专利名称：具有从磷酸二羟丙酮到甘油的途径被破坏的酵母细胞的制作方法
具有从磷酸二羟丙酮到甘油的途径被破坏的酵母细胞
本发明是在与美国能源部合同号DE-FC36-03GO13145下完成 的。美国政府对本发明享有某些权利。
本申请要求于2006年3月13日申请的美国临时申请号 60/781,674的优先权。
本发明涉及某种遗传修饰的酵母，并涉及使用这样的遗传修饰酵 母而生产乳酸的发酵方法。
酵母在许多工业发酵中用作生物催化剂。人们对使用酵母发酵糖
类以生产有机酸(例如乳酸)的兴趣一直在持续增加。在这样的发酵中， 随着有机酸产生得越多，发酵培养基越来越酸化。大多数产生这些有 机酸的细菌在强酸环境下表现不良——在这样的条件下它们要么无 法生存，要么生产产物缓慢，以至于经济上不可行。所以，有必要緩 冲培养基以维持较高pH。这对回收酸性形式的产品而言会带来困难。 最好在较低pH下进行发酵，在这种情况下产品部分或全部呈酸性形 式。
已经考虑了多种酵母作为这类低pH发酵的候选者。多种酵母能 天然发酵己糖而产生乙醇，但是极少(如果有的话)能天然产生高收率 的有机酸，例如乳酸。因此，已经进行了许多工作，对各种酵母进行 遗传修饰，插入一个或多个能使细胞产生乳酸的基因。为了使糖代谢 从乙醇生产转向乳酸生产，也对这些细胞进行遗传修饰，以破坏或缺 失天然丙酮酸脱羧酶(尸DQ基因。这项工作可参见例如WO 99/14335、 WO 00/71738 Al、 WO 02/42471 A2、 WO 03/049525 A2、 WO 03/102152 A2和WO 03/102201 A2。
在许多这类酵母发酵中可高收率地产生甘油。甘油可作为细胞 的渗透压保护剂。甘油的形成可有助于在发酵条件下再生氧化还原辅因子。
许多酵母细胞都产生甘油，即通过代谢磷酸二羟丙酮(DHAP)。 在多种酵母中，DHAP通过甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD,系统名称为sn-甘油-3-磷酸:NAD十2-氧化还原酶，EC 1丄1.8)还原，生成甘油-3-磷酸 (G3P)。 G3P作为脂质生物合成的前体以及甘油前体。G3P通过甘油-3-磷酸酶(GPP,系统名称为甘油-l-磷酸磷酸水解酶，EC 3丄3.21)脱去磷 酸，生成甘油。
甘油的产生有一个替代途径，该途径对某些酵母(例如粟酒裂殖 酵母(S. pom&))而言是至关重要的。在该途径中，磷酸二羟丙酮通过 磷酸二羟丙酮磷酸酶脱去磷酸，生成二羟丙酮。然后，再通过NADf^ 依賴性甘油脱氪酶(系统名称为甘油^八0+ 2-氧化还原酶，EC 1.1.1.6) 并伴随NADH氧化，使二羟丙酮转变为甘油。
因为产生甘油会消耗碳，而这些碳原本可用于产生更多所需发 酵产物，所以这类甘油的产生是收率损失的重要来源。另外，产生甘 油还会消耗ATP和NADH。这消耗了产生生物量或所需产物所需的 能量。因为这些原因，所以最好使细胞减少或消除甘油的产生。进一 步的考虑是，减少或消除甘油的产生还可简化对所需产物的回收和纯 化。
一种酿酒酵母(5Wcc/zaramyc^ cwev/w'ae)菌才朱经遗传工程缺失其 天然GPD基因，因此细胞丧失GPD酶并能阻止甘油的产生。参见 Nissen等，"Anaerobic and aerobic batch cultivations of 5"acc/zar画ycas cere由'ae mutants impaired in glycerol synthesis", F"ea^， 2000: 16:463-474。 Nissen等人报告，当两个天然GPD基因都被破坏之后， 突变细胞在厌氧和好氧条件下生长都很差。根据Nissen等，突变细胞 的甘油产量比野生型细胞少得多。Nissen等人假设，在双重缺失菌抹 中所观察的生长不良，是因为细胞NAD+贮库的缺失，因为甘油的产 生不能氧化细胞中的NADH。
最好能提供这样的酵母细胞所述细胞产生所需有机产物，而不产生或很少产生甘油，而且在好氧条件、厌氧条件或好氧条件和厌氧 条件下也能生长良好。
一方面，本发明是全基因组重复前酵母种(pre-whole genome duplication yeast species)的突变酵母细胞，所述细胞具有从磷酸二羟丙 酮到甘油的天然代谢途径的缺失或破坏。天然代谢途径的缺失或破坏 可包括至少一个天然甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)基因的缺失或破坏。天 然代谢途径的缺失或破坏可包括至少一个天然甘油-3-磷酸酶(GPP)基 因的缺失或破坏。它可包括至少一个天然甘油-3-磷酸脱氬酶(GPD)基 因和至少一个天然甘油—3-磷酸酶(GPP)基因的缺失或破坏。天然代谢 途径的缺失或破坏可包括至少一个天然二羟丙酮磷酸磷酸酶基因的 缺失或破坏、天然甘油脱氢酶基因的缺失或破坏、或这两个基因同时 都缺失或破坏。
另一方面，本发明是全基因组重复前酵母种的突变酵母细胞，所 述突变细胞当在以下标准微好氧条件下进行培养时，产生2.0 g/L以下 的甘油
A. 成分确定的含水培养基，其在培养开始时含有5g/L硫酸铵、 3g/L磷酸二氢钾、0.5g/L硫酸镁、痕量元素、维生素、150g/L葡萄 糖；
B. 培养开始时pH为3.5，培养期间如有必要则緩沖发酵培养基 以防pH降至3.0以下或升至7.0以上；
C. 接种酵母细胞培养至OD6oo为1.0;
D. 培养温度30。C;
E. 持续培养直到葡萄糖浓度降至10g/L，但不超过120小时；
F. 通气和搅拌以达到才聂氧率为5.0± 1.0mmol/L/hr。 另一方面，本发明是全基因组重复前酵母种的突变酵母细胞，所
述细胞缺乏产生活性甘油-3-磷酸脱氢酶(GDP)的能力。对于本发明的 目的，与野生型菌抹酶活性相比，当细胞中某酶的活性降低至少75%、 优选至少90%时，就认为细胞缺乏产生该酶的能力。可以采用合适测定方法，检测任一特定酶的酶活性。市售测定试剂盒可用于测定甘油
-3-磷酸脱氢酶活性。这类产品的一个实例称为MK426 (Takara Bio, Inc.), 得自Fisher Scientific, Pittsburgh, Pennsylvania。
另一方面，本发明是全基因组重复前酵母种的突变酵母细胞，所 述细胞缺乏产生活性甘油-3-磷酸酶的能力。
另一方面，本发明是突变酵母细胞，所述细胞缺乏产生活性磷酸 二羟丙酮磷酸酶的能力，而野生型酵母细胞可天然产生该酶；所述细 胞缺乏产生活性NADJ^依赖性甘油脱氢酶的能力，而野生型酵母细 胞可天然产生该酶；或所述细胞同时缺乏产生这两种酶的能力。
另一方面，本发明是突变酵母细胞，所述细胞经过遗传修饰而产 生有机酸产物，所述酵母细胞还具有从磷酸二羟丙酮到甘油的天然代 谢途径的缺失或破坏和从丙酮酸到乙醇的天然代谢途径的缺失或破 坏。天然代谢途径的缺失或破坏可包括至少一个天然甘油-3-磷酸脱氢 酶基因的缺失或破坏。天然代谢途径的缺失或破坏可包括至少一个天 然甘油_3-磷酸酶基因的缺失或破坏。它可包括至少一个天然甘油-3-磷酸脱氢酶基因和至少一个天然甘油-3-磷酸酶基因的缺失或破坏。
已经发现，本发明的细胞在发酵条件下进行培养时，产生的甘油 水平非常低。在发酵条件的范围内，发现甘油产量低于0.2g/L。令人 吃惊的是，本发明的细胞在发酵条件下生长良好，尽管缺乏甘油产生， 而且在某些实施方案中尽管缺乏甘油-3-磷酸产生。也发现本发明的细 胞在某些情况下具有改善的耐酸性。因此，本发明也是发酵方法，其 中在发酵条件下培养本发明上述方面的任一项的细胞，产生发酵产 物，其中碳源至甘油的收率低于2%(重量)。
图1是描述pBH158质粒的图。 图2是描述pBH159质粒的图。 图3是描述pBH160质粒的图。 图4是描述pBH161质粒的图。图5是描述pMM28质粒的图。 图6是描述pMI318质粒的图。 图7是描述pMI321质粒的图。 图8是描述pMI355质粒的图。 图9是描述pMI357质粒的图。
图10是描述pMI433质粒的图。
图11是描述pMI449质粒的图。
图12是描述pMI454质粒的图。
图13是描述pBH165质粒的图。
图14是描述pTMC61质粒的图。
-饰而
制备的。当宿主酵母细胞为野生型菌抹时，能天然代谢至少一种糖产 生甘油。天然代谢途径可包括从磷酸二羟丙酮至甘油-3-磷酸再至甘油 的代谢途径。天然途径可包括从^畴酸二羟丙酮至二羟丙酮再至甘油的 代谢途径。宿主细胞可含有这两种天然代谢途径。
当在本文中用于遗传材料(例如基因、启动子、终止子或其它DNA 序列)时，术语"天然"是指该种酵母的野生型细胞基因组内存在的遗 传材料(除了不影响功能的一对一突变之外)。"天然能力"(及其变形 例如"天然能够")是指野生型细胞表现指定功能的能力。例如，如果 某种野生型细胞在任何遗传修饰之前具有代谢糖产生甘油的能力，则 认为这种细胞具有天然能力。如果某基因在细胞内的功能是产生活性 蛋白，就认为该基因在细胞内是"功能"基因。"天然途径"或"天 然代谢途径"是指在该种酵母的野生型细胞中存在并具有活性的代谢 途径。如果某种酶在该种酵母的野生型细胞中以活性形式产生的话， 就认为该酶是由该种酵母"天然产生的"。
在本发明中，当用于任何遗传材料时，"外源"是指对宿主细胞 而言不是天然的。对本发明某些实施方案合适的宿主酵母细胞包括这样的酵母
细胞所述细胞并非来自经历古代( 1亿年前)全基因组重复事件的细 月包系,参见Wolf等,"Molecular evidence for an ancient duplication of the entire yeast genome", Nature 387， 708-713 (1997)(在下文称为"Wolf等 1997" ), Langkjaer等，"Yeast genome duplication was followed by asynchronous differentiation of duplicated genes", Nature 421, 848-852 (2003)和Merico等,"Fermentative lifestyle in yeasts belonging to the Saccharomyces complex", FEBS Journal 274, 967-989 (2007)(在下文称 为"Merico 2007")。这样的酵母细胞是来自 一种或多种存在于全基 因组重复事件时期的其它酵母细胞系，在本文中称为"全基因组重复 前酵母(pre-whole genome duplication yeast)"。全基因组重复事件可看 作是来自酿酒酵母CSacc/wrawFas cerev/w'oe)和其它酵母在发酵能力 进化上的关键，这些酵母都来自发生基因组重复的共同祖先(Merico 2007)。在基因组重复中重复的一组基因包括编码甘油-3-磷酸脱氢酶 和甘油-3_磷酸酶的基因，以及编码富马酸还原酶的基因，富马酸还原
酶也参与维持氧化还原平衡(Wolfe等1997)。
其中合适的全基因组重复前酵母细胞是半子嚢菌酵母细胞。半子 嚢菌酵母是单细胞酵母，隶属于酵母目CS"cc/z"raw_yceto/es)。
其它合适的酵母细胞包括酵母复合群(Saccharomyces complex)的 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13或14进化枝(clade)的任何成员，参见Kurtzman 和 Robnett， "Phylogenetic relationships among yeasts of the 'Saccharomyces complex' determined from multigene sequence analyses.", FEMS Yaest Res.第4巻，第417-432页，图9 (第430页)(2003),通 过引用结合到本文中。这些进化枝分别命名为接合酵母属 (Zygoracc/wrcwyca ) 、 4妄合有孑包圓酵母属jpora)、有孑包圓酵 母属(7brw/os; ora)、丄ac/zm7cea、克鲁维酵母属(X/w"growycay)、々支嚢 酵母属C&^,f/ ec/蘭)、有孑包汉逊酵母属(//o"化"z'邵ora)和类酵母属 (/Sacc/zaromycotfes)， 参见Merico 2007,出处同上并参见ATwWzwa""，of/ier mem6ers o/f/ze /Sacc/iaramycetoceae ..." FEMS1 yaes^ T es.第4巻: 第233-245页(2003)(在下文称为"Kurtzman 2003")。
其它合适的酵母细胞包括(但不限于)隶属于以下属的酵母细胞 假丝酵母属(Cam//^)、酵母属(&cc/2aram_ycM)、裂殖酵母属 (Sc/z/zcwacc/zaramyces)、 克鲁维酵母属(A7wyveramyces)、 毕赤酵母属 (户/c/w'a)、 {尹萨酵母属(/wafc/^"h'")和汉逊酵母属(7/ame"w/力。
特别感兴趣的 一 类宿主细胞包括东方伊萨酵母(/wa^/^"yb'(3 ^7^似//"/陆生伊萨酵母(/. fem'co/a)进化枝中含有的任何物种。使用以 下文献所述的方法，通过分析酵母26S核糖体DNA的可变Dl/D2区， 鉴定东方伊萨酵母/陆生伊萨酵母进化枝的成员Kurtzman和Robnett， 载于"Identification and Phylogeny of Ascomycetous Yeasts from Analysis of Nuclear Large Subunit (26S) Ribosomal DNA Partial S叫uences，，， ^"tom'e v朋丄eemve"/70eA: 73:331-371， 1998，通过引用结合 到本文中(在下文称为"Kurtzman和Robnettl 998")。具体参见第349 和361页。对上百种子嚢菌26S核糖体DNA的可变Dl/D2区进行分 析表明，东方伊萨酵母/陆生伊萨酵母进化枝含有密切相关物种。与这 些进化枝之外的酵母种类相比，东方伊萨酵母/陆生伊萨酵母进化枝与 该进化枝内的其它成员在26S核糖体DNA的可变Dl/D2区上表现出 更大的相似性。因此，釆用Kurtzman和Robnett的方法，可通过比较 东方伊萨酵母/陆生伊萨酵母进化枝的相应核糖体DNA的Dl/D2区， 并与该进化枝的其它成员和进化枝以外的密切相关种类进行比较，鉴
定东方伊萨酵母/陆生伊萨酵母进化技的其它成员。东方伊萨酵母/陆 生伊萨酵母进化枝内的酵母都是在更宽的毕赤酵母/伊萨酵
母/&^""/^70^/德克拉酵母(/)^^^)进化枝内的半子嚢菌酵母。另一
类感兴趣的宿主细胞是东方伊萨酵母/发酵毕赤酵母(尸./enwewtora)进 化枝，参见Kurtzman和Robnett 1998。该进化枝是最末端的进化枝， 至少含有东方伊萨酵母、尸z'c/^gato/om^、毕赤酵母nW邦(NRRL 命名)、乙醇々i丝酵母(Qz"W(i" d/7fl"o//ca)、户.afeseW/co/(3、膜醭毕赤酵母(P. we附&ramy^cz'em:)和发酵毕赤酵母(^P. /er附e"tora)。
特别感兴趣的其它宿主细胞是酵母复合群的克鲁维酵母属进化 枝内含有的任何物种，参见(作为进化枝11) Kurtzman和Robnett, "Phylogenetic relationships among yeasts of the 'Saccharomyces complex' determined from multigene sequence analyses.". F￡MS 7kw/1及&s.第4巻: 第417_432页，图9(第4!30页)，(20(B),通过引用结合到本文中，和 Kurtzmann, "Phylogenetic circumscription of Saccharomyces, Kluyveromyces and other members of the Saccharomycetaceae ...，， F五MS" TeaW 第4巻，第233-245页，
图1 (2003)(在下文称为 "Kurtzman 2003")，通过引用结合到本文中。使用Kurtzman 2003所 述的多基因序列分析方法，克鲁维酵母属进化枝至少包括克鲁维酵母 OS. Ww"en')、海尼克鲁维酵母(i:. "e^w"o^)、非发酵克鲁维酵母(尤 "o"/wme"to附)、乳酸克鲁维酵母(K /""/c)、马克斯克鲁维酵母(尺 ww;da"w力和多布克鲁维酵母(K ^fote/wraAr/f)，并且还将包括该进化枝 内的其它物种。
对这类酵母细胞特别感兴趣的是，当经遗传修饰后能产生有机
酸，尤其是乳酸。 一般而言，优选来自假丝酵母属、克鲁维酵母属和 伊萨酵母属的宿主细胞。在突变细胞产生有^/L酸的实施方案中，以及
在突变细胞产生除有机酸之外的另 一种发酵产物(例如乙醇)的情况 下，特别优选上述来自克鲁维酵母和东方伊萨酵母/发酵毕赤酵母进化 枝的宿主细胞。特别优选的宿主细胞是C. ^"o"ra&、马克斯克鲁维 酵母、耐热克鲁维酵母(A". ^z6rwoto/enms)、 C. ,//za/7osor6oraf和东方 伊萨酵母。最优选的细胞是马克斯克鲁维酵母、C. so"o^m^和东方 伊萨酵母。当首次表征东方伊萨酵母时，命名为库德齐维氏毕赤酵母 (尸/c/z/" fe^n'avzev//)。东方伊萨酵母的无性形式称为克鲁斯氏假丝酵母 yb^w)。马克斯克鲁維酵母和C. ^"w^w^的合适菌纟朱包括 以下文献中介绍的那些WO 00/71738 Al、 WO 02/42471 A2、 WO 03/049525 A2、 WO 03/102152 A2和WO 03/102201A2。东方伊萨酵母 的合适菌林是ATCC菌抹32196和ATCC菌林PTA-6648。至于代谢途径的"缺失或破坏"，是指与野生型细胞相比，该
途径完全不起作用，或者其活性降低至少75%、优选至少90%。可通 过减少所产生的活性酶的数量，通过降低所产生的活性酶的活性，或 通过这两种方式的组合，就可降低某个途径的活性。至于基因的"缺 失或破坏"，是指消除(缺失)基因的完整编码区，或修饰(例如通过缺 失、插入或突变)基因编码区、其启动子、和/或其终止区，使得该基 因不再产生活性酶，该基因产生活性酶的数量急剧减少(至少减少 75%，优选至少减少90%)，或该基因产生的酶的活性急剧下降(至少 下降75%,优选至少下降90%)。
大多数情况下，天然代谢途径的缺失或破坏将会包括至少一个 GPD基因的缺失或破坏、至少一个GPP基因的缺失或破坏，或这两 种基因同时缺失或破坏。在具有基于磷酸二羟丙酮磷酸酶和甘油脱氢 酶的替代代谢途径的细胞(例如粟酒裂殖酵母)中，天然代谢途径的缺 失或破坏通常会包括磷酸二羟丙酮磷酸酶基因的缺失或破坏、甘油脱 氬酶基因的缺失或破坏、或这两种基因同时缺失或破坏。在具有这两 种途径的细胞中，这两种途径可同时发生缺失或破坏。
本文所用的术语"甘油-3-磷酸脱氢酶基因"和"GPD基因"是 指(a)编码具有甘油-3 -磷酸脱氢酶活性的蛋白质的任何基因和/或(b)编 码与SEQ. ID. NO. 1 、 SEQ. ID. NO. 2、 SEQ. ID. NO. 3 、 SEQ. ID. NO. 4、 SEQ. ID. NO. 5、 SEQ. ID. NO. 6或SEQ. ID. NO. 7所示的任何氨基 酸序列具有至少50%、优选至少60%和更优选至少65%同一性的酶的 任何染色体DNA序列。"甘油-3-磷酸脱氢酶活性"是指蛋白质催化 DHAP至甘油-3-磷酸的反应的能力。就本发明的目的而言，DNA、 RNA或蛋白质的氨基酸序列的。/。同一性可用BLAST (NCBI Basic Local Alignment Search Tool) 2.2.1版软件(用默认参数)，方便地 计算出来。用BLAST 2.2.13版算法(用默认参数)，认为同一性评分为 至少XX。/。的序列就是至少XX。/。同一性。BLAST软件可得自国立生 物信息中心(National Center for Biological Information, Bethesda,Maryland)-
同样，本文所用的"甘油-3-磷酸酶基因"和"GPP基因"是指(a) 编码具有甘油-3-磷酸酶活性的蛋白质的任何基因和/或(b)编码与SEQ. ID. N0.8、 SEQ. ID. NO. 9、 SEQ. ID. NO. 10、 SEQ. ID. NO 11或SEQ.
ID. NO 12所示的任何氨基酸序列具有至少50%、优选至少60%和更 优选至少65。/。同一性的蛋白质的任何染色体DNA序列。"甘油-3-磷 酸酶活性"是指蛋白质催化甘油-3-磷酸脱磷酸而生成甘油的能力。
本文所用的术语"磷酸二羟丙酮磷酸酶"基因是指编码具有磷酸 二羟丙酮磷酸酶活性的蛋白质的任何基因。本文所用的"甘油脱氬酶" 基因是指(a)编码具有甘油脱氢酶活性的蛋白质的任何基因和/或(b)编 码与SEQ. ID. NO. 13所示的氨基酸序列具有至少50%、优选至少60% 和更优选至少65%同一性的蛋白质的任何染色体DNA序列。"磷酸 二羟丙酮磷酸酶活性"是指蛋白质催化磷酸二羟丙酮至二羟丙酮的反 应的能力。"甘油脱氢酶活性"是指蛋白质催化二羟丙酮至甘油的还 原反应的能力。
任何上述基因的缺失或破坏可通过强制进化、诱变或基因工程方 法来完成，然后再经过合适的选择或筛选，以鉴定所需突变体。
在诱变方法中，在足以达到细胞高死亡率(60-99.9%，优选 卯-99.9%)的条件下，将细胞暴露给紫外辐射或诱变剂。然后将存活细 胞倒平板并选择或筛选代谢活性缺失或破坏的细胞。在产甘油能力下 降的基础上筛选具有所需突变的细胞。任何上述基因的破坏或缺失可 通过PCR或DNA印迹分析方法来证实。
可通过设计和构建合适的缺失构建体并用这些构建体转化细胞， 就可通过一个或多个步骤，方便地完成缺失或破坏通向甘油的代谢途 径的遗传工程。本文所用的术语"构建体"是指用于转化细胞的DNA 序列。构建体可以呈例如环状质粒或载体的形式，线状质粒或载体的 形式，可以是环状质粒或载体的一部分(例如用 一种或多种限制酶消化 质粒或载体而得到)，或者可以是用质粒或载体作为模板而制备的PCR产物。进行选择或筛选以鉴定成功的转化子。可采用电穿孔和/或化学
(例如基于氯化4丐或乙酸锂)转化方法。
有关缺失构建体的以下讨论同样也可用于任何甘油-3-磷酸脱氢 酶基因、甘油-3-磷酸酶基因、磷酸二羟丙酮磷酸酶基因或甘油脱氬酶 基因的缺失或破坏。
可通过首先克隆靶基因的两个DNA序列和/或其上游(5，)或下游 (3')侧翼区，方便地装配缺失构建体。序列优选是不连续的，但也可 以是连续的，如果在构建体的序列之间插入额外遗传物质(例如选4奪标 记盒)的话。在这种情况下，"不连续"是指DNA序列在野生型基因 组中并非彼此密切邻接，而是在野生型基因组中彼此被要缺失的区域 间隔开，以便缺失或破坏基因。"连续，，序列是在野生型基因组中彼 此直接邻接的序列。 一个这样的序列可包括在5'与靶基因启动子连接 的区、全部或部分启动子区、全部或部分靶基因编码区或其组合。其 它序列可包括在3，与靶基因终止子连接的区、全部或部分终止区、和/ 或全部或部分靶基因编码区。然后产生缺失构建体，其含有方向相同 的两个序列，其彼此关系正如它们在宿主细胞染色体上天然存在的那 样。通常，将选择标记克隆在序列之间，以便选择转化子，详述如下。 该构建体用于转化宿主细胞。可采用电穿孔和/或化学(例如基于氯化 4丐或乙S臾锂)转化方法。
在成功的转化子中，靶基因的基因座的同源重组事件31起功能基 因的破坏或缺失。在该重组事件中缺失全部或部分天然靶基因、其启 动子和/或终止子。如果缺失构建体在来自靶基因座的两个序列之间含 有遗传物质(例如选择标记盒或结构基因盒)，则遗传物质插入到宿主 细胞基因组的缺失物质的基因座上。可通过PCR分析或DNA印迹分 析证实发生了所需缺失。
通常最好是缺失构建体也可包含功能性选择标记盒。但使用 一个 缺失构建体时，标记盒处于耙基因座5'序列的载体下游(即在3'方向) 和靶基因座3'序列的上游(即在5'方向)。成功的转化子将会含有选择标记盒，这赋予成功转化细胞某些特性，可作为选择基础。"选择标 记基因"是编码转化细胞在选择培养基中存活和/或生长所必需的蛋白
质的基因。通常，选择标记基因编码这样的蛋白质所述蛋白质(a)赋 予抗生素抗性或其它毒素抗性，这些抗生素例如零霉素(zeocin)(印度 斯坦链异壁菌(S r印toa〃o^'c/zi^ /7/m/ustoww力We博来霉素抗性基因)、 (Tn卯3的卡那霉素抗性基因)或潮霉素(大肠杆菌的氨基糖苷类 抗生素抗性基因)，(b)补充细胞的营养缺陷(例如氨基酸亮氨酸缺陷(马 克斯克鲁维酵母基因)或尿嘧啶缺陷(例如马克斯克鲁维酵母或 酿酒酵母的WM3基因))；(c)使细胞能够合成无法得自简单培养基的 关键性营养，或(d)赋予细胞在特定碳源上生长的能力(例如酿酒酵母 的M五丄5基因，该基因编码a-半乳糖苷酶(蜜二糖酶)并赋予在唯一石友 源上生长的能力)。优选的选择标记包括零霉素(zeocin)抗性基因、G418 抗性基因、M5丄5基因和潮霉素抗性基因。另 一个优选的选择标记是L-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶(Cra2)基因盒，其使宿主细胞天然缺 乏该基因或其天然CT52基因最初已缺失或破坏。
选择标记盒还将包含启动子和终止序列，其与选择标记基因有效 连接并可在宿主细胞中操作。 一种合适类型的启动子是与酵母基因天 然启动子具有至少50%、 70%、 90%、 95%或99%同一性的启动子。 更合适的一类启动子是与酵母基因天然启动子具有至少50%、 70%、 卯％、 95%或99%同一性的启动子。特别有用的启动子包括丙酮酸脱 羧酶(户Z)C7)、磷酸甘油酸激酶OPGX)、木糖还原酶(义i )、木糖醇脱氢 酶(义D/^)、 L-(+)-乳酸-细胞色素c氧化还原酶(CT52)、翻译延伸因子-1 (7EF7)和翻译延伸因子_2 (:TEi^)基因的启动子，尤其是来自宿主细胞 相应基因的启动子。 一个尤其有用的启动子包括宿主细胞天然的 尸DC7、尸G尺、7E^7或7EF2基因的启动子的功能部分，或与这类 户ZX7、 PG《、7EF7或7EF2启动子具有至少80%、 85%、 90%或95% 同一性的序列。
一类合适的终止子是与酵母细胞天然基因的终止子具有至少50%、 70%、 90°/。、 95%或99°/。同一性的终止子。终止子可以是与宿主 细胞天然基因的终止子具有至少50%、 70%、 90%、 95%或99%同一 性的终止子。特别有用的终止子包括丙酮酸脱羧酶(尸Z)C7)、木糖还原 酶(^R)、木糖醇脱氢酶(ID/i)、 L-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶 (CT52)或异-2-细胞色素c (CFC)基因的终止子，或酵母的半乳糖基因 家族的终止子，特别是所谓的Gv!L川终止子。 一个特别优选的终止子 包括宿主细胞天然的04ZJ0基因的终止子的功能部分，或与这类终止 子具有至少80%、 85%、 90%或95°/。同一性的序列。
可以设计缺失构建体，使选择标记盒能够因随后的同源重组事件 而发生自发缺失。要完成这一步的一个便利方式就是设计载体，使结 构基因盒侧接直接重复序列。直接重复序列是宿主细胞天然或非天然 的相同DNA序列，在构建体上呈各自相同的方向。直接重复序列的 长度最好是约50-1500 bp。直接重复序列不必编码任何东西。该构建 体允许同源重组事件发生。这样的事件发生频率较低，导致细胞含有 缺失的选择标记基因和一个直接重复序列。有必要将转化子在非选择 性培养基上培养几轮，让一些细胞中发生自发同源重组。可根据自发 缺失选择标记基因的细胞缺乏选择标记基因所赋予的选择特性，来选 择或筛选这样的细胞。
靶基因缺失构建体也可含有结构基因盒，也位于5'侧翼区下游和 3，侧翼区上游，但优选不在所具有的任何选择标记盒之内。这类构建 体允许靶基因的自发缺失和结构基因的插入。所称"结构基因"，是 指编码蛋白质的任何基因，而不是如上所述的靶基因或选择标记基 因。各种各样的结构基因都可使用，但本发明特别感兴趣的基因是赋 予细胞产生有机酸能力的基因，或赋予细胞消耗特定碳源(例如戊糖) 的能力的基因。
在使用选择标记的情况下，可用一对缺失构建体(而非一个缺失 构建体)进行转化。构建体对中的一个可含有来自耙基因座的第一序列 和标记基因盒的一个非功能部分。构建体对的另 一个则可含有来自靶基因座的第二序列和标记基因盒的另 一个非功能部分。选择一起构成 完整盒的标记基因盒的两部分。标记基因盒的两部分的每一端都共享 共同序列，即部分盒在两部分的每一端都重复。用它们自发转化细胞， 形成所需的缺失或破坏，并形成完整的功能性标记或结构基因盒。细 胞比例将会在耙基因座上同源整合两种缺失构建体，并进行新的同源 重组事件，以便从两个非功能片段重构功能性选择基因盒。根据选择 标记所赋予的特性，选择成功的转化子。
当细胞的天然代谢途径包括磷酸二羟丙酮至甘油-3-磷酸再至甘 油的途径(通过GDP和GPP酶)时，无论是GDP基因还是GPP基因都 可发生缺失或破坏。GDP基因和GPP基因可同时缺失。在这种情况 下，GDP基因和GPP基因的缺失或破坏可同时发生或序贯发生。如 果细胞含有多个GDP基因或GPP基因，或所述基因的多个多等位基 因，优选它们在细胞中的功能全都缺失。当细胞的天然代谢途径包括 磷酸二羟丙酮至二羟丙酮再至甘油的途径(通过磷酸二羟丙酮磷酸酶 和甘油脱氢酶)时，无论是磷酸二羟丙酮磷酸酶还是甘油脱氬酶基因都 可发生缺失或破坏。磷酸二羟丙酮磷酸酶或甘油脱氢酶基因都可缺失 或破坏，这可以是同时发生或是序贯发生，这样的序贯发生可按任何 顺序进行。如前所述，所述基因的多功能拷贝或等位基因优选都缺失。
在本发明的某些方面，细胞能产生所需有机酸(或其盐)。这种能 力表现为，在至少一组发酵条件下培养时，能将至少5%、至少10%、 至少50%、至少70%、至少80%或至少90%(重量)的碳源转化为所需 有机酸。因为几乎没有酵母细胞具有产生这些酸的天然能力，所以本 发明的细胞在大多数情况下含有能让细胞产生该有机酸的至少一个 功能性外源基因。
特别感兴趣的细胞产生乳酸(盐)，其中这是指乳酸或其盐。在这 样的情况下，本发明的细胞含有整合到其基因组上的至少 一个功能性 外源乳酸脱氪酶CLD/Z)基因。丄D/Z基因是编码功能性乳酸脱氢酶的基 因。功能性丄D/Z酶是催化丙酮酸(盐)还原成乳酸(盐)的酶。丄DZ/基因是对L-Z^/Z或D-LD7/的产生具有特异性，这两种物质分别能使细胞 产生L-或D-乳酸对映体(或其盐)。本发明的修饰细胞可能含有L-和 D-丄D/Z基因，因此能够产生乳酸对映体。然而，优选仅有L-丄Z)Z/基 因或仅有D -ZD/f基因存在，使细胞产生更多光学纯的乳酸产物。
合适的LD/Z基因包括来源于细菌、真菌、酵母或哺乳动物的LD// 基因。L-LD7/基因的具体实例是得自瑞士乳杆菌(丄./^/vWcw)、干酪 乳杆菌(丄.c"化/)、巨大芽孢杆菌(及megWeWwm)、乳酸片球菌(尸. acW/a^d)和牛来源的那些。D-LDZ/基因的具体实例是得自瑞士乳杆 菌(丄.肠e"面)、约氏乳杆菌(丄.乂o/z腳m7)、保加利亚乳杆菌(丄. 6w/gar/ctw)、德、氏乳4干菌(丄.(ie/Z)rwech7)、才直物享L^干菌(丄./ /awtonw2)牙口 戊糖乳杆菌(丄.； e"toyw力的那些。与这些L-丄P7/或D-丄Dif基因相同或 具有至少80%同一性的功能基因是合适的。必要时，可对得自这些来 源的天然基因进行诱变，以提供用常用真核起始密码子(ATG)起始的 编码序列，或为了其它目的。优选的L-丄D//基因是得自瑞士乳杆菌 的L-丄D7/基因或与所述基因具有至少80%、 85%、 90%或95%同一性 的L-丄DZ/基因。另一个优选的L-丄D//基因是得自巨大芽孢杆菌 的L-丄D/Z基因或与所述基因具有至少80%、 85%、卯％或95%同一性 的L-丄Z)7/基因。 一个优选的D-丄Di/基因是得自瑞士乳杆菌的D-ZZ>// 基因或与所述基因具有至少80%、 85%、 90%或95%同一性的D-丄D// 基因。
特别合适的丄D/Z基因包括这样的基因其编码的酶的氨基酸序 列与WO 03/049525的SEQ. ID. NO. 45或与WO 03/049525的SEQ. ID. NO. 49具有至少60%、尤其是至少80%、 85%或95%同一性。特别合 适的丄D/Z基因还包括这样的基因其编码的酶的蛋白质序列与WO 03/049525的SEQ ID. NO. 46或50具有至少60%、 80%、 85%或95% 同一性。
转化细胞可含有单个丄D/Z基因或多个丄￡>//基因，例如1-10 个丄D/Z基因，尤其是1-5个丄DZ/基因。当转化细胞含有多个丄D/7基因时，每个基因可以是同一基因的拷贝，或者每个基因包含两个或更
多不同LD7/基因的拷贝。多拷贝的外源丄D/Z基因可以整合在宿主细 胞基因组的同 一基因座上(这样它们就彼此邻接)或在若干基因座上。
外源丄D/7基因处于一个或多个启动子和一个或多个终止子的转 录控制之下，这样的启动子和终止子在修饰酵母细胞中具有功能。对 选择标记基因盒合适的启动子和终止子如上所述，也可参见WO 99/14335、 WO 00/71738、 WO 02/42471、 WO 03/102201 、 WO 03/102152 和WO 03/049525。 一个特别有用的启动子包括宿主细胞PZX7、户GK、 7E尸7或7EF2基因的启动子功能部分或与该启动子具有至少80%、 85%、 90%或95%同一性。 一个特别优选的终止子包括宿主细胞PDC 基因的终止子功能部分或与其具有至少80%、 85%、 90%或95%同一 性。
当多个外源丄Di/基因引入宿主细胞时，不同LD//基因可能处于 不同类型的启动子和/或终止子控制之下。
外源丄D//基因可随机整合在宿主细胞基因组中或插入到 一个或 多个靶位置上。耙位置的实例包括希望发生缺失或破坏的基因的基因 座，例如PDC7基因、甘油-3-磷酸脱氢酶基因、甘油3-磷酸酶基因、 磷酸二羟丙酮磷酸酶基因或甘油脱氢酶基因的基因座。可将外源ZX>// 基因盒放入构建体中，用于缺失或破坏甘油-3-磷酸脱氬酶、甘油-3-磷酸酶、磷酸二羟丙酮磷酸酶或甘油脱氢酶的基因，而且其方式是可 以同时插入到这些基因的基因座上以发生缺失或破坏它们。
转化酵母细胞以引入外源丄D//基因盒的方法可参见WO 99/14335、 WO 00/71738、 WO 02/42471 、 WO 03/102201 、 WO 03/102152 和WO 03/049525。这类方法可用于本发明。
也可修饰细胞，使之产生一种或多种其它有^L酸。例如，用编码
功能性p-丙氨s吏/丙酮酸氨基转移酶的外源基因盒转化细胞，使细胞能
够产生3-羟基丙酸。达到该目的的方法可参见WO2005/118719。
本发明的遗传修饰酵母细胞可包含给细胞提供一个或多个所需贡献的额外遗传修饰。
在某些实施方案中，特别感兴趣的额外修饰包括丙酮酸脱羧酶基 因的缺失或破坏。这可降低细胞产生乙醇的能力，这在有机酸(例如乳
酸)是所需产物的情况下特别有利。如果宿主细胞含有多个PZ)C基因， 特别优选所有户Z)C基因都缺失或破坏，尽管也可以缺失更少的这类 尸DC基因。使用以下文献所述的类似方法，可使尸DC发生缺失WO 99/14335、 WO 02/42471、 WO 03/049525、 WO 03/102152和WO 03/102201。也可通过同时插入IZ)/f基因盒或其它结构或选择标记基 因盒，而使尸DC发生缺失。在特别感兴趣的方法中，(l)克隆PDC基 因的基因座的不连续序列，(2)产生含有不连续序列的构建体，和(3) 用构建体转化宿主细胞。在部分转化子中，同源重组事件引起功能性 尸DC基因的缺失或破坏。必要时可重复该事件，以缺失或破坏多个 尸DC基因或等位基因。在某些种类的酵母(例如东方伊萨酵母)中，存 在密切同源的多个PZ)C基因或等位基因。在至少某些这样的实例中 已经发现，来自基因或等位基因的基因座的不连续序列可用于构建
体，以缺失或破坏尸zx:基因或等位基因。用于破坏PDC基因的构建
体可包含一个或多个功能性标记或结构基因盒，其插入到天然PDC 基因5'侧接部分的下游和天然尸DC基因3'侧接部分的上游。该方法 允许在一个转化步骤中缺失尸DC基因并插入功能基因盒。
另一个感兴趣的额外修饰是单独或共同赋予细胞发酵戊糖而产 生所需发酵产物的能力。后一类修饰是(l)插入功能性木糖异构酶基 因，(2)缺失或破坏能产生催化木糖转化为木糖醇的酶的天然基因，(3) 缺失或破坏功能性木糖醇脱氢酶基因和/或(4)引起细胞过量表达功能 性木酮糖激酶的修饰。将这些修饰引入酵母细胞的方法可参见例如 WO 04/099381，通过引用结合到本文中。插入功能性木糖异构酶基因、 缺失或破坏能产生催化木糖转化为木糖醇的酶的天然基因、缺失或破 坏功能性木糖醇脱氢酶基因、以及修饰细胞以过量表达功能性木酮糖 激酶的合适方法，可参见例如WO 04/099381,通过引用结合到本文中。对本发明产乳酸细胞的另一个特别感兴趣的额外修饰包括缺失
或破坏至少一个L-或D-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因。
一般而言，本发明细胞的特征是合成甘油的能力下降。评价细胞 合成甘油能力的一种有用方法是通过在上述标准微好氧条件下培养 细胞。使用一种成分确定的含水发酵培养基，其在培养开始时含有 5g/L硫酸铵、3g/L磷酸二氢钾、0.5g/L硫酸镁、痕量元素、维生素 和150 g/L葡萄糖。培养开始时将pH调节到3.5。培养期间允许pH 在范围内自由变动，除非在培养期间有必要緩冲发酵培养基，以防pH 降至3.0以下或升至7.0以上。用足量的酵母细胞接种发酵培养基， 其经评价产生OD幼。1.0。培养温度为30°C。持续培养直到葡萄糖浓度 降至5g/L,但不超过120小时。培养期间，选4奪通气和搅拌条件以达 到摄氧率为5.0±1.0mmol/L/hr。在这些标准条件下，本发明的细胞通 常产生不超过2.0g/L的甘油。更通常的是，在这些标准条件下它们产 生不超过0.6g/L的甘油，在大多数情况下，在这些标准条件下它们产 生不超过0.2g/L的甘油。在这些标准樣i好氧条件下，优选的细胞还产 生至少10 g/L的至少一种所需发酵产物，例如乙醇或有^/L酸(例如乳 酸)。在这些条件下，细胞更优选产生至少40g/L、尤其是至少50g/L 所需发酵产物。
可在如上所述的标准微好氧条件下或任何其它有用的发酵条件 下培养本发明的细胞，以产生一种或多种所需发酵产物。乙醇是多种 酵母可天然产生的发酵产物的一个实例。如上所述，可修饰细胞，使 之产生其它所需发酵产物，包括有机酸，例如乳酸或3-羟基丙酸。也 可修饰细胞，以产生其它发酵产物，包括其它酸或并非酸的其它产物。
在本发明的发酵方法中，在包含转化细胞可发酵的碳源的发酵培 养基中培养本发明的细胞。碳源可以是己糖(例如葡萄糖)、或葡萄糖 的寡聚物或其它多聚物，例如聚糖、麦芽糖、麦芽三糖或异麦芽三糖。 碳源可以是另一种己糖，其中潘糖、果糖、果糖及其相应的寡聚物和 多聚物都是实例。如果细胞天然具有或经修饰具有发酵戊糖的能力，则碳源可包括戊糖(例如木糖)或者木糖寡聚物或多聚物(例如木聚糖)。 这类戊糖是含半纤维素生物量的合适水解产物。就寡聚糖而言，有必 要将酶加入到发酵肉汤中，以将它们消化成相应的单糖，用于细胞发 酵。
培养基通常含有特定细胞所需的营养物质，包括氮源(例如氨基 酸、蛋白质、无机氮源例如氨或铵盐等)和各种维生素、矿物质等。可 使用所谓的"复合培养基"或所谓的"成分确定"培养基。
认为温度、细胞密度、底物选择、营养物选择等其它发酵条件都 不是本发明的关键，通常选择这些条件以提供经济的方法。各生长周
期和生产周期的温度范围从培养基的冷冻温度至约50°C,尽管这在某 些程度上取决于菌抹耐受高温的能力。优选的温度、尤其是在生产周 期中的温度为约30-45。C。
在生产周期中，发酵培养基的细胞浓度通常范围在0.1-20、优选 0.1-5、甚至更优选l-3g干细胞/升发酵培养基。可以在好氧、孩i好氧 或厌氧条件下进行发酵。如有必要，摄氧率可用于过程控制，参见 WO 03/102200。在摄氧率为4-12 mmol/L/hr、尤其是5-10 mmol/L/hr 的微好氧条件下，本发明的细胞表现特别好。
在细胞产生有机酸例如乳酸的优选情况下，在发酵生产周期中可 緩冲培养基，使pH维持在约3.5至约9.0、或约4.5至约7.0的范围 之内。合适的緩冲剂是可中和所产生的酸的碱性物质，其包括例如氢 氧化钩、碳酸钩、氬氧化钠、氢氧化钟、碳酸钾、碳酸钠、碳酸铵、 氨、氢氧化铵等。 一般而言，常规发酵方法所用的緩冲剂也适用于本 发明。
在緩冲发酵中，酸性发酵产物当其形成时就中和成相应的盐。因 此对酸进行回收包括再生游离酸。通常通过除去细胞并用硫酸等强酸 酸化发酵肉汤而达到这一目的。形成盐副产物(在钙盐作为中和剂、硫 酸作为酸化剂的情况下，就形成石膏)，将其从肉汤中分离出来。然后 通过液-液萃取、蒸馏、吸附等技术，从肉汤中回收酸，所述技术参见仿H口 T.B. Vickroy，第3巻,Cowjwe/zemive 第38章(M.
Moo-Young编著)，Pergamon, Oxford, 1985; R. Datta等，FEMS Microbiol. Rev" 1995， 16:221-231;美国专利号4,275,234、 4,771,001、 5,132,456、 5,420,304、 5,510,526、 5,641,406和5,831,122以及WO 93/00440。
或者，在培养期间，可允许发酵培养基的pH从高于酸产物的pKa 的5.5或更高的起始pH下降至低于或等于酸发酵产物的pKa，例如约 1.5至约3.5、约1.5至约3.0、或约1.5至约2.5的范围内。
也可在发酵之前或发酵过程开始时，将发酵肉汤的pH调至低于 或等于产物酸的pKa,进行发酵以产生产物酸。此后整个培养过程的 pH可维持在低于或等于产物酸的pKa,或可在发酵过程中升至高于酸 的pKa。在前一种情况下，pH优选维持在约1.5至约3.5、约1.5至约 3.2、或约2.0至约3.0的范围内。
在许多发酵条件下，本发明细胞的产甘油能力急剧下降。细胞产 甘油能力下降表现为低的甘油收率。本发明的细胞通常代谢不到2% (重量)的碳源被转化为甘油。在大多数情况下，以培养中消耗的碳源 重量计，甘油收率小于1%或甚至小于0.1%。优选细胞代谢至少40%、 例如至少50%、 60%、 70%、 80%或85%的碳源被转化为所需发酵产 物。
已经发现，本发明的细胞在发酵条件下表现出良好的生长能力。 这是令人吃惊的，因为在野生型酵母细胞中，甘油对细胞有各种用途， 而且认为甘油的作用是平衡NADH/NAD+。本发明的范围包括将甘油 添加到发酵培养基中，以补偿细胞自身缺乏的产甘油能力。然而，申 请人发现，这样做没有益处，至少在某些发酵过程中。
提供以下实施例来说明本发明，但不得视为对本发明范围的限 制。除非另有说明，否则所有份和百分率都以重量计。
实施例1A:马克斯克鲁维酵母菌林CD607的诱变和具有乙醇酸抗性的突变菌林(CD853)的选择。
马克斯克鲁维酵母菌抹CD607描述于WO 03/102152实施例3D。 该菌抹缺失其丙酮酸脱羧酶基因并在该基因座上插入外源乳酸脱氢 酶基因。将菌林CD607的细胞暴露给紫外光进行诱变。
将新鲜YP (酵母膏加蛋白胨)+ 20 g/L葡萄糖平板的细胞重悬于2 mL酵母蛋白胨+ 50 g/L葡萄糖，至约OD600为6。将10份125 pl所 述细胞悬液的等分试样吸至10孔300 pl的96孔微量滴定板中。将微 量滴定板暴露给12,500 )iJoule/cn^的紫外光，杀死90-99%的细胞。然 后将微量滴定板在30。C避光处孵育过夜，同时搅拌(225rpm),让细胞 恢复，然后接种选择性平板。
再将100 经紫外处理的细胞悬液接种土豆葡萄糖琼脂(PDA) + 15g/L乙醇酸平板，选择乙醇酸抗性菌林。这些平板在30。C孵育几天 直到出现菌落。分离单菌落用于进一步分析。
将约2 x 108诱变处理的细胞接种到含有15 g/L乙醇酸的PDA 平板并在30°C孵育。将这些平板上生长的菌落在装有YP (酵母蛋白胨) + 100 g/L葡萄糖(无緩沖剂)的带挡板摇瓶中在30。C和225 rpm搅拌下 培养过夜。然后从这些摇瓶中取出2 g/L细胞干重，接种生产瓶。将 生产瓶在YP + 50g/L葡萄糖中、在3(TC和70rpm搅拌下培养。定期 取样，使用例如WO 03/102201实施例1M所述方法，通过HPLC,测 定葡萄糖、乳酸、乙醇和丙酮酸。88小时后产生约26g/L乳酸的菌抹 称为菌抹CD635。菌林CD635能够以乳酸(盐)为唯一碳源而生长。
如上所述，将菌林CD635的细胞再次进行诱变步骤。选择能够 在含25 g/L乙醇酸的PDA上生长的所得诱变细胞的菌落。将乙醇酸 抗性菌落在YP+ 100g/L葡萄糖的摇瓶中在3(TC和250rpm搅拌下分 别培养过夜。离心收集生物量，将2g/L干重的细胞接种到50mLYP + 50 g/L葡萄糖的带挡板摇瓶中。将摇瓶在30。C和250 rpm搅拌下培 养约92小时。与亲代菌才朱CD607和CD635相比，产生明显更高的终 乳酸滴度的突变体称为菌抹CD853。菌抹CD853不能以乳酸(盐)为唯一碳源而生长，这表明该突变体 中天然L-乳酸(盐):高铁细胞色素c氧化还原酶基因(〖mCZS2)基因已 经没有功能。因此，使用PCR,用高保真FailSafe酶和基因组DNA 作为模板，自该菌林扩增尺mC^B2编码区加上《/wCTS2编码区上游和 下游 500bp。通过Qiagen柱纯化，纯化所得~2.75 kbp PCR产物，并 对全和尺wCFS2编码区测序。发现菌株CD853在《mCZB2基因的氨 基酸位62上具有4碱基插入序列，导致移码突变，在氨基酸位76上 产生终止密码子并截短该蛋白质。
实施例1B: G^，D/F缺失载体pBH158 (图l)和pBH159 (图2)的构建。
一个称为pVR29的质粒(描述于WO 03/102152实施例1C和图 4)含有处于丙酮酸脱羧酶启动子和终止子控制之下的Tn903的 卡那霉素抗性基因(G418基因)。质粒pVR29用厕w/和尸W/消化，将 由此得到的含G418基因盒的5.1 kbp片段通过凝胶纯化并脱去磷酸。 使用称为SEQ.ID.NO. 14和SEQ. ID. NO. 15的引物，并使用马克斯 克鲁维酵母基因组DNA作为模板，通过PCR扩增马克斯克鲁维酵母 GPD (i^wGPDJF)基因DNA上游的1.2 kbp区。将PCR产物通过凝胶 纯化，用厕w/和尸W/消化，然后与来自质粒pVR29的5.1 kbp片段连 接起来，产生质粒pBH158(
图1)。按照转录顺序，质粒pBH158含有 KmG尸D/F基因的1.2 kbp上游侧翼和G418表达盒。
对于第二缺失载体，质粒pVR29用7VgoM/r和消化，将含 有G418表达盒的4.7kbp片段通过凝胶纯化，然后脱去磷酸。使用称 为SEQ. ID. NO. 16和SEQ. ID. NO. 17的引物，并再次4吏用马克斯克 鲁维酵母基因组DNA作为模板，通过PCR扩增KmG尸D7F基因的 DNA下游0.7 kbp区。PCR产物通过凝胶纯化，用7VgoMT和 消化，然后与pVR29的4.7 kbp片段连接起来，产生质粒pBH159 (图 2)。按照转录顺序，质粒pBH159含有G418表达盒和KmG尸D7F基 因0.7 kbp下游侧翼。实施例1C:用质粒pBH158和pBH159 (实施例1B，
图1和图2)转化 菌林CD853 (实施例1A)，得到具有外源LDH基因、缺失天然PDC 基因、具有破坏的天然CYB2基因并缺失天然GPD1F基因的转化子 (菌林CD1606)。
质粒pBH158用^ "/和//!>^///消化。这些限制酶切割质粒，产 生含有《wG^"/F基因的1.2 kbp上游侧翼和部分G418表达盒的2.6 kbp片段。该片段通过琼脂糖凝胶分离。质粒pBH159用lo/和 A^oMT消化。这些限制酶切割质粒，产生含有部分G418表达盒和 《wG尸D7F基因0.7 kbp下游侧翼的2.0 kbp片段。该片段通过琼脂糖 凝胶分离。这两个分离的片段一起含有完整G418表达盒，其中在片 段两端有一些重叠。
将菌林CD853在YP + 60 g/L葡萄糖+ 0.2M MES + 1%乙醇 (pH6.5)中培养过夜，然后与来自质粒pBH158的2.6 kbp片段和来自 pBH159的2.0 kbp片段同时进行电穿孔。在YP + 20 g/L葡萄糖+ 300 |Lig/mL G418平板上在30。C选择转化子，接着培养2天。挑取15个转 化子，在YP + 20g/L葡萄糖+0418平板上重新划线，并培养过夜。 只有共转化这两个片段、而且这两个片段都同源整合在XmG尸D7F基 因座上的细胞，才会对G418具有抗性。
使用称为SEQ.ID.NO. 18和SEQ. ID.NO. 19的引物，通过PCR 证实《wG尸Z)IF基因发生了缺失。7个转化子经PCR表现出单一的3.4 kbp条带，表明这些转化子缺失《wG尸D/F基因。这些转化子中的一 个称为菌抹CD1606。
实施例2A: GPP基因缺失载体pBH160 (图3)和pBH161 (图4)的构建。
质粒pVR29用Mw/和尺;w/消化，由此得到的含有G418基因盒 的5.1 kbp片段通过凝胶纯化并脱去磷酸。使用称为SEQ. ID. NO. 20和SEQ.ID.N0.21的引物，并使用马克斯克鲁维酵母基因组DNA作 为模板，通过PCR扩增天然GPP基因(^2报)i 2基因)上游紧靠着的 0.9kbpDNA区。PCR产物通过凝月交纯化，用Mw/和A^"/消化，然 后与来自质粒pVR29的5.1 kbp片段连接起来，得到质粒pBH160(图 3)。按照转录顺序，质粒pBH160含有尺w/ZC^2基因的0.9 kbp上游 侧翼和G418表达盒。
质粒pVR29用iVgoM/r和消化，将含有G418表达盒的4.7 kbp片段通过凝胶纯化并脱去磷酸。使用称为SEQ. ID. NO. 22和SEQ. ID.NO.23的引物，并使用马克斯克鲁维酵母基因组DNA作为模板， 通过PCR扩增《w/ZO/^基因下游紧靠着的0.8 kbp DNA区。PCR产 物通过凝月交纯化，用A^ M/F和5^/消化，然后与pVR29的4.7 kbp 片段连接起来，得到质粒pBH161 (图4)。按照转录顺序，质粒pBH161 含有G418表达盒和Xm//6^2基因的0.8 kbp下游侧翼。
实施例2B:用质粒pBH160和pBH161 (实施例2A,图3和图4)转化 菌抹CD853 (实施例1A),得到具有外源丄2W7基因、缺失天然尸Z)C 基因、具有破坏的天然CTB2基因和缺失天然G尸户基因的转化子(菌 林CD1608)。
质粒pBH160用厕"/和///"^7//消化。这些限制酶切割质粒，产 生含有马克斯克鲁维酵母GPP (Km/Z(9i^)基因0.9 kbp上游侧翼和部 分G418表达盒的2.3 kbp片段。该片段通过琼脂糖凝胶分离。质粒 pBH161用和A^ M/F消化。这些限制酶切割质粒，产生含有 i^7/7CW2基因0.8 kbp上游侧翼和部分G418表达盒的2.0 kbp片段。 该片段通过琼脂糖凝胶分离。这两个分离的片段一起含有完整G418 表达盒，其中在片段两端有一些重叠。
将菌林CD853在YP + 60 g/L葡萄糖+ 0.2M MES + 1%乙醇 (pH6.5)中培养过夜，然后与来自质粒pBH160的2.3 kbp片段和来自 质粒pBH161的2.0kbp片段同时进行电穿孑L。在YP + 20g/L葡萄糖+300 (ig/mL G418平板上在30。C选择转化子，接着培养2天。挑取15 个转化子，在YP + 20 g/L葡萄糖+ 300 jig/mL G418平板上重新划线， 并培养过夜。所有转化子在该培养基上都能生长。只有共转化这两个 片段、而且这两个片段都同源整合在Xw/ZC^2基因座上的细胞，才会 对G418具有抗性。
使用称为SEQ. ID. NO. 20和SEQ. ID. NO. 21的引物，通过PCR 证实尺m/Z(9i^基因发生了缺失。3个转化子得到单一3.8 kbp条带， 表明缺失《mHOR2基因。这些转化子中的一个称为菌抹CD1608。
实施例3:菌林CD853 (实施例1A)、CD1606 (实施例1C)和CD1608 (实 施例2B)的微好氧分批培养。
在微好氧条件下，分别培养CD853、 CD1606和CD1608菌株。 在菌株CD1606和CD1608的情况下，重复进行发酵。在每种情况下， 使用单级分批反应器。发酵培养基是成分确定培养基，包含硫酸铵、 磷酸二氢钾和硫S吏镁、痕量元素、维生素、消泡剂和约90g/L葡萄糖。 通过添加氲氧化钾，将培养基的pH调至约3.0。将培养基调节至30°C， 接种1 mL细胞。细胞在搅拌和通气条件(摄氧率为5-6 mmol/L/hr)下 在3(TC培养。按照WO 03/102,200所述的方法测定摄氧率。
定时对发酵肉汤取样，测定乳酸、乙酸、甘油和丙酮酸。二氧化 碳产量是通过测定反应器排放气体中二氧化碳含量而确定。
菌林CD853 (并非本发明的实例)在发酵早期的乳酸收率为 0,85 g/L隱hr，直到乳酸滴度为约20 g/L。此时的乳酸收率为约70%。 然后，乳酸产量放緩至约0.76 g/L-hr,乳酸收率略微有所下降。该菌 抹在86小时后停止产酸，此时发酵肉汤含有ll g/L葡萄糖。乳酸滴 度为59 g/L。乳酸总产率为0.65 g/L-hr,乳酸总收率为70%。菌抹CD853 的丙酮酸、乙酸、甘油和二氧化^^的收率分别为0.6%、 0%、 5.1%和 14%。生物量收率为6.4%。
菌株CD1606在发酵早期的乳酸产率为0.77-0.84 g/L-hr，直到乳酸滴度为约20g/L。到这时的乳酸收率为约72-80°/。。然后，乳酸产量 放緩至约0.39-0.41 g/L-hr，乳酸收率略微有所下降。该菌林在137小 时后停止产酸，此时发酵肉汤含有14-19 g/L葡萄糖。乳酸滴度为 43-45 g/L。乳酸总产率为0.32-0.34 g/L-hr,乳酸总收率为60-63%。菌 株CD1606的丙酮酸、乙酸、甘油和二氧化碳的收率分别为0.1%、 0.5%、 0°/。和26-29%。生物量收率为7.9°/。。这些结果表明，缺失天然 《wG尸D7F基因能有效破坏细胞产甘油的能力。令人吃惊的是，该基 因的缺失(和由此而来的甘油产量的缺失)对细胞生长没有或很少有影 响。
菌林CD1608在发酵早期的乳酸产率为0.66 g/L-hr,直到乳酸滴 度为约20g/L。到这时的乳酸收率为约70-75%。然后，乳酸产量放緩 至约0.37 g/L-hr，乳酸收率略微有所下降。该菌林在137小时后停止 产酸，此时发酵肉汤含有19g/L葡萄糖。乳酸滴度为42g/L。乳酸总 产率为0.31 g/L-hr，乳酸总收率为59-60%。菌抹CD1608的丙酮酸、 乙酸、甘油和二氧化碳的收率分别为0.0-0.1%、 0.8%、 0%和26-28%。 生物量收率为7.9-8.2%。这些结果表明，缺失天然《w7/CW2基因也能 有效破坏细胞产甘油的能力。另外，该基因的缺失(和由此而来的甘油 产量的缺失)对细胞生长没有影响。
实施例4A:东方伊萨酵母的天然GPD1基因及其上游和下游侧翼区 的克隆。
对来自几种酵母(酿酒酵母、马克斯克鲁维酵母、解脂西洋蓍霉(r.
/*o/j^ca)、尸.j'a&w7、汉逊德巴利酵母(D. /za"化m7)和光滑假丝酵母 (C g/Wrato))的已知甘油-3-磷酸脱氢酶基因进行比对，鉴定不同基因 中的高度保守区。在高度同源的这些区域中设计两组简并引物。这些 引物组经鉴定分别为SEQ. ID. NO. 24和SEQ. ID. NO, 25 ，以及SEQ. ID. NO. 26和SEQ. ID. NO. 27。用第一组引物和东方伊萨酵母基因组 DNA作为;f莫板，进行PCR，如期得到 200 bp产物。再用第二组引物和东方伊萨酵母基因组DNA作为模板，进行PCR，如期得到 400bp 产物。这两种PCR产物通过凝胶纯化，再用相同引物进行测序。用所 得的部分序列，设计引物，用于基因组步测。用BD Clontech基因组 步测试剂盒并按制造商的说明，使用称为SEQ. ID. NO. 28和SEQ. ID. NO. 29的最初PCR引物以及称为SEQ. ID. NO. 30和SEQ. ID. NO. 31 的嵌套PCR引物，进行基因组步测。将得自上游和下游基因组步测 的序列进行比对，然后与先前得到的部分序列一起构建东方伊萨酵母 的甘油-3-磷酸脱氢酶基因。
实施例4B:在耐热克鲁维酵母直接重复序列之间含有fwCT52基因 盒的质粒(pMM28，图5)的构建。
使用称为SEQ. ID. NO. 32和SEQ. ID. NO. 33的引物，从称为 CD21的野生型马克斯克鲁维酵母菌4朱基因组DNA，通过PCR扩增完 整马克斯克鲁维酵母(《wC1^2)基因盒，包括启动子和终止子 区，并引入5ami//和S"//限制位点。将PCR产物与经过Saw///和 Sa//消化的市售载体pUCl8 (来自Invitrogen Corp., Carlsbad, CA USA) 连接在一起。所得质粒称为pMM25。
使用称为SEQ. ID. NO. 35和SEQ. ID. NO. 36的引物，自耐热克 鲁维酵母基因组DNA，通过PCR扩增称为SEQ.ID.NO.34的705 bp 序列，并引入Sp/z/和5^/限制位点。该耐热克鲁维酵母序列不编码任 何活性蛋白质。质粒pMM25用5^/z/和5W/消化，再将耐热克鲁维酵 母序列与KmCT52盒上游(5，)连接起来，形成质粒pMM27。
使用称为SEQ. ID. NO. 37和SEQ. ID. NO. 38的引物，通过PCR 扩增相同的耐热克鲁维酵母序列，并添加Sam///和Ima/限制位点。 质粒pMM27用3flw///和Xma/消化，再将耐热克鲁维酵母序列与 《wCTB2盒下游(3，)连接起来，形成质粒pMM28(图5)。质粒pMM28 含有侧接耐热克鲁维酵母直接重复序列的尺wCTS2盒，这两者方向相 同。实施例4C:含有潮霉素基因盒和瑞士乳杆菌LDH基因盒的质粒 (pMI321，图7)的构建。
按照WO 02/042471实施例22所述的同样方式，使用称为SEQ. ID. NO. 39和SEQ. ID. NO. 40的引物，自C. so"orm^基因组DNA，得 到C. sowwe"^PGia基因的920bp探针片段。从培养的东方伊萨酵 母菌林中分离基因组DNA，重悬于10mM Tris-HCl + lmM EDTA (pH8) (TE)。东方伊萨酵母基因组DNA用T7/"Jin切割，再用标准方法，用 C. so"orm^ PGX 基因作为探针，进行DNA印迹和杂交。从琼脂糖 凝胶分离出 2kb大小的片段，并克隆到/Z/wffll切割的质粒上，产生 按大小分级的文库(size-fractionated library),再用于转化大肠杆菌。将 按大小分级的文库与尸Gi^探针进行菌落杂交，从而分离出含有 ///w/III片段以及大部分东方伊萨酵母PG《/ (7o尸G^"蛋白编码序列、 但没有启动子序列的质粒(通过测序证实)。
用连接介导的PCR扩增，得到含有/oPG《7启动子区的基因组片 段(Mueller， P.R.和Wold, B. 1989, "In vivo footprinting of a muscle specific enhancer by ligation mediated PCR." 5"c/ewce 246:780-786)。 用 T4 DNA连才矣酶(New England BioLabs)，将称为SEQ. ID. NO. 41的4妄 头和称为SEQ. ID. NO. 42的接头的混合物，与//"elll消化的东方伊 萨酵母基因组DNA连接。连接混合物样品用作模板，用于50plPCR 反应，其中含有O.l(iM称为SEQ. ID. NO. 43的引物和lpM称为SEQ. ID. NO. 44的引物。加入2U的Dynazyme EXT之后，将反应混合物 在94。C加热3分钟。如下进行30次循环的反应94°C 1分钟，68°C 2分钟，72°C 2分钟；最后在72。C延伸10分钟。在含有0.05pM称为 SEQ. ID. NO. 45的引物和0.5称为SEQ. ID. NO. 46的引物的嵌套 PCR反应物(50pl)中，将这个第一PCR扩增的稀释样品用作模板。力口 入2U的Dynazyme EXT之后，将反应混合物在94。C加热3分钟。然 后，如下进行30次循环的反应94°C l分钟，67°C 2分钟，72°C 2分钟；最后在72'C延伸IO分钟。
分离~600 bp PCR片段并测序。设计称为SEQ. ID. NO. 47和SEQ. ID.NO.48的嵌套引物，与类似于以上的经鉴定为SEQ. ID. NO. 49和 SEQ. ID. NO. 50的寡核苷酸一起，用于连接介导的PCR扩增，只是 使用&/7I消化的东方伊萨酵母DNA，采用65。C的退火温度进行PCR。
使用称为SEQ. ID.NO. 51和SEQ.ID.NO. 52的引物，并使用东 方伊萨酵母基因组DNA作为模板，通过PCR扩增东方伊萨酵母尸GX7 启动子区。用Klenow酶填补片段，再用力al消化。通过凝胶分离出 633 bp片段，与用lol消化质粒pMI270所得到的4428 bp片段连接(参 见WO 03/049525图4)，用Klenow酶和O.lmM dNTP填补片段，再 用消化。质粒pMI270含有与C. ^worem^ PG/"启动子和酿酒 酵母终止子连接的大肠杆菌潮霉素基因。所得质粒称为 pMI318 (图6)。质粒pMI318含有处于东方伊萨酵母尸(7A7启动子和 酿酒酵母O4ZJ0终止子控制之下的大肠杆菌潮霉素基因。
使用称为SEQ. ID. NO. 53和SEQ. ID. NO. 54的引物，并使用东 方伊萨酵母基因组DNA作为模板，通过PCR扩增东方伊萨酵母PGK7 启动子。用Klenow酶和O.lmM dNTP填补片段，再用TVcoI切割。通 过凝胶分离出633 bp片段。质粒pVRl (参见WO 03/102152图7)含 有处于酿酒酵母7EF7启动子和酿酒酵母C7C7终止子控制之下的瑞 士乳杆菌￡0//基因。质粒pVRl用iol消化，用Klenow酶填补， 再用iVcol切割。将来自质粒pVRl的7386 bp片段与633 bp的ToPGX7 启动子片段连接起来。所得质粒称为pMI320。质粒pMI320含有处于 /o尸G"启动子和酿酒酵母CTC 终止子控制之下的瑞士乳杆菌ID// 基因。
质粒pMI318和pMB20用4t al和消化。将来自质粒pMI318 的5008 bp片段与来自质粒pMI320的1995 bp片段连接起来，形成质 粒pMI321 (图7)。
潮霉素基因(及其终止子)位于质粒pMI321的两个拷贝的/aPG7a启动子之间，作为直接重复序列。
实施例4D:具有大肠杆菌潮霉素基因盒、瑞士乳杆菌LDH基因盒和 /oPi)CL4 5，侧翼区的质粒(pMI355，图8)的构建。
按照制造商的说明，将野生型东方伊萨酵母菌林ATCC PTA-6658 的基因组文库构建到SuperCosl (Stratagene)粘粒载体中。使用称为 SEQ. ID. NO. 55和SEQ. ID. NO. 56的引物，自该菌株的基因组DNA 通过PCR扩增PDC样序列。扩增PDC基因的700 bp片段。按照WO 03/049525所述，用杂交技术，用带标记的PCR片段作为探针，篩选 基因组文库，然后分离含有尸DC基因的粘粒克隆并测序。用称为SEQ. ID. NO. 57和SEQ. ID. NO. 58的引物，并使用东方伊萨酵母PDCL4 粘粒DNA作为模板，通过PCR扩增东方伊萨酵母可读框起始上游的 1000 bp至167 bp的尸DC" 5，区。该片段用和&cl切割。通过 凝胶分离836 bp片段，然后与用& /1和5^1消化质粒pMI321 (图7，实 施例4C)所得到的6992 bp片段连接起来。所得质粒称为pMI355 (图 8)。
实施例4E:含有/^P"CX4 5，側翼区、大肠杆菌潮霉素基因盒、瑞士 乳杆菌LDH基因盒和/0户"CX4 3'侧翼区的质粒(pMI356和pMI357 (图9))的构建。
使用称为SEQ. ID. NO. 59和SEQ. ID. NO. 60的引物，并使用东
方伊萨酵母粘粒DNA (实施例4D)作为模板，通过PCR扩增 对应于尸DC翻i,终止密码子的524 bp上游至217 bp下游序列的东方 伊萨酵母尸Z)CL4 3，区。片段用J; al和5Vwal切割。通过凝胶分离630 bp片段，与用j/ al和Swal消化质粒pMI355 (图8,实施例4D)所得 到的7809 bp片段连接起来。所得质粒称为pMI357 (图9)。其在 /oPDCL4基因的5'侧翼与部分3'侧翼之间含有来自质粒pMI355的潮 霉素和LDH盒。以同样方式构建质粒pMB56,除了使用不同部位的东方伊萨酵 母尸DCL4 3'区以外。
实施例4F:含有A iV)CL4 5，侧翼区、5WVf^X5基因盒、瑞士乳杆菌 丄"好基因盒和/oPDCX4 3，側翼区的质粒pMI433 (图IO)的构建。
使用称为SEQ. ID. NO. 61和SEQ. ID. NO. 62的引物，并使用东
方伊萨酵母基因组DNA作为模板，通过PCR扩增东方伊萨酵母 启动子。用Klenow酶和O.lmM dNTP填补该片段，然后用Sp/;I切割。 通过凝胶分离669 bp片段。质粒pMI233 (参见WO 03/049525图23C) 用lol切割。用Klenow酶填补该片段，再用切割。将4534 bp 和669 bp片段连接起来，所得质粒称为pMI319。质粒pMI319含有酿 酒酵母ME丄5 (ScM五丄5)基因和/o户GK/启动子区。
质粒pMI319质粒用jpal切割，用T4聚合酶产生平端，再用iVM 切割。通过凝胶分离2317bp片段。将其与用消化质粒pMD57(实 施例4E)所得到的6498bp片段连接起来，用Klenow酶产生平端，再 用iVM切割。所得质粒含有5bM五丄5基因(具有其天然终止子)，其位 置在质粒pMI357的潮霉素基因。所得质粒称为pMI433 (
图10)。
实施例4G:含有东方伊萨酵母CT^2 5，侧翼区、ScAffil5基因盒(位 于耐热克鲁维酵母直接重复序列之间)和东方伊萨酵母CrB2 3，侧翼 区的质粒pMI449 (图ll)和pMI454 (图l"的构建。
质粒pMNG8 (图5，实施例4B)用5amHI消化，用Klenow酶填 补，再用M消化。将由此得到的4077 bp片段与p廳33 (
图10，实 施例4F)的2317 bp (用Klenow酶填补)-5"a/1片段连接起来。所得 质粒称为pMI445。
使用称为SEQ. ID. NO. 63和SEQ. ID. NO. 64的引物，并使用 粘粒克隆作为模板，通过PCR扩增东方伊萨酵母L-乳酸:高铁 细胞色素c氧化还原酶(/oCFS24)基因3'侧翼区(对应于预测可读框起始90-676 bp下游的序列)。所得PCR产物用Sacl和5"mal消化，将所 得607 bp片段与质粒pMI445的6386 bp 片段连接在一起。
所得质粒称为pMI448。
使用称为SEQ. ID. NO. 65和SEQ. ID. NO. 66的引物，并再次使 用CK52-2粘粒克隆作为才莫^1,通过PCR扩增/oCTBZ4 5'侧翼区(对 应于预测可读框起始913-487 bp上游的序列)。所得PCR产物用 消化，将所得454 bp片段与部分消化质粒pMI448所得到的6993 bp S/^I片段连接在一起。所得质粒称为pMI449(
图11)。
使用称为SEQ. ID. NO. 67和SEQ. ID. NO. 68的引物，并再次使 用CTS2-2粘粒克隆作为模板，通过PCR扩增/oCTB24 5'侧翼区(对 应于预测可读框466-7 bp上游)。所得PCR产物用Sp/zl消化，将所得 493 bp片段与部分消化质粒pMI448所得到的6993 bp 片段连接 在一起。所得质粒称为pMI453。
使用称为SEQ. ID. NO. 69和SEQ. ID. NO. 70的引物，并使用 2粘粒作为模板，通过PCR扩增/oC7BZ4 3，侧翼区(对应于预测 终止密码子402 bp上游至77 bp下游)。所得PCR产物用J/ "I和Swal 消化，再将所得506 bp片段与质粒pMI453的6886 bp 片段
连接在一起。所得质粒称为pMI454 (
图12)。
实施例4H:含有/0G户"/基因上游片段、第一耐热克鲁维酵母直接 重复部分、Affi丄5基因盒、第二耐热克鲁维酵母直接重复部分和 "GPiX 基因下游片段的质粒(pBH165，
图13)的构建。
质粒pMI449用AWe/和幼/7消化，切下5' CyBZ4侧翼同源序列。 6.8 kbp片段通过凝胶纯化并脱去磷酸。使用称为SEQ. ID. NO. 71和 SEQ. ID. NO. 72的引物，通过PCR扩增实施例4A的/oGPD7基因的 302 bp片段(对应于该基因起始密码子的碱基对1-302)。 PCR产物通过 凝胶纯化，用Mfe/和幼#消化，然后与质粒pMI449的6.8 kbp片段 连接起来，得到质粒pBH164。质粒pBH164再用Xma/和五coi 7消化，切下3， 侧翼同源序列。所得6.5 kbp片段通过凝胶纯化并脱去
磷酸。使用称为SEQ. ID. NO. 73和SEQ. ID. NO. 74的引物，通过PCR 扩增实施例4A的JoG户D7基因的346 bp片段(对应于起始密码子的碱 基对322-668)。所得PCR产物通过凝胶纯化，用Xma/和五coi 7消化， 然后与得自PBH164的6.5 kbp片段连接起来，产生pBH165 (
图13)。 按照转录顺序，质粒pBH165含有/oG户Z)7基因的302 bp片段、 第一耐热克鲁维酵母直接重复部分、M￡ZJ基因盒、第二耐热克鲁维 酵母直接重复部分和/oGPD7基因的346 bp片段。设计该质粒，用于 在天然/oG尸D7基因的基因座进行插入(以破坏该基因)，然后环出 (loop-out) ME丄5基因盒。
实施例41:通过用质粒pMI356 (实施例4F)转化野生型东方伊萨酵母 菌林， 一步产生具有缺失的/o户Z)CX4基因和iW)"CTB基因以及整合 的丄^LW7基因的东方伊萨酵母突变体(CD1184)。
使用标准方法，用质粒pMI356转化野生型东方伊萨酵母菌抹 ATCCPTA-6658。转化菌株在潮霉素平板上培养。选择一个不产乙醇 的转化子，用于DNA印迹分析，证实其同时缺失两个/oPDCL4等位 基因并插入至少一个拷贝的ZALD/f基因。该菌林称为CD1184。
实施例4J:通过用质粒pMI449 (实施例4G，图ll)和pMI454 (实施 例4G，
图12)相继转化菌林CD1184 (实施例41)，然后进行诱变，产 生东方伊萨酵母突变菌林(CD1496)。
用乙酸锂方法，用质粒pMI449转化菌抹CD1184,然后根据在 YPD X-a-gal平板上的蜜二糖酶活性选择转化子(蓝色菌落)。在一些转 化子上，通过菌落PCR和DNA印迹分析，证实菌抹CD1184的 /oCTS24基因被取代。通过同源重组事件，通过耐热克鲁维酵母重复 序列，从这些转化子中环出M五Z^标记(通过DNA印迹分析证实)。然 后用质粒pMI454，从该转化子中缺失第二CTSZ4等位基因。通过菌落PCR分析转化子中缺失1000 bp 特异性PCR产物。从具有
通过上述重组而缺失的第二 CTBZ4等位基因的转化子中，环出来自质 粒pMI454的ME丄5标记。该转化子称为菌林CD1436。菌抹CD1436 同时缺失两个尸Z)C7基因(被功能性L-丄D/Z基因盒取代)并同时缺失其 两个天然/oCKS2基因。
使用实施例1A所提出的条件(除了暴露条件为8 达1小时之 外)，对菌抹CD1436进行EMS诱变。让诱变细胞在200 YP + 20 g/L 葡萄糖培养基中再培养6小时，然后倒在PDA + 35 g/L乳酸平板上， 3(TC孵育l周。比菌林CD1436产生较多乳酸和较少甘油的菌抹称为 菌抹CD1496。
实施例4K:用质粒pBH165 (实施例4H，
图13)转化菌林CD1184 (实 施例4I)和CD 1496 (实施例4J)，接着环出选择标记，分别得到转化 菌林CD1667和CD1671,其具有单个GPD1等位基因缺失。
培养菌抹CD1184,用经A/"tfe/和￡caR/消化质粒pBH165所得的 5吗4.4 kbp片段转化该菌抹。在覆盖X-a-gal (5-溴4-氯-3-吲哚基-a-D-吡喃半乳糖苷)的酵母氮基础(YNB) + 2%蜜二糖平板上选择转化子。 在3(TC生长 4天后可见蓝色转化子。挑取8个转化子，接种含有 X-ot-gal的YP + 20 g/L葡萄糖平板，以得到单菌落。挑取各转化子的 蓝色单菌落，在YP + 20 g/L葡萄糖平板上重新划线。从转化子中分 离基因组DNA。使用称为SEQ. ID. NO. 75和SEQ. ID. NO. 76的引物， 通过PCR证实/oG尸Z)7基因中有一个等位基因被破坏。5个转化子表 现出预期的 2kb产物。这些转化子中的一个称为菌株CD1655。使用 称为SEQ. ID. NO. 77和SEQ. ID. NO. 78的引物，通过PCR进一步证 实天然/oG尸D/基因中有一个拷贝被破坏。
将菌抹CD1655在YP+100g/L葡萄糖上、在30。C生长几轮。将 系列稀释液倒在覆盖X-a-gal的YP + 20 g/L平板上，在3(TC生长过夜。 选择白色菌落(这表明MEL 5标记盒的环出)，并重新划线在YP +20 g/L葡萄糖+ X-a-gal平板上。选择白色菌落。使用称为SEQ. ID. NO. 69和SEQ. ID. NO. 80的引物，通过PCR证实天然/oG尸D7基因中有 一个等位基因被破坏。该转化子称为菌林CD1667。
以同样方式转化菌林CD1496。在PCR时显示出预期~2 kbp条带 的转化子称为菌抹CD1657。通过如上所述用于菌林CD1655的PCR， 证实天然/oGPD/基因中有一个等位基因被破坏。再将菌株CD1657 培养几轮,选择具有ME丄5标记基因盒缺失的菌落,称为菌林CD1671 。 通过如上所述的PCR，证实天然/oG尸D7基因中有一个等位基因被破 坏。
实施例4L:用质粒pBH165 (实施例4H，
图13)转化菌林CD1667 (实 施例4K)和CD1671 (实施例4K)，分别得到转化菌林CD1688和 CD1690，其两个/0G尸/X 等位基因都缺失。
用经A^fe/和五coR7消化质粒pBH165所得的5吗4.4 kbp片段转 化菌抹CD1667。在覆盖X-a-gal的YNB + 2%蜜二糖平板上选择转化 子。在30'C生长 4天后可见蓝色转化子。挑取10个转化子，接种含 有X-a-gal的YP + 20 g/L葡萄糖平板，以得到单菌落。挑取各转化子 的蓝色单菌落，在YP + 20 g/L葡萄糖平板上重新划线。从转化子中 分离基因组DNA。使用称为SEQ. ID. NO 81和SEQ. ID. NO. 82的引 物，在三个转化子中，通过PCR证实/oG尸D7基因中的第二等位基因 被破坏。这些转化子中的一个称为菌抹CD1688。
:接照同样方式转化菌4朱CD1671。 PCR显示，在一个称为菌才朱 CD 1690的转化子中，/oG尸D7基因的第二等位基因被破坏。
实施例5:菌抹CD1184 (实施例41)和CD1688 (实施例4L)在OUR为 5.5-5.6时的微好氧分批培养。
向含成分确定培养基(包含硫酸铵、磷酸二氢钾和硫酸镁、痕量 元素、维生素、消泡剂和约50g/L葡萄糖)的单级分批培养反应器中，接种1 mL菌抹CD1688。将培养基的pH调至约3.5,然后再加入细 胞。在细胞生长和开始产乳酸时，让培养物的pH降至3.0。此后，通 过加入氢氧化钾，使pH维持在约3.0。向发酵物中添加葡萄糖约 1-2 g/L/hr,直到总共加入136.1 g/L葡萄糖。在摄氧率为约5.5-5.6 mmol/L/hr的通气条件下于30。C培养细胞。
菌抹CD1688产生乳酸的速率为1.02g/L-hr，直到乳酸滴度为约 70g/L。此时的乳酸收率约74%。在77小时后，该菌4朱4f止生产，此 时的发酵肉汤含有15.3 g/L葡萄糖。乳酸总产率为1.06 g/L-hr,乳酸 总收率为70%。菌抹CD1688的丙酮酸、甘油和二氧化碳的收率分别 为1.9%、 0%和23.7%。生物量收率为3.5%。
为了进行比较，在类似条件下培养菌株CD1184 (并非本发明的实 施例)。菌林CD1184产生乳酸的速率为1.24g/L-hr，直到乳酸滴度为 约70g/L。此时的乳酸收率约74%。在77小时后，该菌4^停止生产， 此时的发酵肉汤含有15.3 g/L葡萄糖。乳酸总产率为1.06 g/L-hr，乳 酸总收率为70%。菌林CD1184的丙酮酸、甘油和二氧化碳的收率分 别为2.1%、 9.3%和15.9%。生物量收率为3.2%。
这些结果表明，在这些发酵条件下，天然/oG尸D7基因的缺失阻 止细胞产生可检测量的甘油。如上所述，该基因的缺失(以及由此而来 的甘油产量的缺失)对细胞生长没有或很少有影响。
实施例6:菌株CD1184 (实施例41)和CD1688 (实施例4L)在OUR为 9.9-10时的微好氧分批培养。
」換照实施例5所述的类似方法，分别培养菌一朱CD1688和 CD1184，除了选择通气条件使摄氧率为9.9-10.0 mmol/L/hr，而且在 培养期间不向系统中添加葡萄糖之外。将酵母外壳添加到菌林
CD1688培养物中。
在这些条件下，菌抹CD1184产生乳酸的速率为1.87 g/L-hr,直 到乳酸滴度为约70g/L。此时的乳酸收率约73%。在67.5小时后，该菌林停止生产，此时发酵肉汤中的葡萄糖浓度从60 g/L降至2.1 g/L。 乳酸总产率为1.43 g/L-hr,乳酸总收率为70%。菌抹CD1184的丙酮 酸、甘油和二氧化碳的收率分别为2.1%、 5.7%和21.5%。生物量收率 为4.4%。
菌林CD1688产生乳酸的速率为1.68 g/L-hr，直到乳酸滴度为约 70g/L。此时的乳酸收率约80%。在78小时后，该菌抹停止生产，此 时发酵肉汤中的葡萄糖浓度从53.5 g/L降至4.8 g/L。乳酸总产率为 1.26 g/L-hr,乳酸总收率为77%。菌抹CD1688的丙酮酸、甘油和二 氧化碳的收率分别为1.2%、 0%和23.2%。生物量收率为5.95%。如上 所述，这些结杲表明，在这些发酵条件下，天然/oG尸D/基因的缺失 阻止细胞产生可检测量的甘油，而且该基因的缺失(以及由此而来的甘 油产量的缺失)对细胞生长没有影响。另外，/oG尸D7的缺失改善了乳 酸的总收率。
实施例7:菌林CD16卯(实施例4L)在OUR为5-6时的孩t好氧分批培 养。
按照实施例5所述的类似方法，培养菌4朱CD1690，除了选择通 气条件使摄氧率为5.75 mmol/L/hr,而且发酵培养基为YP + 70 g/L葡 萄糖之外。
在这些条件下，菌抹CD1690产生乳酸的速率为0.66 g/L-hr，直 到乳酸滴度为约70g/L。此时的乳酸收率约78%。在121小时后，该 菌林停止生产，此时发酵肉汤中的葡萄糖浓度降至23.8 g/L (从培养开 始时的127.9 g/L)。乳酸总产率为0.61 g/L-hr，乳酸总收率为77%。丙 酮酸、甘油和二氧化^ 友的收率分别为0%、 0%和31.1%。生物量收率 为2.4%。另夕卜，这些结果表明，在这些发酵条件下，两个天然/oG尸D7 等位基因的同时缺失阻止细胞产生可检测量的甘油，而且对细胞生长 没有或很少有影响。
按照实施例5所述的一般性方法(使用其中所述的成分确定培养基)，培养菌株CD1690多两次，除了 OUR为5.2mmol/L/hr且向发酵 肉汤中添加甘油之外。第 一轮加入0.1 g/L甘油，第二轮加入1.0 g/L 甘油。
当加入0.1 g/L甘油时，菌抹CD1690产生乳酸的速率为 0.74 g/L-hr，直到乳酸滴度为约70 g/L。此时的乳酸收率约78%。在 121小时后，该菌株停止生产，此时发酵肉汤中的葡萄糖浓度降至 10.2g/L(从培养开始时117.8 g/L)。乳酸总产率为0.68g/L-hr，乳酸总 收率为76%。丙酮酸、甘油和二氧化碳的收率分别为0.2%、 0%和 25.3%。生物量收率为4.1%。
当加入1.0g/L甘油时，得到非常类似的结果。
这些结果出乎意料地表明，向发酵培养基中添加甘油，对这些转 化子生长和产生乳酸的能力没有或很少有影响，尽管细胞产甘油的天 然能力被破坏。
实施例8A:含有IoGPD15，侧翼区、位于直接重复序列之间的大肠杆 菌潮霉素基因盒和IoGPD13，側翼区的质粒(pTMC61 (
图14))的构建。 使用称为SEQ. ID. NO. 83和SEQ. ID. NO. 84的引物，用质粒 pMI356 (实施例4E,参见图9)作为模板，通过PCR扩增潮霉素基因盒。 PCR条件是95°C 5分钟(一次)，30次循环(95。C (30秒)、56°C (30 秒)和72。C (2分钟))，然后72。C IO分钟一次循环。所得PCR产物用 ^e/和5W/消化，连接在经同样消化的质粒pBH165 (实施例4H，图 13)上，得到质粒pTMC61(
图14)。
实施例8B:转化所选择的具有质粒pBH165 (实施例4H，
图13)的野 生型东方伊萨酵母菌林，然后环出选择标记，得到单个(7尸D/等位基 因缺失的转化菌林CD2624。
野生型东方伊萨酵母菌抹ATCC PTA-6658在含有低浓度葡萄糖 和高浓度乳酸的培养基中连续培养多代。分离出在这些条件下生长良好的细胞，称为菌抹CD1822。在含有葡萄糖为碳源的培养基中培养 时，菌抹CD1822产生乙醇和甘油。培养菌林CD1822，按照实施例 4K所述的类似方法，用质粒pBH165转化。按照实施例4K所述，在 覆盖X-a-gal (5-淡-4-氯-3-吲哚基-a-D-吡喃半乳糖苷)的酵母氮基础 (YNB) + 2。/。蜜二糖平板上选择转化子，挑取蓝色菌落，在YP + 20g/L 葡萄糖平板上重新划线。从转化子中分离基因组DNA,并通过两组 PCR反应，分析缺失构建体的整合。第一组使用的引物称为SEQ.ID. NO. 85和SEQ. ID. NO. 86，第二组使用的引物称为SEQ. ID. NO. 87 和SEQ. ID. NO, 88。由此产生的PCR产物分别为2.0 kbp和1.4 kbp， 表明已有一个G尸Z)7等位基因被破坏。使用称为SEQ. ID. NO. 85和 SEQ.ID.NO. 88的引物，完成第三组PCR反应；其产生0.8kbp产物， 表明未被破坏的G尸D7等位基因依然存在于转化子中。该转化子称为 菌林CD2624。
实施例8C:用质粒pTMC61 (实施例8A，
图14)转化菌林CD2624 (实 施例8B)，得到转化菌林CD2627,其两个/oGPD/等位基因都同时缺 失。
用称为SEQ. ID. NO. 89和SEQ. ID. NO. 90的引物并用质粒 pTMC61作为模板，进行PCR。得到4.1 kbp片段，用于转化菌抹 CD2624。在YPD + 300吗/ml潮霉素上选择转化子。从100个转化子 中分离基因组DNA，并在三组PCR反应中用作模板。第一组使用的 引物称为SEQ. ID. NO. 91和SEQ. ID. NO. 88,在30个转化子中产生 1.5 kbp产物。第二组PCR反应在来自这30个转化子的基因组DNA 上进行，使用称为SEQ. ID. NO. 85和SEQ. ID. NO. 92的引物。10个 菌4^表现出预期的2.5 kbp产物。然后，用称为SEQ. ID. NO. 85和SEQ. ID.NO. 88的引物，分析这10个菌抹的基因组DNA。不产生0.8kbp 片段的2个菌株的两个(7尸D7等位基因同时被破坏。这些是在YNB + 2.0%蜜二糖平板上培养物进行检测的。 一个菌林能够生长，称为菌林CD2627。
实施例8D:菌林CD1822、菌林CD2624 (实施例8B)和菌林CD2627 (实 施例8C)的微好氧培养。
菌林CD1822、 CD2624和CD2627在微好氧摇弁復酵中培养，一 式两份。菌株在装有25 mL成分确定培养基(含 100 g/mL葡萄糖)的 250 mL带挡板摇瓶中，在30。C和250 rpm搅拌下培养过夜。成分确 定;咅养基4姿照以下文献戶斤述Peter M. Bruinenberg, Johannes P. Van Dijken和W. Alexander Schefferes， 1983， An Enzymatic Analysis of NADPH Production and Consumption in C朋(i油 w"7/s, J! Ge"era/ M/cra&o/ogv第129巻，第965-971页，除了视需要存在额外葡萄糖、 而且烟酸增加至5m g/L之外。
所得培养物用于接种装有50 mL成分确定培养基(含100 g/L葡萄 糖)的250 mL带挡板摇瓶中，至OD,为0.2。然后，将这些摇瓶在 30°C以100 rpm孵育22小时。然后通过HPLC分析培养基中的葡萄糖、 甘油和乙醇。也测定生物量收率。
菌抹CD1822在22小时培养期间消耗所有葡萄糖，产生6.0g/kg 甘油、34.54g/kg乙醇，生物量达OD600 14.8。
一个G尸Z)7等位基因被破坏的菌林CD2624消耗所有葡萄糖，产 生5.88g/kg甘油和35.25g/kg乙醇。产生生物量达00600 14.5。
两个GPD1等位基因同时,皮石皮坏的菌4朱CD2627在22小时期间 消耗大约12.39g/kg葡萄糖。甘油产量为0.34g/kg。乙醇产量为 23.06g/kg,产生生物量达OD6。0 11.5。这些结果表明，在这些条件下， 东方伊萨酵母中G尸D7等位基因的破坏，使葡萄糖消耗率有少量下降， 乙醇产量和生物量产量有少量下降。然而，菌抹CD2627生长良好， 产生乙醇良好，甘油产量最少。这些结果还表明，G尸D7缺失体的生 长和生产能力并不依赖于PDC活性的破坏或从丙酮酸到乳酸途径的 添力口。
权利要求
1. 一种全基因组重复前酵母细胞，所述细胞经过遗传修饰而缺失或破坏了从磷酸二羟丙酮到甘油的天然代谢途径。
2. 权利要求1的细胞，所述细胞是半子嚢菌。
3. 权利要求2的细胞，所述细胞在其可代谢的碳源存在下进行培 养时，代谢以重量计2%以下碳源并由所述细胞消耗用以产生甘油。
4. 权利要求3的细胞，所述细胞经过遗传修饰而产生有机酸。
5. 权利要求4的细胞，所述细胞含有功能性丄D7/基因盒，而且 所述细胞产生乳酸。
6. 权利要求5的细胞，其中所述天然代谢途径的缺失或破坏包括 至少一个天然甘油-3-磷酸脱氪酶基因的缺失或^L坏。
7. 权利要求5的细胞，其中所述天然代谢途径的缺失或破坏包括 至少一个天然甘油-3-磷酸酶基因的缺失或破坏。
8. 权利要求5的细胞，其中所述天然代谢途径的缺失或破坏包括 至少一个天然甘油-3-磷酸脱氢酶基因的缺失或破坏以及至少一个天 然甘油-3-磷酸酶基因的缺失或破坏。
9. 权利要求5的细胞，其中所述天然代谢途径的缺失或破坏可包 括至少一个天然二羟丙酮磷酸酶基因的缺失或^^坏、天然甘油脱氲酶 基因的缺失或破坏、或者天然二羟丙酮磷酸酶基因和天然甘油脱氢酶 基因两者同时缺失或破坏。
10. 权利要求4-9中任一项的细胞，所述细胞含有从丙酮酸到乙 醇的天然代谢途径的缺失或破坏。
11. 一种属于酵母复合群的接合酵母属(Zj;go^cc/wramycM)、接 合有孢圆酵母属(Z嫂otonJflspora)、 有孢圆酵母属 (Tbrw/aspora)、丄ac/z""cea、克鲁维酵母属(尺/wyweramyc&s)、 4i嚢酵母 属(￡>emof/2ec/w w)或有孑包、;又逊酵母属(T/a"sem'ospon3)进4匕才支(Kurtzman 2003)的细胞，所述细胞经过遗传修饰而缺失或破坏了从磷酸二羟丙酮到甘油的天然代谢途径。
12. 权利要求12的细胞，所述细胞在其可代谢的碳源存在下进行 培养时，代谢以重量计2%以下碳源并由所述细胞消耗用以产生甘油。
13. 权利要求12的细胞，所述细胞经过遗传修饰而产生有机酸。
14. 权利要求13的细胞，所述细胞含有功能性ZZ)Z/基因盒，而 且所述细胞产生乳酸。
15. 权利要求14的细胞，其中所述天然代i射途径的缺失或破坏包 括至少一个天然甘油-3-磷酸脱氬酶基因的缺失或破坏。
16. 权利要求14的细胞，其中所述天然代谢途径的缺失或破坏包 括至少一个天然甘油-3-磷酸酶基因的缺失或破坏。
17. 权利要求14的细胞，其中所述天然代谢途径的缺失或破坏包 括至少一个天然甘油-3-磷酸脱氢酶基因的缺失或破坏以及至少一个 天然甘油-3-磷酸酶基因的缺失或破坏。
18. 权利要求14的细胞，其中所述天然代谢途径的缺失或破坏可 包括至少一个天然二羟丙酮磷酸酶基因的缺失或破坏、天然甘油脱氢 酶基因的缺失或破坏、或者天然二幾丙酮磷酸酶基因和天然甘油脱氢 酶基因两者同时缺失或破坏。
19. 权利要求13-18中任一项的细胞，所述细胞含有从丙酮酸到 乙醇的天然代谢途径的缺失或破坏。
20. 克鲁维酵母属(幻w"eram;/c")、假丝酵母属(Ca"&Vfo)或伊萨 酵母属(/^flfc/^"^")的细胞，所述细胞经过遗传修饰而缺失或破坏了 从磷酸二羟丙酮到甘油的天然代:射途径。
21. 权利要求20的细胞，所述细胞在其可代谢的碳源存在下进行 培养时，代谢以重量计2%以下>^友源并由所述细胞消耗用以产生甘油。
22. 权利要求21的细胞，所述细胞经过遗传修饰而产生有机酸。
23. 权利要求22的细胞，所述细胞含有功能性LD/Z基因盒，而 且所述细胞产生乳酸。
24. 权利要求23的细胞，其中所述天然代谢途径的缺失或破坏包括至少一个天然甘油-3-磷酸脱氬酶基因的缺失或破坏。
25. 权利要求23的细胞，其中所述天然代谢途径的缺失或破坏包 括至少一个天然甘油-3-磷酸酶基因的缺失或破坏。
26. 权利要求23的细胞，其中所述天然代谢途径的缺失或破坏包 括至少一个天然甘油-3-磷酸脱氬酶基因的缺失或破坏以及至少一个 天然甘油-3-磷酸酶基因的缺失或破坏。
27. 权利要求21-26中任一项的细胞，所述细胞含有从丙酮酸到 乙醇的天然代谢途径的缺失或破坏。
28. —种属于酵母复合群的东方伊萨酵母(Z^Wc/z^7A^ oWewtofe)/ 发酵毕赤酵母(尸/c/^ /enwe"/"m)进化枝(Kurtzman和Robnett, 1998) 或克鲁维酵母属(X/w"eraw少ce力进化技(Kurtzman 2003)的细胞，所述 细胞经过遗传修饰而缺失或破坏了从磷酸二羟丙酮到甘油的天然代 谢途径。
29. 权利要求28的细胞，所述细胞在其可代谢的碳源存在下进行 培养时，代谢以重量计2%以下碳源并由所述细胞消耗用以产生甘油。
30. 权利要求29的细胞，所述细胞经过遗传修饰而产生有机酸。
31. 权利要求30的细胞，所述细胞含有功能性丄Di/基因盒，而 且所述细胞产生乳酸。
32. 权利要求31的细胞，其中所述天然代谢途径的缺失或破坏包 括至少一个天然甘油-3-磷酸脱氬酶基因的缺失或破坏。
33. 权利要求31的细胞，其中所述天然代谢途径的缺失或破坏包 括至少一个天然甘油-3-磷酸酶基因的缺失或破坏。
34. 权利要求31的细胞，其中所述天然代谢途径的缺失或破坏包 括至少一个天然甘油-3-磷酸脱氲酶基因的缺失或破坏以及至少一个 天然甘油-3-磷酸酶基因的缺失或破坏。
35. 权利要求31的细胞，所述细胞是马克斯克鲁维酵母)细胞。
36. 权利要求35的细胞，所述细胞含有从丙酮酸到乙醇的天然代谢途径的缺失或破坏。
37. 权利要求31的细胞，所述细胞是东方伊萨酵母细胞。
38. 权利要求37的细胞，所述细胞含有/人丙酮酸到乙醇的天然代 谢途径的缺失或破坏。
39. —种经遗传修饰的全基因组重复前酵母种细胞，所述细月包当 在以下标准微好氧条件下进行培养时，产生小于2.0 g/L甘油A. 成分确定的含水培养基，其在培养开始时含有5g/L硫酸铵、 3g/L磷酸二氢钾、0.5g/L硫酸镁、痕量元素、维生素、150g/L葡萄 糖；B. 培养开始时pH为3.5，培养期间如有必要则緩沖发酵培养基 以防pH降至3.0以下或升至7.0以上；C. 接种酵母细胞培养至OD咖为1.0;D. 培养温度30。C;E. 持续培养直到葡萄糖浓度降至10 g/L，但不超过120小时；F. 通气和搅拌以满足4i氧率为5.0± 1.0mmol/升/小时。
40. 权利要求39的细胞，所述细胞是半子嚢菌。
41. 权利要求39的细胞，所述细胞属于酵母复合群的接合酵母 属、接合有孢圓酵母属、有孢圓酵母属、丄ac/wwcea、克鲁维酵母属、 假嚢酵母属或有孢汉逊酵母属进化枝(Kurtzman 2003)。
42. 权利要求40的细胞，所述细胞属于克鲁维酵母属、假丝酵母 属或伊萨酵母属。
43. 权利要求39-42中任一项的细胞，所述细胞当在标准微好氧 条件下进行培养时，产生不超过0.6g/L甘油。
44. 权利要求43的细胞，所述细胞当在标准微好氧条件下进行培 养时，产生至少10g/L所需发酵产物。
45. —种经遗传修饰的全基因组重复前酵母种细胞，所述经遗传 修饰的细胞缺乏产生活性甘油-3-磷酸脱氲酶的能力，而所述酶是由其 野生型酵母种细胞天然产生的。
46. 权利要求45的细胞，所述细胞是半子嚢菌。
47. 权利要求45的细胞，所述细胞属于酵母复合群的接合酵母 属、接合有孢圆酵母属、有孢圆酵母属、￡"c/^"cea、克鲁维酵母属、 假嚢酵母属或有孢汉逊酵母属进化枝(Kurtzman 2003)。
48. 权利要求45的细胞，所述细胞属于克鲁维酵母属、假丝酵母 属或伊萨酵母属。
49. 权利要求44-48中任一项的细胞，所述细胞还缺乏产生活性 甘油-3-磷酸酶的能力，而所述酶是由其酵母种细胞天然产生的。
50. —种全基因组重复前酵母种细胞，所述细胞缺乏产生活性甘 油-3-磷酸酶的能力，而所述酶是由其酵母种野生型细胞天然产生的。
51. 权利要求50的细胞，所述细胞是半子嚢菌。
52. 权利要求50的细胞，所述细胞属于酵母复合群的接合酵母 属、接合有孢圆酵母属、有孢圆酵母属、丄"c/w"cea、克鲁维酵母属、 假嚢酵母属或有孢汉逊酵母属进化枝(Kurtzman 2003)。
53. 权利要求50的细胞，所述细胞属于克鲁维酵母属、假丝酵母 属或伊萨酵母属。
54. —种经遗传修饰的酵母种细胞，所述细胞缺乏产生活性磷酸 二羟丙酮磷酸酶的能力，而所述磷酸酶是由其酵母种野生型细胞天然 产生的；所述细胞还缺乏产生活性NADlT依赖性甘油脱氢酶的能力， 而所述脱氢酶是由其酵母种野生型细胞天然产生的；或者所述细胞同 时缺乏产生这两种酶的能力。
55. —种酵母细胞，所述细胞经过遗传修饰而产生有机酸产物， 所述酵母细胞还具有从磷酸二羟丙酮到甘油的天然代谢途径的缺失 或破坏以及从丙酮酸到乙醇的天然代谢途径的缺失或破坏。
56. 权利要求55的酵母细胞，其中从磷酸二羟丙酮到甘油的天然 代谢途径的缺失或破坏包括至少一个天然甘油-3-磷酸脱氢酶基因的 缺失或破坏。
57. 权利要求55的酵母细胞，其中从磷酸二羟丙酮到甘油的天然代谢途径的缺失或破坏包括至少一个天然甘油-3-磷酸酶基因的缺失 或破坏。
58. 权利要求57的酵母细胞，其中从磷酸二羟丙酮到甘油的天然 代谢途径的缺失或破坏包括至少一个天然甘油-3-磷酸酶脱氢酶基因 的缺失或破坏和至少一个天然甘油-3-磷酸酶基因的缺失或破坏。
59. 权利要求57的酵母细胞，其中从磷酸二羟丙酮到甘油的天然 代谢途径的缺失或破坏包括至少一个天然磷酸二羟丙酮磷酸酶基因 的缺失或破坏、天然甘油脱氢酶基因的缺失或破坏、或者天然磷酸二 羟丙酮磷酸酶基因和天然甘油脱氢酶基因两者同时缺失或破坏。
60. 权利要求55-59中任一项的酵母细胞，其中所述有机酸是乳酸。
61. —种发酵方法，其中权利要求l-3、 11-12、 20-21或28-29中 任一项的细胞在发酵条件下、在碳源存在下进行培养时产生所需发酵 产物，其中以所述细胞所消耗的碳源重量计，甘油收率小于2%。
62. 权利要求61的发酵方法，其中以所述细胞所消耗的碳源重量 计，所需发酵产物的产率至少为40%。
63. 权利要求62的方法，其中以所述细胞所消耗的碳源重量计， 甘油收率小于0.5%。
64. 权利要求63的方法，其中所述所需发酵产物是乙醇。
65. —种发酵方法，其中权利要求4、 13、 22或30中任一项的细 胞在发酵条件下、在碳源存在下进行培养时产生至少一种有机酸，其 中以所述细胞所消耗的碳源重量计，甘油收率小于2%。
66. 权利要求66的发酵方法，其中所述有机酸的产率以所述细胞 所消耗的碳源重量计至少为40%，甘油收率以所述细胞所消耗的碳源 重量计小于0.5%。
67. —种发酵方法，其中权利要求5-9、 14-18、 23-26或31-38中 任一项的细胞在发酵条件下、在碳源存在下进行培养时产生乳酸，其 中以所述细胞所消耗的碳源重量计，甘油收率小于2%。
68. 权利要求67的发酵方法，其中乳酸的产率以所述细胞所消耗 的碳源重量计至少为40°/。，甘油收率以所述细胞所消耗的碳源重量计 小于0.5%。
69. 一种发酵方法，其中权利要求l-3、 11-12、 20-21或28-29中 任一项的细胞在发酵条件下、在碳源存在下进行培养时产生乙醇，其 中以所述细胞所消耗的碳源重量计，甘油收率小于2%。
全文摘要
酵母细胞经过遗传修饰而破坏了从二羟丙酮到甘油的天然代谢途径。在某些方面，所述酵母细胞属于克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)或伊萨酵母属(Issatchenkia)。在其它方面，所述酵母细胞能够产生至少一种有机酸，例如乳酸。所述酵母细胞的甘油产量明显低于其野生型菌株，并且所述酵母细胞的所需发酵产物的收率通常较高。本发明的酵母细胞在培养时通常生长良好，尽管它们的甘油产量下降。
文档编号A01N63/04GK101442910SQ200780016783
公开日2009年5月27日 申请日期2007年3月13日 优先权日2006年3月13日
发明者A·阿里斯蒂多, B·J·拉什, B·M·豪斯, C·A·邓顿, K·科伊武兰塔, K·罗伯格-佩雷斯, P·苏米宁, T·W·麦马琳 申请人:卡吉尔公司