专利名称：一种苦荞的离体再生培养方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种苦荞的离体再生培养方法。
背景技术：
苦荞(F. tataricum Gaertn,又称鞑靼荞麦)为蓼科(Polygonaceae)，荞麦属 (Fagopyrum)的双子叶作物，起源于中国，是一种抗旱耐寒、营养丰富、药用保健价值高的粮 食作物。生产上的荞麦分为苦荞和甜荞，二者存在生殖隔离。其中苦荞具有较高的营养 保健功能，在国际市场上具有较高的国际竞争力，我国每年出口量约占国际市场需求量的 10%。苦荞的开花习性及遗传特点导致其人工杂交授粉难以成功，这成为苦荞杂交育种难 以获得突破的重要原因。因此利用转基因技术导入有益基因有可能成为苦荞遗传改良的新 途径，而再生及转化体系的建立是开展转基因研究的基础。甜荞的组织培养再生以及转化 体系建立的研究已有报道，但是苦荞在此方面的研究尚未见报道。本发明以苦荞麦的下胚 轴为实验材料，对其愈伤组织和离体再生进行了研究，首次建立了苦荞的离体再生体系，为 苦荞的遗传改良提供了新的途径。
发明内容
本发明针对苦荞人工杂交授粉难以成功的问题，填补苦荞离体再生培养方法的空 白，提供一种快速、经济、简便的苦荞离体再生培养方法。本发明通过如下方式来实现本发明苦荞离体再生培养方法包括以下步骤(1)、苦荞无菌苗的培养；(2)、苦荞愈伤组织的诱导及继代；(3)、苦荞芽的分化；(4)、苦荞根的诱导。本发明所用培养基及植物激素的缩写6-BA，6-benZylamin0purine，6-苄氨基嘌 呤；IBA，indole-3-butyric acid，吲哚丁酸；IAA，indol-3-acetic acid，吲哚乙酸；MS， Mura shige and Skoog medium，Murashige and SkoogJflff^ ；NAA, a -naphthaleneacetic acid,奈乙酸；TDZ，thidiazuron,噻苯隆；2，4_D，2,4-dichlorophenoxy, 2,4- 二氯苯氧乙 酸；KT，6-Furifuryl-aminopurine，6_ 糠氨基嘌呤(激动素)一、苦荞无菌苗的培养选取籽粒饱满的成熟苦荞种子，清水浸泡30-60分钟，剥去种皮，使用种子常规灭 菌方法消毒灭菌，即在75%乙醇溶液中浸泡1分钟，用0. 05% HgCl2 (常规HgCl2表面消毒 浓度为0. 1%，本研究使用浓度为0. 05%即可达到灭菌效果，由此可以降低取(12的毒性。) 溶液表面消毒10分钟，再用无菌水清洗4次。将灭菌后的种子用无菌纸吸干多余水分，接 种到附加3%蔗糖、0.7%琼脂粉无激素的MS固体培养基上培养。每日光照培养16小时，暗培养8小时，光照强度20001x，温度25°C (此培养方法中使用到的培养基均经过常规高压 灭菌)。二、苦荞愈伤组织的诱导及继代取步骤1中培养出的苗龄为6-8天的苦荞无菌苗，将其下胚轴切成约0. 5cm的切 段，放在常规高温灭菌后的MS+2. Omg/L 2,4-D+l. 5mg/L 6-BA的培养基中诱导愈伤组织， MS培养基附加有3%蔗糖、0. 7%琼脂粉，pH5. 8，培养时间为7_10天，培养条件同步骤1苦 荞无菌苗的培养。三、苦荞芽的分化将步骤2中培养出的生长状态良好的愈伤组织转至MS+0. lmg/L IAA+2. Omg/L 6-BA+l. Omg/L KT+0. 5mg/L TDZ的分化培养基中，培养时间15天，培养基其他附加成分及培 养条件同步骤2。四、苦荞根的诱导将步骤3中培养出的生长健壮的幼苗从愈伤组织上切下，转至含0. 5mg/L NAA的 1/2MS培养基上诱导生根，培养条件同步骤1苦荞无菌苗的培养，经过15天的培养，完整的 苦荞植株便培养成功。本发明的苦荞离体再生培养方法的用途①、可用于开展苦荞遗传转化的研究。②、可用于苦荞优良转基因材料的筛选。③、可用于苦荞种质资源的快繁保存。④、可用于苦荞细胞突变体的筛选。⑤、可用于工厂化大规模地从离体再生苦荞中提取芦丁等药用成分。⑥、可用于生产优质脱毒苦荞种苗。本发明具有如下优点①、利用苦荞的下胚轴作为实验材料，能快速、经济、简便地进行苦荞麦的再生培 养；②、利用本方法实现苦荞离体再生的周期较短，从培育无菌苗到再生苗全过程只 需要6周左右；③、不需要复杂的实验条件和高精密的实验仪器。本方法只需高压灭菌锅、无菌操 作台和温室即可，国内的绝大多数实验室能满足此条件，易于推广；④、本方法首次建立苦荞麦的离体再生体系，为苦荞麦进一步的遗传转化研究打 下了基础；⑤、本发明提出苦荞离体再生培养方法，操作简易，成本低廉。⑥、首次将新型植物生长调节剂噻苯隆(Thidiazuron，TDZ)应用于苦荞离体培养 过程的分化培养基中，并显示出明显的促进分化作用。
具体实施例方式下面结合具体实施例，对本发明作进一步说明。实施例一苦荞地方品种黑水苦荞的离体再生培养(1)、选取籽粒饱满的成熟种子，清水浸泡30-60分钟，剥去种皮，使用种子常规灭菌方法消毒灭菌，即在75%乙醇溶液中浸泡1分钟，用0. 05% HgCl2溶液表面消毒10分钟， 再用无菌水清洗4次。将灭菌后的种子用无菌纸吸干多余水分，接种到附加3%蔗糖、0. 7% 琼脂粉无激素的MS固体培养基上培养。每日光照培养16小时，暗培养8小时，光照强度 20001x，温度25°C (此培养方法中使用到的培养基均经过常规高压灭菌)；(2)、愈伤组织的诱导及继代取苗龄为6-8天的黑水苦荞无菌苗，将下胚轴切成约0. 5cm的切段，放在常规高温 灭菌后的MS+2.0mg/L 2，4-D+1.5mg/L 6-BA的培养基中诱导愈伤组织。MS培养基附加有 3%蔗糖、0. 7%琼脂粉，pH5. 8，培养条件同上；(3)、芽的分化将生长状态良好的愈伤组织转至MS+0. lmg/L IAA+2. Omg/L 6-BA+l. Omg/L KT+0. 5mg/L TDZ的分化培养基中，培养基其他附加成分及培养条件同上；(4)、根的诱导将生长健壮的幼苗从愈伤组织上切下，转至含0. 5mg/L NAA的1/2MS培养基上诱 导生根。植株再生频率达到10%左右。实施例二 苦荞地方品种昭通苦荞离体再生培养其方法同实施例一，昭通苦荞植株再生频率达7%左右。实施例三苦荞品种西荞一号的离体再生培养其方法同实施例一，西荞一号植株再生频率达5%左右。实施例四苦荞品种九江苦荞离体再生培养其方法同实施例一，九江苦荞植株再生频率达3%左右。实施例五苦荞品种川荞一号离体再生培养其方法同实施例一，川荞一号植株再生频率达5%左右。
权利要求
一种苦荞的离体再生培养方法，其特征是含以下步骤(1)、无菌苗的培养；(2)、愈伤组织的诱导及继代；(3)、芽的分化；(4)、根的诱导。
2.根据权利要求1所述的苦荞的离体再生培养方法，其特征是(1)、无菌苗的培养方法为将苦荞种子用清水浸泡30-60分钟，剥去种皮，使用种子常 规灭菌方法消毒灭菌，即在75%乙醇溶液中浸泡1分钟，用0. 05% HgCl2溶液表面消毒10 分钟，再用无菌水清洗4次，将灭菌后的种子用无菌纸吸干多余水分，接种到经过常规高压 灭菌、附加3%蔗糖、0. 7%琼脂粉无激素的MS固体培养基上培养，每日光照培养16小时，暗 培养8小时，光照强度20001x，温度25°C ；(2)、愈伤组织的诱导及继代方法取步骤1中培养出的苗龄为6-8天的苦荞无菌苗，将 其下胚轴切成0. 5cm的切段，放在常规高温灭菌后的MS+2. Omg/L 2,4-D+l. 5mg/L 6-BA的 培养基中诱导愈伤组织，MS培养基附加有3%蔗糖、0. 7%琼脂粉，pH5. 8，培养时间为7_10 天，培养条件同步骤1苦荞无菌苗的培养；(3)、芽的分化方法将步骤2中培养出的愈伤组织转至MS+0.lmg/LIAA+2. Omg/L 6-BA+l. Omg/L KT+0. 5mg/L TDZ噻苯隆的分化培养基中，培养时间15天，培养基其他附加成 分及培养条件同步骤2;(4)、根的诱导方法为将步骤3中培养出的幼苗从愈伤组织上切下，转至含0.5mg/L NAA的1/2MS培养基上诱导生根，培养条件同步骤1苦荞无菌苗的培养，经过15天的培养， 完整的苦荞植株便培养成功。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种苦荞的离体再生培养方法。本发明通过无菌苗的培养、愈伤组织的诱导及继代、芽的分化、根的诱导四个步骤，培养出完整的苦荞植株。本发明具有快速、经济、简便的优点。
文档编号A01H4/00GK101869073SQ20091005902
公开日2010年10月27日 申请日期2009年4月22日 优先权日2009年4月22日
发明者吴崇明, 徐智斌, 杨宏, 王涛, 马欣荣 申请人:中国科学院成都生物研究所