专利名称：一种富含龙胆苦苷的坚龙胆组织培养方法
技术领域：
本发明涉及植物生物技术领域，尤其涉及一种富含龙胆苦苷的坚龙胆组织培养方法。
坚龙胆(Ge""awa "'gesce"s Franch.ex.Hemsl.)属龙胆禾斗(Gentianaceae)龙胆属植物，又称滇龙胆，以根入药，最早载于明代《滇南本草》，是《中华人民共和国药典》收载中药，属"龙胆"的基源之一，主产于云南、四川等地，是西南地区中药龙胆的主流品种。我国古时即用之，《本经》中记载，龙胆，"主骨向寒热，惊癎邪气，续绝伤，定五脏，杀蛊毒"。坚龙胆药用成分与龙胆属其他植物类似，主要包括环烯醚萜苷类化合物如龙胆苦苷、当药苦苷、当药苷、马钱子酸等；三萜配糖体类化合物如达玛垸型四环三萜、乌苏垸型和何帕垸型五环三萜；黄酮类化合物如荭草素类、异牡荆素类和查耳酮类化合物；其他酚类化合物以及甾醇类化合物。云南产坚龙胆的环烯醚萜苷类化合物中龙胆苦苷含量较高，是优质龙胆品种之一，也是云南特色的传统地道药材。
龙胆苦苷(Gentiopicroside)，味苦，为天然环烯醚萜苷类化合物，是坚龙胆根中主要活性物质，具有保肝利胆、健胃、促进肠胃消化功能、抗氧化、抗炎、抗菌升高血糖以及对中枢神经系统的作用。基于龙胆苦苷多方面的药理活性，使坚龙胆药材广泛应用于中医药行业，
随着市场需求量的不断扩大，资源的连年采挖，使野生坚龙胆濒临枯
竭，有必要采取现代生物技术手段解决当前坚龙胆的资源问题。
现有技术目前尚无采用组织培养手段获得高含量龙胆苦苷材料
的报道，也没有针对龙胆苦苷在坚龙胆植物组织培养幼苗中茎叶部位
合成和积累的的报道，且对坚龙胆栽培方面的研究并未能从根本上解
决龙胆资源日益短缺的问题。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术存在的不足，基于龙胆苦苷在
植物体内分布的特点及其在药理方面的活性，提供一种含有效成分龙
胆苦苷坚龙胆组培苗的培养方法，此方法简便易行，组培苗生物量提
高快，生长迅速，龙胆苦苷含量高，是获取大量高含量龙胆苦苷的坚
龙胆材料的有效方法。
为了实现本发明的目的，本发明提供了如下的技术方案坚龙胆组培苗的培养方法，包括以下步骤
(1) 坚龙胆丛生芽的诱导、培养取坚龙胆幼枝，经洗涤消毒后，无菌显微条件下剥离茎尖的叶片，取带有生长点的茎尖置于丛生芽诱
导培养基MS+6-苄氨基嘌呤6BA 0.2-2.5 mg/L +萘乙酸忖^ 0.1~1.5mg/L+激动素KT0.1 0.6mg/L中培养，灭菌前培养基pH值精密调至
6.5;
(2) 坚龙胆组培苗培养系的建立将步骤(l)所得丛生芽近顶端部
分切成0.8-1.0 cm带节间的外植体置于生根培养基1/2MS + NAA0.4~2.5 mg/L + 6BA 0.1~0.5 mg/L的培养基中在20-25'C条件下光照培养诱导生根，生根后继续培养。
该方法还可进一步包括坚龙胆不定根的液体培养，将步骤(1)和(2)坚龙胆组培苗中诱导出的不定根用解剖刀切下，用无菌蒸馏水洗去不定根表面的培养基，在无菌条件下称取0.5 g置于液体培养基1/2MS +NAA 0.1~3.0 mg/L + 6BA 0.1~0.5 mg/L中，在100-130 r/min的旋转震荡器中进行悬浮扩大培养。
该方法还可进一步包括龙胆苦苷的含量测定，
步骤(l)中所釆用的消毒方法为坚龙胆幼枝用自来水清洗3-5
遍，置于肥皂液中浸泡1小时后再用流水冲洗1-2小时，取出用无菌滤纸吸干表面水分，用75%的乙醇浸泡消毒20-40秒，然后用无菌水冲洗3次，吸干表面水分后置于10%的过氧化氢溶液中浸泡13分钟，取出后用无菌蒸馏水冲洗6次。
组培苗生根后的第30天对根、茎和叶各部位用高效液相色谱HPLC进行龙胆苦苷含量测定将各部分样品在4(TC条件下风干、粉碎，过60目筛后各称取约0.5g置于10mL容量瓶中，精密加入甲醇10mL、称重，冷浸24h，超声30min，冷却后用甲醇补足重量，过微孔滤膜d=0.45 pm，得供试样品溶液。色谱柱，Agilent ZORBAXSB-C18,4.6 x 250mm, 5jim。流动相；乙腈0.2%冰醋酸8:92, v/v;流速，1.0ml/min;检测波长254 nm;柱温3(TC。每次进样量稀释3倍后吸取10pL，保留时间约为13.5 min ，通过龙胆苦苷标准品的面积外标法进行含量测定，对照品线性方程Y=785748X+44709,R2=0.9998。其中上述所有步骤龙胆苦苷含量经HPLC测定后所得数据采用
EXCEL和DPS软件进行分析评价。
与现有技术相比较，本发明的优异性在于野生或栽培坚龙胆中
龙胆苦苷随生长时间的延长主要集中在根部，而根部在其生长过程中很容易受到土传病虫害的侵染及土壤重金属的污染，无法保证坚龙胆药材的产品质量。本发明中获得了龙胆苦苷含量很高的坚龙胆叶，此材料的获得方法便捷，只需对坚龙胆的地上部分进行扩繁和快繁，省去了不定根的诱导、培养炼苗移栽及栽后的各种管理。此方法繁殖的坚龙胆生物量生长快，培养系稳定，龙胆苦苷含量接近或高于野生坚
龙胆；可以完全或部分取代原有龙胆苦苷的资源植物。
具体实施例方式
下面对本发明的实施例作详细说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不以此为限。
实施例l:
组培坚龙胆叶中龙胆苦苷的含量分析
取坚龙胆幼枝，用自来水清洗5遍，置于肥皂液中浸泡1小时
后再用流水冲洗2小时。取出用无菌滤纸吸干表面水分，用75%的乙醇浸泡消毒40秒，然后用无菌水冲洗3次，吸干表面水分后置于10%的过氧化氢溶液中浸泡13分钟，取出后用无菌蒸馏水冲洗6次，吸干表面水分并在无菌显微条件下进行茎尖剥离。无菌显微条件下剥离茎尖的叶片，取带有生长点的茎尖置于丛生芽诱导培养基MS+6BA(1.0mg/L) + NAA(0.2 mg/L) + KT (0.1 mg/L)(灭菌前培养基pH值精密调至6.5)中培养。将步骤(l)所得丛生芽用解剖刀将近顶端部分切成1.0 cm带节间的外植体，将外植体的生物学下端插入特制MS固体培养基(]^^ +NAA 1.5 mg/L + 6BA 0.1 mg/L,灭菌前培养基pH值精密调至6.5)中进行不定根的诱导。每瓶插5苗，置于距30W日光灯35 cm的培养架中光照培养。培养15天时外植体开始生根，其生根率大于99%。生根后继续培养30天，后对该组培苗进行收获，平均每瓶坚龙胆组培苗的干重为0.55 g是接种量的55倍。
坚龙胆组培苗中叶的龙胆苦苷的含量用高效液相色谱(HPLC)测定，条件如下Waters高效液相色谱仪；Photodiode Array Detector,UV检测器；试剂色谱纯乙腈，分析纯冰乙酸，超纯水。色谱柱，Agilent ZORBAXSB-C18, 4.6 x 250 mm, 5 pm。流动相；乙腈0.2%冰醋酸(8:92,v/v);流速，1.0ml/min;检测波长254 nm;柱温3(TC。每次进样量稀释3倍后吸取10 pL，通过龙胆苦苷标准品的面积外标法进行含量测定。
经HPLC分析，得出该条件下诱导培养的坚龙胆叶中龙胆苦苷的含量为9.75%。
实施例2:
组培坚龙胆茎中龙胆苦苷的含量分析
取坚龙胆幼枝，用自来水清洗3遍，置于肥皂液中浸泡1小时后再用流水冲洗1小时。取出用无菌滤纸吸干表面水分，用75%的乙醇浸泡消毒20秒，然后用无菌水冲洗3次，吸干表面水分后置于10%的过氧化氢溶液中浸泡12分钟，取出后用无菌蒸馏水冲洗6次，吸干表面水分并在无菌显微条件下进行茎尖剥离。无菌显微条件下剥离茎尖的叶片，取带有生长点的茎尖置于丛生芽诱导培养基MS+6BA(1.0 mg/L) + NAA (0.2 mg/L) + KT (0.1 mg/L)(灭菌前培养基pH值精 密调至6.5)中培养。
将步骤(l)所得丛生芽用解剖刀将近顶端部分切成0.8-1.0 cm带节 间的外植体，将外植体的生物学下端插入特制MS固体培养基(>^+ NAA 1.5 mg/L + 6BA 0.1 mg/L,灭菌前培养基pH值精密调至6.5)中 进行不定根的诱导。每瓶插5苗，置于距30W日光灯35 cm的培养 架中光照培养。培养15天时外植体开始生根，其生根率大于99%。 生根后继续培养30天，后对该组培苗进行收获，平均每瓶坚龙胆组 培苗的干重为0.55 g是接种量的55倍。
坚龙胆组培苗中茎的龙胆苦苷的含量用高效液相色谱(HPLC)测 定，条件如下Waters高效液相色谱仪；Photodiode Array Detector, UV检测器；试剂色谱纯乙腈，分析纯冰乙酸，超纯水。色谱柱， Agilent ZORBAXSB-C18, 4.6 x 250 mm, 5 ium。流动相；乙腈0.2% 冰醋酸(8:92,v/v);流速，l.Oml/min;检测波长254 nm;柱温3(TC。 每次进样量稀释3倍后吸取10 pL，通过龙胆苦苷标准品的面积外标 法进行含量测定。
经HPLC含量测定，得出该条件下诱导培养的坚龙胆茎中龙胆苦 苷的含量为4.34%。 实施例3:
组培坚龙胆根中龙胆苦苷的含量分析
取坚龙胆幼枝，用自来水清洗4遍，置于肥皂液中浸泡l小时后 再用流水冲洗2小时。取出用无菌滤纸吸干表面水分，用75%的乙醇 浸泡消毒30秒，然后用无菌水冲洗3次，吸干表面水分后置于10% 的过氧化氢溶液中浸泡13分钟，取出后用无菌蒸馏水冲洗6次，吸干表面水分并在无菌显微条件下进行茎尖剥离。无菌显微条件下剥离
茎尖的叶片，取带有生长点的茎尖置于丛生芽诱导培养基MS+6BA (1,0 mg/L) + NAA (0.2 mg/L) + KT (0.1 mg/L)(灭菌前培养基pH值精 密调至6.5)中培养。
将步骤(l)所得丛生芽用解剖刀将近顶端部分切成0.8 cm带节间 的外植体，将外植体的生物学下端插入特制MS固体培养基(MS十 NAA 1.5 mg/L + 6BA 0.1 mg/L,灭菌前培养基pH值精密调至6.5)中 进行不定根的诱导。每瓶插5苗，置于距30W日光灯35 cm的培养 架中光照培养。培养15天时外植体开始生根，其生根率大于99%。 生根后继续培养30天，后对该组培苗进行收获，平均每瓶坚龙胆组 培苗的干重为0.55 g是接种量的55倍。
坚龙胆组培苗中根的龙胆苦苷的含量用高效液相色谱(HPLC)测 定，条件如下Waters高效液相色谱仪；Photodiode Array Detector, UV检测器；试剂色谱纯乙腈，分析纯冰乙酸，超纯水。色谱柱， Agilent ZORBAXSB-C18, 4.6 x 250 mm, 5 jLim。流动相；乙腈0.2% 冰醋酸(8:92,v/v);流速，1.0ml/min;检测波长254 nm;柱温30。C。 每次进样量稀释3倍后吸取10 hL，通过龙胆苦苷标准品的面积外标 法进行含量测定.
经HPLC含量测定，得出该条件下诱导培养的坚龙胆根中龙胆苦 苷的含量为0。
实施例4:
坚龙胆悬浮培养不定根中龙胆苦苷含量的分析
取坚龙胆幼枝，用自来水清洗3-5遍，置于肥皂液中浸泡l小时 后再用流水冲洗1-2小时。取出用无菌滤纸吸干表面水分，用75%的乙醇浸泡消毒20-40秒，然后用无菌水冲洗3次，吸干表面水分后置 于10%的过氧化氢溶液中浸泡13分钟，取出后用无菌蒸馏水冲洗6 次，吸干表面水分并在无菌显微条件下进行茎尖剥离。无菌显微条件 下剥离茎尖的叶片，取带有生长点的茎尖置于丛生芽诱导培养基MS +6BA (1.0 mg/L) + NAA (0.2 mg/L) + KT (0.1 mg/L)(灭菌前培养基 pH值精密调至6.5)中培养。
将步骤(l)所得丛生芽用解剖刀将近顶端部分切成0.8-1.0 cm带 节间的外植体，将外植体的生物学下端插入特制MS固体培养基(MS +NAA1.5mg/L+6BA0.1 mg/L,灭菌前培养基PH值精密调至6.5)中 进行不定根的诱导。每瓶插5苗，置于距30W日光灯35 cm的培养 架中光照培养。培养15天时外植体开始生根，用解剖刀将诱导出来 的不定根切下，用无菌蒸馏水洗去不定根表面的培养基，在无菌条件 下称取0.5 g置于MS+NAA (1.5 mg/L) + 6BA (0.1 mg/L)液体培养基 中，在100-130 r/min的旋转震荡器中悬浮培养；在悬浮培养100天 时对其进行龙胆苦苷的含量测定。
坚龙胆悬浮不定根中龙胆苦苷的含量用高效液相色谱(HPLC)测 定，条件如下Waters高效液相色谱仪；Photodiode Array Detector,
UV检测器；试剂色谱纯乙腈，分析纯冰乙酸，超纯水。色谱柱，
AgilentZORBAXSB-C18,4.6 x 250mm, 5/im。流动相；乙腈0.2% 冰醋酸(8:92,v/v);流速，1.0ml/min;检测波长254 nm;柱温3(TC。 每次进样量稀释3倍后吸取10 pL，通过龙胆苦苷标准品的面积外标 法迸行含量测定。
经HPLC含量测定，得出该条件下诱导培养的坚龙胆不定根中不 含龙胆苦苷。本发明还进行了野生坚龙胆中龙胆苦苷的含量测定试验。 供含量分析的野生坚龙胆样品采自昆明市北郊大马山，株高约25
cm，基部主茎木质化、茎基部直径约3mm，主根消失、侧根发达、 侧根长约IO cm。
对比实施例l:
野生龙胆叶中龙胆苦苷含量的分析
野生坚龙胆叶中的龙胆苦苷的含量用高效液相色谱(HPLC)测定， 条件如下Waters高效液相色谱仪；Photodiode Array Detector, UV 检测器；试剂色谱纯乙腈，分析纯冰乙酸，超纯水。色谱柱，Agilent ZORBAX SB-C18, 4.6 x 250 mm, 5 pm。流动相；乙腈0.2°/。冰醋酸 (8:92,v/v);流速，1.0ml/min;检测波长254nm;柱温3(TC。每次进 样量稀释3倍后吸取10 pL，通过龙胆苦苷标准品的面积外标法进行 含量测定。
经HPLC含量测定，得出野生坚龙胆叶中龙胆苦苷的含量为 7.62%。
对比实施例2:
野生龙胆茎中龙胆苦苷含量的分析
野生坚龙胆茎中的龙胆苦苷的含量用高效液相色谱(HPLC)测 定，条件如下Waters高效液相色谱仪；Photodiode Array Detector,
UV检测器；试剂色谱纯乙腈，分析纯冰乙酸，超纯水。色谱柱，
Agilent ZORBAX SB-C18, 4.6 x 250 mm, 5 ym。流动相；乙腈0.2% 冰醋酸(8:92,v/v);流速，1.0ml/min;检测波长254 nm;柱温30。C。 每次进样量稀释3倍后吸取10 HL，通过龙胆苦苷标准品的面积外标 法进行含量测定。经HPLC含量测定，得出野生坚龙胆茎中龙胆苦苷的含量为
2.3%。
对比实施例3-
野生龙胆根中龙胆苦苷含量的分析
野生坚龙胆根中的龙胆苦苷的含量用高效液相色谱(HPLC)测 定，条件如下Waters高效液相色谱仪；Photodiode Array Detector, UV检测器；试剂色谱纯乙腈，分析纯冰乙酸，超纯水。色谱柱， AgilentZORBAXSB-C18,4.6 x 250mm, 5jLim。流动相；乙腈0.2% 冰醋酸(8:92,v/v);流速，1.0ml/min;检测波长254 nm;柱温30。C。 每次进样量稀释3倍后吸取10 pL，通过龙胆苦苷标准品的面积外标 法迸行含量测定。
经HPLC含量测定，得出野生坚龙胆根中龙胆苦苷的含量为 9.68%。
权利要求
1、坚龙胆组培苗的培养方法，包括以下步骤(1)坚龙胆丛生芽的诱导、培养取坚龙胆幼枝，经洗涤消毒后，无菌显微条件下剥离茎尖的叶片，取带有生长点的茎尖置于丛生芽诱导培养基MS+6-苄氨基嘌呤6BA 0.2～2.5mg/L+α萘乙酸NAA0.1～1.5mg/L+激动素KT 0.1～0.6mg/L中培养，灭菌前培养基pH值调至6.5；(2)坚龙胆组培苗培养系的建立将步骤(1)所得丛生芽近顶端部分切成0.8-1.0cm带节间的外植体置于生根培养基1/2MS+NAA0.4～2.5mg/L+6BA 0.1～0.5mg/L中，在20-25℃条件下光照培养诱导生根，生根后继续培养。
2、 根据权利要求1所述的坚龙胆组培苗的培养方法，其特征是 该方法进一步包括坚龙胆不定根的液体培养，将步骤(2)坚龙胆组培 苗中诱导出的不定根用解剖刀切下，用无菌蒸馏水洗去不定根表面的 培养基，在无菌条件下称取0.5 g置于液体培养基1/2MS + NAA 0.1-3.0 mg/L + 6BA0.1 0.5mg/L中，在100-130 r/min的旋转震荡器 中进行悬浮扩大培养。
3、 根据权利要求1所述的坚龙胆组培苗的培养方法，其特征是 该方法进一步包括龙胆苦苷的含量测定。
4、 根据权利要求1所述的坚龙胆组培苗的培养方法，其特征是 步骤(l)中所采用的消毒方法为坚龙胆幼枝用自来水清洗3-5遍，置 于肥皂液中浸泡1小时后用流水冲洗1-2小时，取出用无菌滤纸吸干表面水分，用75%的乙醇浸泡消毒20-40秒，然后用无菌水冲洗3 次，吸干表面水分后置于10%的过氧化氢溶液中浸泡13分钟，取出 后用无菌蒸馏水冲洗6次。
5、根据权利要求1所述的坚龙胆组培苗的培养方法，其特征是 组培苗生根后的第30天对根、茎、叶各部位用高效液相色谱HPLC 进行龙胆苦苷含量测定将各部分样品在4(TC条件下风干、粉碎， 过60目筛后各称取0.5g置于10mL容量瓶中，加入甲醇10mL，称 重，冷浸24h，超声30min，冷却后用甲醇补足至前面所称重量，过 微孔滤膜d=0.45 pm，得供试样品溶液，在色谱柱，Agilent ZORBAX SB-C18, 4.6 x 250 mm, 5 |Lim;流动相乙腈:0.2%冰醋酸8:92, v/v;流 速，l.Oml/min;检测波长254 nm;柱温3(TC条件下，每次进样量稀 释3倍后吸取10pL，保留时间13.5min条件下，通过龙胆苦苷标准 品的面积外标法进行含量测定，对照品线性方程为 Y=785748X+44709, R2=0.9998。
全文摘要
本发明基于龙胆苦苷在植物体内分布的特点及其在药理方面的活性，提供一种含有效成分龙胆苦苷坚龙胆组培苗的培养方法，包括坚龙胆丛生芽的诱导、培养和坚龙胆组培苗培养系的建立及龙胆苦苷含量测定，还可进一步包括坚龙胆不定根的悬浮培养。本方法简便易行，可在短期内形成大量优良快繁苗，具有繁殖速度快、周期短、龙胆苦苷含量高等优点，是大量获取龙胆苦苷的有效途径，并为坚龙胆优良快繁苗的规模化生产提供可靠的技术依据。
文档编号A01H4/00GK101658136SQ200910094989
公开日2010年3月3日 申请日期2009年9月18日 优先权日2009年9月18日
发明者张颖君, 朱宏涛, 杨崇仁, 东 王, 敏 许, 平 赵 申请人:中国科学院昆明植物研究所