石斛属培养物的离体保存方法

专利名称：：石斛属培养物的离体保存方法石斛属培养物的离体保存方法所属领域本发明涉及生物
技术领域：
，具体地，涉及石斛属培养物的离体保存技术。
背景技术：
：云南省是商品石斛主要产地之一，种类多，资源丰富(全国76种，云南58种，占全国种类的76.3%。石斛药材原植物包含石斛属植物39种，金石斛属植物2种和石仙桃属植物4种。石斛类植物是常见名贵中药材(具有滋阴清热，生津益胃。润肺止咳。明目强身等功效)。人们长期无限制，掠夺性和毁灭性的采挖和近年来大量深层次的研究开发(发现石斛属许多种还具有抗肿瘤、抗衰老、.增强机体免疫力、扩张血管及抗血小板凝集等作用)。再加上石斛属物种在自然界结实率低，种子因无胚乳，萌发率5%以下。远不能满足目前国内外需求。我国和国际组织(IUCN)都明文规定，石斛属为禁止贸易的物种加以保护。现有技术中未见有云南药用石斛离体保存技术的报道。
发明内容石斛属植物大多分布在热带和亚热带，本发明的目的在于提供一种在15-2(TC下保存培养物，延缓石斛生长速度，延长继代周期的云南药物石斛离体保存方法。为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下技术方案石斛属培养物的离体保存方法，取石斛属培养物在培养基为1/2MS+NAAlmg丄"+S20/0.，温度为15-20。C中进行离体保存。上述方法中，石斛属培养物为不同发育阶段的培养材料即由石斛属种子萌发后产生的胚性组织即原球茎或茎尖和茎基部形成的拟原球茎，由原球茎或拟原球茎分化产生的丛芽，由丛芽分化产生的具根和4-5片叶的试管苗3个发育阶段的材料。本发明的方法可概括为取石斛属培养物即3个不同发育阶段的培养材料也就是由石斛属种子萌发后产生的胚性组织即原球茎或茎尖和茎基部形成的拟原球茎，由原球茎或拟原球茎分化产生的丛芽，由丛芽分化产生的具根和4-5片叶的试管苗，在培养基为1/2MS+NAAlmg丄"+S2。/。，温度为15-2CTC中进行离体保存。具体实施例方式下面用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。实施例1:本发明的方法可概括为取石斛属培养物即3个不同发育阶段的培养材料也就是由石斛属种子萌发后产生的胚性组织即原球茎或茎尖和茎基部形成的拟原球茎，由原球茎或拟原球茎分化产生的丛芽，由丛芽分化产生的具根和4-5片叶的试管苗，在培养基为1/2MS+NAAlmg丄"+S2。/。，温度为15-20。C中进行离体保存。具体步骤和方法如下一、石斛经快速繁殖得石斛培养物1材料与方法1.1供试材料[l]长苏石斛Dendrobiumbrymerianum西双版纳[2]球花石斛D.chysiflorum(2个居群)景洪、昆明[3]鼓槌石斛D.chrysotoxume(4个居群)勐海、保山、思茅、景洪[4]铁皮石斛D.candidum(9个居群)广南、思茅、文山(3个居群)浙江、盈江、安宁、小哨[5]金钗石斛杂种选系D.phalaenosisxD.nobile[6]短棒石斛D.capillipes(2个居群)西双版纳、鲁甸[7]兜唇石斛D.aphyllum(2个居群)腾冲、景洪[8]束花石斛D.chrysanthum(3个居群)丽江、思茅、景洪[9〗玫瑰石斛D.crepidatum文山[IO]叠鞘石斛D.aurantiacumvar.deuneanum(2个居群)昆明、勐海.[ll]密花石斛D.densiflorum[12]流苏石斛D.fimbriatum(9个居群)缅甸、越南、高黎贡山、西双版纳等[13]棒节石斛D.findlayanum(2个居群)景洪、思茅[14]美花石斛D.loddigesii[15]金钗石斛D.aobile(8个居群)石屏、景洪(2个居群)、勐腊、保山、兰坪、勐海、昆明[16]长距石斛D.longicorum[17〗报春石角4D.primulinum[18]大苞鞘石斛D.wardianum(2个居群)昆明、景洪[19]霍山石斛D.huoshanense[20]齿瓣石斛D.devonianum(2个居群)屏边、景洪[21]矮石斛D.bellatulum(2个居群)文山、景洪[22串珠石斛D.falooneri[23]疏花石斛D.henryi[24]细茎石斛D.moniliforme(2个居群)高黎贡山、丽江[25]黑毛石斛D.williamsonii[26]喉红石斛D.christyanum昆明[27]晶帽石斛D.crystallimun(2个居群)腾冲、景洪[28]杯鞘石斛D.gratiotissimum(3个居群)鲁甸、景洪、思茅[29]小黄花石斛Djenkinsii(2个居群)文山、景洪[30]苏唇石斛D.harveyanum景洪[31]梳唇石角斗D.s加ngylanthum[32]尖刀唇石斛D.heterocarpum(3个居群)昆明、景洪、思茅[33]喇叭唇石斛D.lieniflorum(2个居群)腾冲、镇康[34]翅梗石斛D.trigonopus[35]草石斛D.compactum(2个居群)思茅、腾冲[36]秋石斛D.phalaenosis(2个居群)泰国、安宁[37]石斛属一种Dendrobium邻.麻栗坡[38]叉唇石斛D.stuposum[39]勐海石斛D.minutiflorum[40]肿节石斛D.pendulum1.2方法培养室温度25士2"C,保存室温度15-2CTC，光照强度为1500-2000Lx，光照12h/d。培养基随培养目的和不同发育阶段有所不同。培养基PH为5。外植体来源于石斛属各种的果实内种子或茎尖，果在纯乙醇中沾一下，然后在酒精灯火焰上烧后用于接种。茎尖或幼茎在70%乙醇中浸一下，投入0.2e/。升汞8min左右，无菌水冲洗干净后接种。2结果2.1组织培养和快速繁殖技术为了保持遗传性稳定和规模化生产目的，对40种石斛采用种子无菌培养和茎尖、茎节分生组织培养两种方式。2丄1种子无菌培养种子来源于野外采集和自己杂交授粉所结的果实。野外采集的开裂果，收集种子用尼龙布包裹，在0.2y。Hgcl2中消毒7min，无菌水冲洗干净后播种在花宝1号(N:P:K-7:6:19)3g丄"的琼脂培养基上。完整的果实在酒精灯燃烧灭菌后即可将果皮打开将种子播种在上述培养基上。未成熟的果内种子可播种在花宝1号3g丄"+NAAlmg丄—1(单位下同)的琼脂培养基上。石斛属种子大多呈黄色，培养约10天左右即可转绿，增大，继而长成顶端有叶尖或冒出的芽，基部有丝状毛的原球茎，显示种子萌发且萌发率较高(达95%以上)。2丄2分生组织培养将野外采集到的石斛属茎尖或带腋芽的幼茎切段灭菌后接种在1/2MS+NAAlmg丄"+土豆泥3%+香蕉泥15%的琼脂培养基上，培养30天左右，胚芽处可抽生新枝，新枝可切割重复培养，茎尖抽生新枝短呈丛芽状。在此培养基上，它们可长成完整试管苗，供移栽。如果把茎尖和幼茎接种在1/2MS或1/2MS+BA0.5+NAA0.2的琼脂培养基上，外植体基部可分化出大量拟原球茎。拟原球茎在1/2MS+NAAl+土豆泥3%+香蕉泥15%的琼脂培养基上，也可以长成大苗供移栽。2丄3继代繁殖上一步骤原球茎和拟原球茎培养基30天左右，可得到10%lcm小芽和10%0.5cm丛芽，又经过1-2个月的培养，可得到高约2-3cm芽条(占50%左右)，转入生根壮苗培养基(l/2MS+NAAl+土豆泥3°/()+香蕉泥15%)培养1个月后，加强光照(4000Lx及以上)，培养一个月左右，试管苗可达到移苗标准。整个生产周期月4.5个月到6个月。2丄4试管苗移栽当试管苗至少4-5片伸展叶根系正常，健康，高度达6cm左右时，即可出瓶供移栽，出瓶时要小心不能折伤叶片和根尖，清除根系上的琼脂，3-5株一丛种植，种植基质有锯末、树皮、苔藓和陶粒等，基质要用20:1的水甲醛密封消毒24h或用热蒸汽消毒。栽后放在大棚内荫蔽度约70%,棚内温度控制在20°C-28°C，注意保湿和排水。待试管苗长出新根或新叶后，7-15天用1/10MS液，喷施一次，促进幼苗生长，和提前收护。依石斛属种类不同一般l-3年均可收护。二、取上述所得石斛培养物进行离体保存选择石斛属种子萌发后产生胚性组织即原球茎或茎尖和茎基部形成的胚性组织，拟原球茎，丛芽和具根和4-5片叶试管苗3个发育阶段的材料，在培养基为1/2MS+NAAlmg丄"+S2。/。.，温度为15-2(TC中进行离体保存。1、离体低温保存试验石斛属植物大多分布在热带和亚热带，本发明采用15-20'C保存培养物，延缓了生长速度，延长了继代周期。1.1温度对培养物保存的影响保存温度为15-20°C，对照为25士2'C的培养物成活率下降到80%时进行恢复培养(培养基为花宝3g+NAA0.5mg丄"+AC0.05y。)来统计继代周期(见表l)。表l保存温度为15-20°C，对照为25i2'C的培养物成活率下降到80%时进行恢复培养来统计继代周期结果名称离体低温保存(15-20°C)对照(25士2"C)苏唇石斛16个月以上6个月秋石斛13个月以上6个月齿瓣石斛12个月以上5个月兜唇石斛13个月以上6个月黑毛石斛13个月以上6个月草石斛6个月以上美花石斛20个月以上8个月以上叉唇石斛14个月以上7个月大苞鞘石斛18个月以上6个月以上叠鞘石斛12个月6个月尖刀唇石斛12个月6个月鼓槌石斛12个月6个月细茎石斛12个月6个月晶帽石斛19个月以上7个月疏花石斛19个月6个月喇叭唇石斛16个月6个月棒节石斛15个月以上6个月矮石斛13个月以上7个月串珠石斛12个月6个月铁皮石斛21个月8个月霍山石斛19个月6个月束花石斛16个月6个月金钗石斛12个月6个月流苏石斛13个月6个月结果表明培养物成活率下降至80%时，不同的物种其保存时间存在差异。在15-20'C下铁皮石斛继代周期长达21个月，而鼓槌石斛等才12个月。低温(15-20°C)下，培养物继代周期比25士2。C下培养物明显延长1倍以上或1倍。25土2'C下培养物半年左右需继代1次。而低温下培养物1年至一年半以上才需要更新一次。2.2石斛不同发育阶段保存效果比较选择本实施例第一步骤石斛属种子萌发后产生胚性组织(原球茎)或茎尖和茎基部形成的胚性组织，拟原球茎，丛芽和具根和4-5片叶试管苗3个发育阶段的材料做试验，培养基为1/2MS+NAAlmg丄"+S2。/。，结果见表2。表2不同发育阶段材料保存效果比较学名原球茎丛芽试管苗<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>原球茎和拟原球茎发育阶段最有利于保存，其次为完整试管苗。丛生芽阶段保存效果最差。2.3不同培养基组合对离体保存的影响试验材料为原球茎，保存在15-20'C条件下，由表3可以看出不同激素组合对石斛属保存的培养物继代周期有影响。效果最好的培养基配方为1/2MS+NAA1mg丄'1。另外石斛属不同基因型也影响保存效果，在试验条件下保存后继代周期超过1年半甚至2年的种有铁皮石斛、矮石斛、球花石斛、美花石斛、喇叭唇石斛、疏花石斛、晶帽石斛、大苞鞘石斛、霍山石斛、兜唇石斛，秋石斛等。表3不同培养基组合对离体保存的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>黑毛石斛②14个月③10个月喇叭唇石斛②18个月疏花石斛②19个月晶帽石斛②19个月叠鞘石斛②13个月叉唇石斛②15个月大苞鞘石斛②18个月③10个月12个月①8个月霍山石斛③14个月②19个月铁皮石斛②25个月③20个月①10个月兜唇石斛③12个月②18个月齿瓣石斛②17个月秋石斛②18个月12个月离体保存石斛属种质，使之不易丢失，便于交换和利用。本发明提供石斛属离体库，保存方法最有效和最安全，保存材料恢复生长情况良好，增值率可达1:6-10以上，保存成活率80%以上。然后根据种的特性和实验结果及时进行恢复性培养，恢复培养物要在25士2'C下过渡15d后，又放回低温保存室。每隔半年或8个月检查一次污染(5%以上)及变异状况(0.04%以下)。另外注意原球茎保存复壮，方法是采用1/2MS或1/2MS+土豆3%较理想。种的遗传稳定性评价是一项重要工作，一般一年检测一次或是在出库利用前1个月进行。检测方法有①形态解剖结构比较，②细胞学检査，③分子技术，④化学成分分析等。如果形态上有肉眼看得见的变异必须进行分子技术的检测。保存不是目的，更重要是发挥它们的经济和利用价值，使石斛属种质资源保存和可持续利用相结合，相互促进，共同发展。权利要求1、石斛属培养物的离体保存方法，其特征在于取石斛属培养物在培养基为1/2MS+NAA1mg.L-1+S2％.，温度为15-20℃中进行离体保存。2、如权利要求1所述的方法，其特征在于石斛属培养物为不同发育阶段的培养材料即由石斛属种子萌发后产生的胚性组织即原球茎或茎尖和茎基部形成的拟原球茎，由原球茎或拟原球茎分化产生的丛芽，由丛芽分化产生的具根和4-5片叶的试管苗3个发育阶段的材料。3、如权利要求1所述的方法，其特征在于取石斛属培养物即3个不同发育阶段的培养材料也就是由石斛属种子萌发后产生的胚性组织即原球茎或茎尖和茎基部形成的拟原球茎，由原球茎或拟原球茎分化产生的丛芽，由丛芽分化产生的具根和4-5片叶的试管苗，在培养基为1/2MS+NAAlmg丄"+S2。/0，温度为15-20°C中进行离体保存。全文摘要石斛属培养物的离体保存方法，取石斛属培养物即3个不同发育阶段的培养材料也就是由石斛属种子萌发后产生的胚性组织即原球茎或茎尖和茎基部形成的拟原球茎，由原球茎或拟原球茎分化产生的丛芽，由丛芽分化产生的具根和4-5片叶的试管苗，在培养基为1/2MS+NAA1mg.L^-1+S2％，温度为15-20℃中进行离体保存。文档编号A01N3/00GK101238807SQ20081005804公开日2008年8月13日申请日期2008年1月18日优先权日2008年1月18日发明者程治英,罗吉凤,龙春林申请人:中国科学院昆明植物研究所