用75％酒精灭菌30s，再用0.1％升汞灭菌10min，无菌水冲洗5次，切成约0.5×0.5cm2小块，接到MS+2.0mg·L-12，4-D+0.2mg·L-16-BA+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂，pH6.2的培养基上；30天后，将诱导的愈伤组织转接到MS+2.0mg·L-16-BA+0.1mg·L-1NAA+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂，pH6.2的分化培养基上，30d后选出平均每块愈伤组织分化芽数大于5个的品种；1.2愈伤组织的获得 以选择品种的无菌苗为试材，取植株中上部0.2-0.5cm长嫩茎段作外植体，接种到以MS、B5作基本培养基，添加0.2mg·L-16-BA和浓度为1.0mg·L-12，4-D的诱导愈伤组织培养基上，30d后统计愈伤组织的诱导率为100％，获得诱导的愈伤组织为浅绿色、颗粒大小为0.05-0.15cm、外观湿润、质地松软的愈伤组织；2)悬浮系的建立和植株再生2.1悬浮培养取2～3g上述诱导出的浅绿色、颗粒大小为0.05-0.15cm、外观湿润、质地松软的愈伤组织放入MS+0.2mg·L-1KT+0.2mg·L-1NAA+0.2mg·L-12，4-D液体培养基中进行悬浮培养3天，将培养的悬浮液用高温高压灭菌过的300目的尼龙网过滤，收集过滤液进行继代培养，继代时，把培养物摇匀，分装到无菌三角瓶中，再加入同等体积的新鲜培养基，培养条件为摇床转速100转/分钟，25±1℃，1000lux弱光下培养，共培养30-50d；2.2植株再生将上述培养的悬浮液用300目尼龙网过滤，收集过滤液转移到MS+0.2mg·L-1KT+0.2mg·L-12，4-D+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂，pH6.2的固体培养基上，每瓶装有25～30ml固体培养基的100ml三角瓶中加1ml过滤液，在25±1℃，1000lux弱光下培养，4周后获得0.2-0.4cm大小的愈伤组织；把获得的愈伤组织转移到分化培养基MS+2.0mg·L-16-BA+0.1mg·L-1NAA+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂上，在25±1℃，3000lux下培养，每天12小时黑暗，一个月后获得0.8-1.5cm高度的再生植株。
2.根据权利要求1所述的一种菊花悬浮细胞培养及植株再生的方法，其特征在于将获得的愈伤组织转到MS/B5+2mg·L-16-BA+0.1mg·L-1NAA+琼脂0.7g·L-1，以MS为基本培养基的添加30g·L-1蔗糖，B5加20g·L-1蔗糖，pH值6.2，高温高压灭菌前的分化培养基；30d后统计分化情况，每块愈伤组织分化芽数达0.5-1.0个，确定以上获得的愈伤组织可以于下一步悬浮培养。
3.根据权利要求1或2所述的一种菊花悬浮细胞培养及植株再生的方法，其特征在于悬浮培养初期，每隔3天继代换液1次，继代2次，以后可每隔7～10d继代换液1次。
全文摘要
本发明涉及一种菊花悬浮细胞培养获得再生植株的方法，属于生物技术领域，包括筛选出愈伤组织分化能力较强的基因型菊花品种‘七月红’长嫩茎段；在培养基MS+2.0mg·L－1 2，4－D+0.2mg·L
文档编号A01H4/00GK1593110SQ200410041038
公开日2005年3月16日 申请日期2004年6月21日 优先权日2004年6月21日
发明者陈发棣, 蒋甲福, 房伟民, 赵宏波, 管志勇 申请人:南京农业大学