专利名称：：一种无特定病原体级东方田鼠的培育方法
技术领域：
：本发明涉及一种医药制品、生物
技术领域：
的无特定病原体(简称SPF)级实验动物的培育方法，特别是SPF级东方田鼠的培育方法。
背景技术：
：东方田鼠隶属仓鼠科(Cricetidae)、田鼠亚科(Microtinae)、田鼠属(Microtus)，是常见的啮齿动物，在我国分布极广，北至黑龙江、南至广东省，共覆盖了18省、市、自治区。早在上世纪50年代人们就注意到东方田鼠对日本血吸虫具有天然抗感染性，近年来科研工作者们对普通环境下饲养和繁殖的东方田鼠从其遗传学、生物学、抗血吸虫病机理等多方位进行了较为系统的观察研究，发现其除了具有抗血吸虫感染的特性外，还对高脂饲料敏感易发生非酒精性脂肪肝，并且在肿瘤研究方面也有一定价值。野外或未经净化的东方田鼠携带着多种致病病原体，有学者从东方田鼠中检测到多杀巴斯德杆菌、支气管鲍特杆菌、金黄色葡萄球菌、贾第虫、鼠六鞭毛虫、其他肠道鞭毛虫、螨、虱等病原体和寄生虫，还有学者从东方田鼠体内分离到汉坦病毒。因此要充分利用东方田鼠资源，必须对东方田鼠进行净化使其达到SPF级，才能进行实验动物化，提供安全、理想的实验用东方田鼠，为其在疾病研究方面贡献应有的价值。据文献报道，有学者试图采用药物净化的方法，获得SPF级东方田鼠，如柏熊等在2006年《上海畜牧兽医通讯)》第6期中描述了一种采用药物净化法来获得SPF级东方田鼠的方法通过用双甲脒给东方田鼠洗澡，口服甲硝唑及肌肉注射红霉素和利巴韦林的方法净化东方田鼠。但药物净化方法存在以下缺陷获得的动物在细菌和寄生虫检测时，均能发现一些在啮齿类清洁级动物中不该存在的细菌、病毒和寄生虫。为此，需要研究提供一种新的获得高级别的SPF级东方田鼠的方法，这将对东方田鼠在抗日本血吸虫和非酒精性脂肪肝等方面的深入研究有独特的价值。
发明内容本发明所要解决的问题是提供一种新的方法来获得SPF级东方田鼠，使之既不携带人兽共患病病原及动物烈性传染病病原、也不携带对动物有危害病原体或潜在感染、条件致病菌和对科研干扰大的病原体，能为科学研究提供准确、可靠的数据。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是一种SPF级东方田鼠的培育方法，依次按以下步骤进行(1)受孕东方田鼠雌雄配对同笼饲养，每笼饲养东方田鼠雌雄各一只，使雌鼠怀孕；(2)确定孕鼠的剖腹时间通过孕鼠触诊结合观察其外阴和乳房来确定东方田鼠孕鼠的剖腹时间；(3)剖腹取胎术前的消毒准备将手术隔离器彻底消毒，并将手术隔离器与大小鼠隔离器连接，手术器械高压灭菌和配制消毒液；(4)东方田鼠剖腹取胎手术将临产的东方田鼠脱颈椎快速处死，用酒精棉擦拭孕鼠腹部消毒，快速打开腹腔暴露子宫，医用止血钳夹住两个子宫角和子宫口，摘除子宫，取出经过药浴槽传入的手术隔离器，松开止血钳，小心挑破子宫露出仔鼠，剪断胎盘，用干药棉吸干仔鼠身上的羊水，刺激其下体促使其自主呼吸，直到身体泛红，通过联结袖将仔鼠传入大小鼠隔离器；(5)代乳东方田鼠仔鼠的代乳鼠为SPF级ICR小鼠和SD大鼠代乳分两个阶段初生东方田鼠仔鼠第15天由ICR小鼠代乳，出生第615天由SD大鼠代乳；(6)微生物学和寄生虫检测包括细菌、病毒和寄生虫三方面，检测项目为按GB14922.1-2001实验动物寄生虫学等级及监测和GB14922.2-2001实验动物微生物学等级及监测中大小鼠SPF级的必须检测项目。步骤(1)所述东方田鼠，选自普通级封闭群中毛色光泽度好、发育正常、性情温和、受孕率高、产仔数多，且仔鼠生长发育良好、成活率高，连胎性高的雌性东方田鼠和体型健壮、性发育成熟的雄性东方田鼠。步骤(5)所述东方田鼠仔鼠的代乳鼠是指为非初次产仔且母性好、无食仔癖的母鼠，经检测均符合实验大小鼠SPF等级国家标准、饲养于大小鼠隔离器中的ICR小鼠或SD大鼠。步骤(5)所述东方田鼠仔鼠分两个阶段代乳是指初生第15天东方田鼠仔鼠由SPF级ICR小鼠代乳，挑选当日产仔的ICR小鼠作为代乳母鼠，将其仔鼠取出，将刚剖腹取胎获得的东方田鼠仔鼠与23只ICR仔鼠充分接触，随即放入大小鼠隔离器中的ICR母鼠饲养盒中实施代乳；出生第615天东方田鼠仔鼠由SPF级SD大鼠代乳，挑选当日产仔的SD大鼠作为代乳母鼠，将其仔鼠取出，将已由ICR母鼠代乳5天的东方田鼠仔鼠与23只SD大鼠仔鼠充分接触后，随即转移至大小鼠隔离器中的SD母鼠饲养盒中实施代乳，直至第15天离乳。所述充分接触的目的在于混淆两种仔鼠的体味，以免代乳母鼠排斥拒绝代乳。本发明的优点是1.无菌条件下进行剖腹取胎、寄养代乳净化方法，可排除部分病原微生物垂直传播，其原因是胎盘可承担一种高效过滤作用，能保护胎儿免受母体携带的几乎所有的细菌和绝大多数病毒感染，从而达到比药物净化具有更大的优势的净化效果；2.通常，在剖宫取胎术后多采用与供胎鼠同一品种的代乳鼠代乳，但目前无SPF级东方田鼠可用作代乳鼠，而改用与供胎鼠不同的单一大鼠或单一小鼠代乳都未获成功因为ICR代乳母鼠体型较小、乳汁量不能满足日益长大的东方田鼠仔鼠的需求；SD大鼠体型较大有足够的乳汁，但一旦用它来为体型差异太大的东方田鼠仔鼠代乳，SD大鼠会拒绝哺乳甚至将其踩死。本发明中采用两种与供胎鼠完全不同品种代乳鼠分二个阶段为东方田鼠仔鼠代乳，获得了成功。具体实施例方式本实施例中采用的供胎鼠东方田鼠为开放设施中饲养的洞庭湖种群普通级封闭群；代乳鼠SPF级ICR小鼠和SD大鼠，饲养于ra系列大小鼠隔离器中。所述供胎鼠东方田鼠、代乳鼠SPF级ICR小鼠和SD大鼠均由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供。本发明SPF级东方田鼠的培育方法，依次按以下步骤进行(1)受孕东方田鼠雌雄各选叁只，雌雄配对分三笼饲养，每笼饲养东方田鼠雌雄各一只，分别使雌鼠怀孕；(2)确定孕鼠的剖腹时间在非麻醉状态下，用手指触摸孕鼠腹部两侧，当感觉子宫凹凸明显，且有坚实骨感时，同时结合表形观察孕鼠外阴潮红，乳房红而肿大，来确定孕鼠临产时间；(3)剖腹取胎术前的消毒准备提前将手术隔离器彻底消毒，连接手术隔离器与大小鼠隔离器连接，手术器械高压灭菌和配制消毒液，高压灭菌手术器材，按11200比例配制35°C的消毒灵溶液，并倒入浴槽，同时配制2%过氧乙酸溶液，以备喷雾消毒；(4)剖腹取胎手术取即将临产的东方田鼠以脱颈椎法快速处死，用酒精棉擦拭孕鼠腹部消毒，快速打开腹腔暴露子宫，医用止血钳夹住两个子宫角和子宫口，摘除子宫，取出经过药浴槽传入的手术隔离器，松开止血钳，小心挑破子宫露出仔鼠，剪断胎盘。叁对东方田鼠共剖出16只仔鼠，用干药棉吸干仔鼠身上的羊水，刺激其下体促使其自主呼吸，直到身体泛红，通过联结袖将仔鼠传入I3R系列大小鼠隔离器中；(5)代乳代乳鼠为SPF级ICR小鼠和SPF级SD大鼠，初生第15天东方田鼠仔鼠由ICR小鼠代乳，出生第615天东方田鼠仔鼠由SD大鼠代乳；步骤(1)所述东方田鼠，雌雄各选叁只，选自普通级封闭群中毛色光泽度好、发育正常、性情温和、受孕率高、产仔数多，且仔鼠生长发育良好、成活率高，连胎性高的雌性东方田鼠和体型健壮、性发育成熟的雄性东方田鼠；步骤(5)所述东方田鼠仔鼠代乳鼠是指为非初次产仔且母性好、无食仔癖的母鼠，经检测均符合实验大小鼠SPF等级国家标准、饲养于大小鼠隔离器中的ICR小鼠或SD大鼠。步骤(5)所述东方田鼠仔鼠分两个阶段代乳是指初生第15天东方田鼠仔鼠由SPF级ICR小鼠代乳，挑选当日产仔的ICR小鼠代乳母鼠，将其仔鼠取出，将刚剖腹取胎获得的东方田鼠仔鼠与23只ICR仔鼠充分接触混淆两种仔鼠的体味后，随即放入大小鼠隔离器中的ICR母鼠饲养盒中实施代乳；出生第615天东方田鼠仔鼠由SPF级SD大鼠代乳，挑选当日产仔的SD大鼠作为代乳母鼠，将其仔鼠取出，将已由ICR母鼠代乳5天的东方田鼠仔鼠与23只SD大鼠仔鼠充分接触混淆两种仔鼠的体味后，随即转移至大小鼠隔离器中的SD母鼠饲养盒中实施代乳，直至第15天离乳。(6)微生物学和寄生虫检测对离乳后的东方田鼠作细菌、病毒和寄生虫三方面的综合检测，检测项目为按GB14922.1-2001实验动物寄生虫学等级及监测和GB14922.2-2001实验动物微生物学等级及监测中大小鼠SPF级的必须检测项目。检测的细菌项目包括沙门菌、支原体、鼠棒状杆菌、泰泽病原体、嗜肺巴斯德杆菌、肺炎克雷伯杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、支气管鲍特杆菌；病毒项目包括汉坦病毒、小鼠肝炎病毒、鼠痘病毒、仙台病毒、小鼠肺炎病毒、呼肠孤病毒III型、小鼠细小病毒、大鼠细小病毒RV株、大鼠细小病毒H-I株；寄生虫项目包括体外寄生虫、弓形虫、蠕虫、肠道鞭毛虫和纤毛虫等。以上实施例中经剖腹取胎和二个代乳阶段，16只东方田鼠仔鼠中成活15只，成活率达到93.75%。15只离乳后成活的东方田鼠，微生物和寄生虫检测结果示于表1。由表1所示可见，净化方法是成功的，我们已获得了SPF级东方田鼠。表1离乳后东方田鼠微生物和寄生虫检测结果检测指标东方田鼠检大鼠检测项小鼠检测项<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注-未检测到；·大小鼠清洁级必测项目；▲大小鼠SPF级必测项目。本发明的意义在于首次成功获得SPF级东方田鼠，弥补了已有技术药物净化方面的不足，为建立理想的抗血吸虫和非酒精性脂肪肝等疾病的动物模型及研究这些疾病的发病的机制奠定了基础；同时，提供了一种新的实验动物资源，为东方田鼠实验动物化提供了保证。本发明的成功，对其它野生动物、特别是对野生鼠类的净化研究具有参考价值。权利要求一种无特定病原体级东方田鼠的培育方法，其特征在于依次按以下步骤进行(1)受孕东方田鼠雌雄配对同笼饲养，每笼饲养东方田鼠雌雄各一只，使雌鼠怀孕；(2)确定孕鼠的剖腹时间通过孕鼠触诊结合观察其外阴和乳房来确定东方田鼠孕鼠的剖腹时间；(3)剖腹取胎术前的消毒准备将手术隔离器彻底消毒，并将手术隔离器与大小鼠隔离器连接，手术器械高压灭菌和配制消毒液；(4)东方田鼠剖腹取胎手术将临产的东方田鼠脱颈椎快速处死，用酒精棉擦拭孕鼠腹部消毒，快速打开腹腔暴露子宫，医用止血钳夹住两个子宫角和子宫口，摘除子宫，取出经过药浴槽传入的手术隔离器，松开止血钳，小心挑破子宫露出仔鼠，剪断胎盘，用干药棉吸干仔鼠身上的羊水，刺激其下体促使其自主呼吸，直到身体泛红，通过联结袖将仔鼠传入大小鼠隔离器；(5)代乳东方田鼠仔鼠的代乳鼠为SPF级ICR小鼠和SD大鼠，代乳分两个阶段初生东方田鼠仔鼠第1～5天由ICR小鼠代乳，出生第6～15天由SD大鼠代乳；(6)微生物学和寄生虫检测包括细菌、病毒和寄生虫三方面，检测项目为按GB14922.1-2001和GB14922.2-2001中大小鼠SPF级的必须检测项目。2.根据权利要求1所述一种无特定病原体级东方田鼠的培育方法，其特征在于步骤(1)所述东方田鼠，选自普通级封闭群中毛色光泽度好、发育正常、性情温和、受孕率高、产仔数多，且仔鼠生长发育良好、成活率高，连胎性高的雌性东方田鼠和体型健壮、性发育成熟的雄性东方田鼠。3.根据权利要求1所述一种无特定病原体级东方田鼠的培育方法，其特征在于步骤(5)所述东方田鼠仔鼠的代乳鼠是指为非初次产仔且母性好、无食仔癖的母鼠，经检测均符合实验大小鼠SPF等级国家标准、饲养于大小鼠隔离器的饲养盒中的ICR小鼠和SD大鼠。4.根据权利要求1所述一种无特定病原体级东方田鼠的培育方法，其特征在于步骤(5)所述东方田鼠仔鼠分两个阶段代乳是指初生第15天东方田鼠仔鼠由SPF级ICR小鼠代乳，挑选当日产仔的ICR小鼠作为代乳母鼠，将其仔鼠取出，将刚剖腹取胎获得的东方田鼠仔鼠与23只ICR仔鼠充分接触，随即放入大小鼠隔离器的ICR母鼠饲养盒中实施代乳；出生第615天东方田鼠仔鼠由SPF级SD大鼠代乳，挑选当日产仔的SD大鼠作为代乳母鼠，将其仔鼠取出，将已由ICR母鼠代乳5天的东方田鼠仔鼠与23只SD大鼠仔鼠充分接触后，随即转移至大小鼠隔离器的SD母鼠饲养盒中实施代乳，直至第15天离乳。全文摘要一种无特定病原体(简称SPF)级东方田鼠的培育方法，依次按以下步骤进行(1)每笼配对饲养东方田鼠雌雄各一只，使雌鼠怀孕；(2)通过孕鼠触诊结合观察确定孕鼠剖腹时间；(3)剖腹取胎术前消毒准备；(4)东方田鼠剖腹取胎手术；(5)初生东方田鼠仔鼠第1～5天由SPF级工CR小鼠代乳，出生第6～15天由SPF级SD大鼠代乳；(6)按GB14922.1-2001和GB14922.2-2001必须检测项目作微生物学和寄生虫检测。本发明在无菌条件下进行剖腹取胎、采用两种与供胎鼠完全不同品种代乳鼠寄养代乳净化方法，达到比药物净化具有更大优势的净化效果，首次成功获得SPF级东方田鼠，为建立理想的抗血吸虫和非酒精性脂肪肝等疾病的动物模型及研究这些疾病的发病的机制奠定了基础。文档编号A61D1/08GK101803583SQ20101010556公开日2010年8月18日申请日期2010年2月4日优先权日2010年2月4日发明者杨玉琴,柏熊,王晓东,谢建云,邢正弘,陈国强,高诚申请人:上海西普尔-必凯实验动物有限公司