专利名称：：一种苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白质基因及应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种抗蝗虫的苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白质基因，该基因编码的杀虫蛋白质对直翅目的东亚飞蝗等有活性毒性，基于该基因构建的工程菌制备的杀蝗剂可用于直翅目害虫如蝗虫等的防治，该基因在抗虫转基因植物中的用途。
背景技术：
：蝗虫(Locust)是世界性的重大农业害虫。蝗灾与水灾、旱灾常相间或伴随发生而成为人类历史上三大自然灾害。自80年代起，全球的蝗虫灾害进入频发阶段，除南极外，各大洲均有蝗灾发生，常年发生面积达4680万平方公里，有八分之一的人口常年受到蝗灾的袭扰。我国的蝗灾也随之加重，从1997年起，我国连续几年大面积爆发蝗灾，最高虫口密度可达到3000-10000头/m2。蝗虫中的东亚飞蝗(Zoc""yw>ratoria/H3/Lz7e/757'50主要分布在东亚、东南亚地区，如中、日、菲、泰、越等国，在我国分布范围最广、成灾最频繁、最严重。蝗灾的频发，不仅给农业生产造成了重大损失，而且为了治理蝗灾，要花费大量的人力、物力和财力。目前，对于蝗虫的防治，仍然主要是采用飞机大面积喷洒化学农药或人工使用喷雾器喷洒化学农药，但是，这种大面积使用化学农药的防治方式在迅速有效地遏制蝗害的同时，也杀死了大量蝗虫的天敌，破坏了生态平衡，还使蝗虫产生抗药性，导致蝗灾的恶性循环，而且也严重污染了生态环境，给人类健康造成威胁。因此在化学防治的同时，加大生物方法治蝗力度，建立与生态友好、资源可持续利用的蝗虫治理体系和技术规范，已成为我国蝗虫防治工作的当务之急。近50年来，采用微生物防治蝗虫发展较快。早在20世纪60年代末，美国开始研究和应用微生物一--蝗虫微孢子虫防治蝗虫，到20世纪80年代初期，该项生物防治技术被列入美国防治蝗虫的计划，蝗虫微孢子虫是世界上第一个注册的防治蝗虫的生物制剂，也是世界广泛应用的治蝗生物制剂。美国注册了白僵菌用于防治蝗虫的制剂，英国和澳大利亚分别注册绿僵菌制剂，并在很多国家进行田间试验。除此之外，印度、美国成功地开发出了植物源杀虫剂-印楝素。我国是较早开展生物治蝗的国家，在明清时期就有采用养鸡、养鸭防治蝗虫的实例，而且至今仍在一些地方应用。有关蝗虫天敌的记录，可以追溯到东晋时期，距今有1700多年。然而，直到20世纪80年中期，我国才真正开展蝗虫生物防治的研究和应用。中国农业大学首先从美国引入了蝗虫微孢子虫，经过近10年的努力，在深入研究了微孢子虫致病机理、疾病传播途径和流行规律的基础上，成功地研制出了人工大量繁殖蝗虫微孢子虫的技术、防治草原蝗虫和东亚飞蝗的田间应用技术及其配套技术体系，累计示范应用IOOO多万亩次，取得了良好的经济效益、社会效益和生态效益，该项技术在国际上处于领先水平。中国农业科学院、重庆大学等单位开发研究了绿僵菌(ifeterr力iii'柳朋i's叩h'ae)制剂，经过多年室内实验后，近年来也较为广泛地开展了田间试验示范。这些微生物制剂，均可以采用喷雾或喷粉的方法施用。同时，国内也有几个厂家在生产印楝素、苦参碱等生物制剂。苏云金芽孢杆菌(Saw7J"st/"rj'/^ie"w's，简称Bt)由于具有杀虫效果好，特异性强，生产和使用方便，不污染环境等特点而在害虫生物防治中发挥了重要作用。不同的Bt菌株产生不同的杀虫晶体蛋白质(InsecticidalCrystalProteins,简称ICPs)，使得菌株间的杀虫谱和杀虫活性存在明显差异。现已报道，苏云金芽孢杆菌对鳞翅目、鞘翅目、双翅目等9个目的昆虫和螨类、植物线虫、原生动物、扁形动物等有特异性杀虫活性。目前，筛选高效特异性Bt菌株，发掘新的ICP基因，对菌株进行遗传改良或构建高效广谱基因工程菌是世界性的课题，也是Bt研究的发展趋势，据报道，全世界已分离出了71个H血清型84个亚种的数万株苏云金芽孢杆菌，从分离的菌株中筛选出了多株对鳞翅目和鞘翅目等害虫有毒效的菌株。在杀虫基因克隆和分类方面，自Schnepf等在1981年将苏云金杆菌库尔斯达克变种HD-1菌株的杀虫晶体蛋白质基因分离、克隆，并在1985年完成其核苷酸序列分析以来，已有380多个杀虫晶体蛋白基因被分离、克隆(http:〃www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Nei1—Crickmore/Bt)。Hofte禾卩Whiteley(1989)将杀虫蛋白质命名为Cry，其编码基因为cr》在活体外具溶昆虫细胞和脊椎动物红血球细胞的蛋白质及其基因分别为Cyt和并根据杀虫谱将42种晶体蛋白质归为5类14个亚类。I类为特异抗鳞翅目昆虫；II类为特异抗双翅目和鳞翅目昆虫；m类为特异地抗鞘翅目昆虫；IV类为特异抗双翅目昆虫；V类为无毒性的结晶蛋白。随着新的基因不断被克隆和发现，人们发现有些杀虫蛋白质序列相似，但其杀虫活性却不同，而有些基因编码的杀虫蛋白质具有相同的杀虫活性，相似性却又相差很大，所以以序列相似性和生物活性划分类别的分类系统很难高度统一。1995年0^10110^等将已发现的杀虫基因按其5-内毒素氨基酸序列的相似性确定其不同的分类等级，而与基因的生物活性无关，这个系统用计算机比较晶体蛋白氨基酸序列的相似性，以45%、78%和95%为界，将基因分为4个分类等级，同时还对新基因的命名提出了要求(l)具有杀虫活性的杀虫晶体蛋白可以来自苏云金芽孢杆菌，也可是与已知的蛋白有明显相似序列的任何蛋白质；(2)表达的毒素蛋白必须在伴胞晶体内；(3)基因的核苷酸序列必须在主要的国际数据库中登记。由于近年来分子生物学及核酸测序技术的迅速发展，至今已经发现Cryl-Cry51及Cytl-Cyt2共53个大类群杀虫晶体蛋白基因'然而，这些基因所编码的杀虫晶体蛋白质大多数是杀鳞翅目或鞘翅目等害虫，到目前为止，国际上还没有有关杀蝗虫的苏云金芽孢杆菌(Bt)杀虫晶体蛋白质基因及其编码的杀虫晶体蛋白质的报道。
发明内容本发明的目的在于提供了一种苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白质基因，该基因来源于杀蝗虫的苏云金芽孢杆菌菌株((保藏号CCTCCM206061))。本发明的另一个目的在于提供了一种苏云金芽孢杆菌的杀虫晶体蛋白质，该杀虫蛋白质对直翅目的蝗虫等有特异性的毒杀作用，但对人、畜和环境安全。本发明的第三个目的在于提供了一种苏云金芽孢杆菌的杀虫晶体蛋白质基因在制备防治或预防蝗虫制剂中的应用，用该基因制备的杀蝗剂可用于危害未本科农作物如水稻、小麦、玉米、高粱和牧草等的蝗虫的防治，其特点是特异性强,不杀伤昆虫天敌，对人、畜无毒，对环境安全。为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施(1)抗蝗虫苏云金芽孢杆菌菌株BTH-13的制备方法及其主要特性利用芽孢可耐8(TC高温的特性，在8(TC高温下通过弹土法分离苏云金芽孢杆菌。以东亚飞蝗为试虫，进行毒力生物测定，经过比较毒力致死中量Lc5。,筛选到该高毒力菌株^sc^^"s^"/^'y^7'e/w^ssp.BTH-13(菌种保藏号CCTCCM206061)。该菌株的细胞形态为杆状，产生椭圆形芽孢和菱形伴孢晶体蛋白质，伴孢晶体蛋白质由128kD的杀虫晶体蛋白质组成。经毒力生物测定，菌株BTH-13对东亚飞蝗等直翅目害虫有较高杀虫活性，其发酵液和晶体蛋白质经过碱和蛋白酶处理后，可明显提高抗蝗虫的活性。(2)抗蝗虫苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白质基因的克隆与应用根据苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白质的氨基酸序列的五个保守序列，设计四条简并引物，用聚合酶链式反应(PCR)技术从杀蝗虫的苏云金芽孢杆菌菌株BTH-13的总DNA中扩增一个基因片段并测序。在该基因片段的两端设计两条反方向的特异性引物，用BDGenomeWalkerUniversalKit进行PCR扩增，分别获得约900bp和3000bp的PCR产物。PCR产物经胶回收后与载体pGEM-TEasy(购自Promega公司)连接，转化大肠杆菌TG1(本领域的技术人员均知该大肠杆菌TG1的来源)，挑选阳性克隆子提取质粒后进行测序。用NCBIBlast分析获得的DNA序列，确定杀虫晶体蛋白质基因的大小、开放读码框，启动子。再根据所获得的全基因(包括启动子)序列设计特异性引物进行PCR扩增，上游引物引入Sal聰切位点，下游引物引入BamHI酶切位点，PCR产物经胶回收后与经过SalI/BamHI处理的载体pHT304[pHT304是苏云金芽孢杆菌基因克隆中常用的一个既可在大肠杆菌中复制、又可在苏云金芽孢杆菌中复制的载体，该载体在90年代即已成功构建，文献"Constructionofcloningvectorsfor泡cj77u51t/〃ri"《ie"57.51，，(Gene,108:115-119，1991)中，详细描述了苏云金芽孢杆菌常用载体的构建，其中在第116页，第117页和第118页都描写了pHT304的构建方法及其该载体的特点。在文献"苏云金芽孢杆菌菌株YBT—1535转crylC基因的构建"(生物工程学报，16(5):587—590,2000)中也有记载。该pHT304载体由法国巴斯德研究所提供，巴斯德研究所是全球最大的菌种鉴定与保藏中心，可以向全世界研究人员提供各种用途的菌种和载体，其中pHT304载体在法国巴斯德研究所有保藏；中国科学院武汉病毒研究所等、华中农业大学生命科学院等许多实验室均保存有该载体)连接，转化大肠杆菌TG1和苏云金芽孢杆菌无质粒突变株BMB171，获得含有全长基因的大肠杆菌克隆子(TGl/7Cal)和苏云金芽孢杆菌工程菌(BMB171/7Cal)。文献"苏云金芽孢杆菌无质粒突变株BMB171的转化和表达性能"，应用与环境生物学报1999,5(4):395399，中有关于该突变株的报道。(3)基因及其编码的杀虫蛋白质的特征BTH-13的杀虫晶体蛋白质基因(c/y^a7)全长为3729bp(包括启动子和终止密码子)，开发读码框为3432bp,其序列为SEQIDNO.1所示的DNA序列；该基因编码的杀虫蛋白质为Cry7Ca，杀虫蛋白质的氨基酸数为1144，其序列为SEQIDN0.2所示的氨基酸序列。毒素区域基因片段为1761bp,编码587氨基酸。苏云金芽孢杆菌BTH-13具有杀东亚飞蝗等直翅目害虫的特点，国内目前尚无杀东亚飞蝗等直翅目害虫的苏云金芽孢杆菌商品制剂，BTH-13的杀虫晶体蛋白质基因可用于Bt菌株的遗传改良和构建高效抗蝗虫的Bt工程菌，并可用于转基因植物的研究以获得抗蝗虫的牧草和农作物。因而，从优越而独特的杀虫特性、生产和使用成本低、工业化生产技术成熟、对人和动植物安全、不污染环境及市场需求等方面考虑，苏云金芽孢杆菌BTH-13的杀虫基因及其编码的杀虫蛋白质具有巨大潜在的应用价值。该基因编码的杀虫晶体蛋白质Cry7Ca对东亚飞蝗的毒力如下表1及图1,其中2.0mg/ml的晶体蛋白质经胰蛋白酶处理后产生的毒性肽在72小时内对东亚飞蝗的毒力可达到98.7%。表1Bt菌株BTH-13杀虫晶体蛋白质基因编码的蛋白质对东亚飞蝗的毒力处理<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>图1为Bt菌株BTH-13杀虫晶体蛋白质基编码的杀虫蛋白质对东亚飞蝗的毒杀作用具体实施方式1.抗蝗虫苏云金芽孢杆菌菌株总DNA的提取经活化的BTH-13菌株接种于平板上，30。C培养8h。用20mmol/lTris.cl(pH8.0)的缓冲液洗菌体，5000rpm离心5min，收集菌体。加入1倍体积的TES溶液(含15mg/ml的溶菌酶)，37'C温育2h，加入2倍体积的溶液I1，充分混匀，轻微颠倒，加入蛋白酶K至其终浓度为70ug/ml。37'C温育2h，直到溶液变清亮。加入1.5倍体积的溶液m，充分混匀，12000rpm离心15min，收集上情。加入等体积的酚/氯仿(1:1)，充分混匀，轻微颠倒，至少5min，以除去蛋白。常温12000rpm离心5min，收集上清，加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，重复上述操作。取上清，加入等体积的异丙醇沉淀DNA，4。C放置30min，12000rpm离心20min，弃上清，加入lml的70%乙醇洗涤DNA,离心收集沉淀，倒置干燥。加入适量体积的含50ug/mlRNAasA的无菌水，溶解DNA。2.Bt菌株BTH-13杀虫晶体蛋白质基因的获得(1)根据Hofte等(MicroRev1998,(53):242-245)所报道的Bt毒素蛋白的氨基酸序列的五个保守序列，设计四条简并引物OL15TAHCANYATAYGCACARGCHGCMAAYTT3，OU5,AGAGAHRTGAHWDTDAHWDTDAHRGTATTRGAT3'OL45'AGCATADCGRAHNCYHRYDYVATA3，OL55，GGAATAAATTCRATTYTRTCTAATAAA3'先以BTH-13的DNA为模板，用引物0L1、0L5进行第一轮PCR扩增；再以第一轮扩增的PCR产物为模板，用引物0L2、0L4进行第二轮扩增。第二轮扩增的PCR产物与载体pGEM-T-EasyVector(购于promeaga公司)连接，连接产物通过CaCl转化法转入大肠杆菌TGI中，在含有X-gal、IPTG、Amp(100u1/ml)的LB培养基中筛选阳性克隆子[按《分子克隆实验指南》(黄培堂等译，科学出版社，2002)描述的方法进行]。提取阳性克隆子的质粒DNA进行测序，获得1100kb的BTH-13杀虫晶体蛋白质基因片段序列。(2)根据所获得的序列设计特异性引物H-13(F):5，AGTGCTACTTGGTATCAGGCGGTCCCTTTA3，，H-13(R):5，TCAGAACTGGCAGCTCCATACCAATCAGGA3，(3)按BDGenomeWalkerUniversalKitUserManual操着，获得约900bp和3000bp的PCR产物。PCR产物经胶回收后与载体pGEM-TEasy连接，转化大肠杆菌TG1，挑选阳性克隆子经酶切、PCR检测验证后提取质粒进行DNAWalking测序。(4)用NCBIBlast分析所获得的DNA，确定杀虫晶体蛋白质基因的大小、开放读码框，启动子。(5)根据所获得的全基因(包括启动子)序列设计特异性引物进行PCR扩增，上游引物引入SalI酶切位点，下游引物引入BamHI酶切位点，PCR产物经胶回收后与经过SalI/BamHI处理的载体pHT304连接，转化大肠杆菌TGI和苏云金芽孢杆菌无晶体突变株BMB171，获得含有全长基因为SEQIDNO.1所示的DNA序列。3.抗蝗虫基因工程菌杀蝗剂的制备用上述构建的基因工程菌(BMB171/7Cal)制备杀蝗剂的方法与抗蝗虫Bt菌株BTH-13杀蝗剂的制备方法相同，所采用的培养基配方为淀粉4.0%、豆饼粉2.4%、棉饼子粉1.5%、蛋白胨0.5%、酵母粉0.4%、玉米浆2.0%、MgS047H200.04%、KH2P040.2%、K2HP040.2%、CaCO:,0.1%、及a-淀粉酶(淀粉含量的1/400)。其杀蝗剂的制备过程如下乳剂生产40吨发酵罐，装料25吨，每罐接种两个茄子瓶菌种，接种温度35-37'C和发酵温度28-31°C(在此间中的温度均可实现)，恒速搅拌250r/min，通气量1:0.5-1:1.5，发酵至芽孢晶体形成并有40-50%孢晶分离时终止。消泡剂为泡敌BAPE，适量(一般为1%。)加入。发酵液经GF-105碟片式高速离心机循环离心后，仅去除约40%的上清液。在此种低倍浓縮的发酵液中按要求加入防腐剂和乳化剂等制成悬浮剂。粉剂生产低倍浓縮发酵液直接或加10%轻质碳酸钙后，以BLSA规格的高压气流喷雾干燥机进行干燥，喷雾塔进口温度195-200°C，出口温度85—90°C。制得杀蝗剂可湿性粉剂。发酵罐中的发酵情况及杀蝗剂乳剂的杀虫效果详见表2。表2发酵罐中的发酵情况及杀蝗剂乳剂的杀虫效果罐次菌体发育情况放罐pH生产周期乳剂毒力LC5020小时38小时(小时)(W/ml)1整齐同步孢晶脱落50%8.0385.32发育良好65%孢晶脱落8.0386.13发育良好60%孢晶脱落8.0385.8平均8.0385.7SEQUENCELISTING<110>中国科学院武汉病毒研究所<120>—种苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白质基因及应用<130>—种苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白质基因及应用<160〉2<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>3729<212>DNA<213>Bacillusthuringiensis<400>1agcggtatcaatgtgtatatgac犯atactcctacagggacaggtscatgattggcattc60tttacgctggtagtatttaaaacatgg朋atcgttgctccc犯tatccca120tgttattatta犯cgtttaaaatcgtattctaatattcaatgatattgtctgataaattg180aattttggtgacttacaaatattaatccttaaaaataacactgcatttca240cagtaatgcgagaaaatttactttccaaatattcaacaggagg犯tgtait300aaaca^aatgattegtgg犯tacattgaacgaagatttttct犯t3gtett360ctttggtaactgatcaaactaagattttttg犯tstg犯t420g鄉卿ttgcaccgtatgcgatgtaatttttagctcaat犯gtatcatt480cgtaccttcatgggttttgceigga^tggg3CtgCtgg3ggtattattggattatttacg540gaagtattaaga/ttactatggcctaat犯gcaaaatgatctttggg犯tcgtttatgaat600g犯gtagaggcacttattaaac8g犯gcggta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sAspGluTyrPheThrAlaThrMet580585590LysGluGlyGluAlaLeuLysTyrSerTyrLeuThrMetGlyAsnAsp595600605TyrAlaGlyThrAlaAlaGluLeuSerMetLeuTyrHelieLysAla610615620AsnThrSerAsnCysThrlieTyrlieAspLyslieGluPheliePro625630635640ValAspGluAsnTyrAsnAsnArgValGinLeuGluLysAlaGinLys645650655AlaValAsnThrLeuPheThrAlaGlyArgAsnAlaLeuGinLysAsp660665670ValThrAspPheLysValAspGinValSerlieLeuValAspCysVal675680685SerGlyGluLeuTyrProAsnGluLysArgGluLeuLeuSerLeuVal6卯695700LysTyrAlaLysArgLeuSerTyrSerArgAsnLeuLeuLeuAspPro705710715720ThrPheAspSerlieAsnSerSerGluGluAsnGlyTrpAsnGlySer725730735AsnGlyHeAlaHeGlySerGlyAspPheValPheLysGlyAsnTyr740745750LeuliePheSerGlyThrAsnAspGluGinTyrProThrTyrLeuTyr755760765GinLyslieAspGluSerLysLeuLysGluTyrThrArgTyrLysLeu770775780ArgGlyPhelieGluSerSerGinAspLeuGluAlaTyrVallieArg785790795800TyrAspAlaLysHisGluThrLeuAspValSerAsnAsnLeuLeuPro805810815AsplieProProValAsnAlaCysGlyGluProAsnArgCysAlaAla820825830LeuGinTyrLeuAspGluAsnProLysLeuGluCysSerSerlieGin835840845AspGlylieLeuSerAspSerHisSerPheSerLeuHislieAspThr850855860GlySerHeAspPheAsnGluAsnValGlylieTrpValLeuPheLys865870875880lieSerThrProGluGlyTyrAlaLysPheGlyAsnLeuGluVallie8858卯895GluAspGlyProVallieGlyGluAlaLeuAlaArgValLysArgGin900905910GluThrLysTrpArgAsnLysLeuThrGinLeuArgThrGluThrGin915920925AlalieTyrThrArgAlaLysGinAlaLeuAspAsnLeuPheThrAsp930935940AlaGinAspSerHisLeuLyslieGlyAlaThrPheAlaAlaHeVal945950955960AlaAlaArgLyslieValGinSerlieArgGluAlaTyrMetSerTrp965970975■LeuSerAspValProGlyLeuAsnTyrProliePheThrGluLeuAsn980985990AspArgValGinArgAlaPheGinLeuTyrAspValGinAsnValVal99510001005ArgAsnGlyArgPheLeuAsnGlyValLeuAspTrplieValThr101010151020SerAspValLysValGinGluGlyAsnGlyAsnAsnValLeuVal102510301035LeuSerGlyTrpAspAlaGinValLeuGinCysLeuAsnLeuTyr104010451050GinAsnArgGlyTyrlieLeuArgValThrAlaArgLysGluGly105510601065LeuGlyGluGlyTyrlieThrlieThrAspGluGluGlyAsnThr107010751080AspGinLeuThrPheGlySerCysGluAsnlieAspSerSerAsn108510901095SerPheValSerThrGlyTyrlieThrLysGluLeuGluPhePhe110011051110ProAspThrAspGinlieGinlieGlulieGlyGluThrGluGly111511201125ThrPheGinValGluSerValGluLeuPheLeuMetGluAsnLeu113011351140Cys权利要求1、一种分离的苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白质基因，其序列为SEQIDNO.1所示的DNA序列。2、—种苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白质基因所编码的杀虫蛋白质，其序列为SEQIDN0.2所示的氨基酸序列。3、一种苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白质基因在制备防治或预防蝗虫制剂中的应用。全文摘要本发明公开了一种苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白质基因及应用，杀虫晶体蛋白质基因如SEQIDNO.1所示的DNA序列，其编码的杀虫蛋白质如SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。该基因编码的杀虫蛋白质对直翅目的东亚飞蝗有特异性的毒杀作用，用该基因制备的杀蝗剂可用于危害禾本科作物如水稻、小麦、玉米、高粱和牧草等蝗虫的防治，效果好，对人和动植物安全，生产和使用成本低，不污染环境，具有巨大的应用价值。文档编号A01N63/00GK101126093SQ200710052688公开日2008年2月20日申请日期2007年7月11日优先权日2007年7月11日发明者宋玲莉,戴顺英,高梅影申请人:中国科学院武汉病毒研究所