专利名称：水稻根长发育控制基因OsSPR1编码的基因及蛋白质的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域。具体的说，本发明涉及水稻根长调控基因OsSPRl 及其应用。
背景技术：
植物的根系在高等植物的生长过程中起着非常重要的作用，不仅为地上部分提供 物理支持，而且还从土壤中吸收营养元素和水分，维系着植株的生长发育。植物根系可以 分为两大类，大多数双子叶植物所具有的直根系和大多数单子叶植物所具有的须根系。双 子叶植物的根系主要由主根，侧根组成；而单子叶植物的根系主要由主根、不定根和侧根构 成。水稻作为世界上最重要的粮食作物之一，其根系由种子根和大量的不定根以及侧根组 成。在根构型参数中，根长被认为是对植物的生产力和抗逆能力关系最密切的一个参数。 影响根系发育的因素既受自身内在机制的调控，也和外界环境有很大的关系(Beemster et al.，2003)。根长是水稻生长中一个重要性状，但根长发育调控的分子机制目前所知还很少 也很不系统，目前已经有一些根长相关基因得到克隆报道(Ge et al. ,2004 ；Han et al., 2008 ；Li et al.，2006 Jiang et al.，2006 Jia et al.，2008)。Ge et al. (2004)报道了 OsRAAl，增强表达该基因导致根长变短。Han et al. (2008)进一步明确了 OsRAAl通过细胞 周期来调控根生长发育。Li et al. (2006)研究表明谷氨酸(Glu)受体在早期的水稻的根 分生区对维持细胞的分裂和活性起着重要的作用。这个基因突变就会使根分生区的细胞活 性受到影响，同时还出现大量的调亡细胞，造成短根表型(Li et al.，2006)。另外，OsGNAl and OsCYT-INVI的克隆表明糖代谢相关基因也对根生长起着重要作用，这两个基因突变也 造成短根(Jia et al.，2008 Jiang et al.，2005)。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种水稻根长发育控制基因OsSPRl编码的基 因及蛋白质。为了解决上述技术问题，本发明提供了一种水稻根长发育控制基因OsSPRl编码 的蛋白质，具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。本发明中还提供了一种编码前述蛋白质的基因，该基因具有SEQ ID NO 1所示的 核苷酸序列。本发明中所述的蛋白质，还包括下述氨基酸序列，该氨基酸序列是在SEQ ID NO 2 所示的氨基酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个氨基酸生成的衍生物。本发明中所述的基因，还包括下述核苷酸序列，该核苷酸序列是在SEQ ID N0:1所 示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的突变体、等位基因或衍 生物。本发明的目的是提供一种从水稻根长突变体Qssprl中克隆的新基因OsSTOl，如SEQ IDNO :1所示的cDNA序列，也包括与SEQ ID NO :1所示的cDNA序列至少有80%同源 性的基因序列。本发明中的SEQ ID NO :2所示的蛋白质属于新的线粒体基因，其中进行一 个或几个替换，插入或缺失所获得的功能类似物。另外，也包括在SEQ ID NO :2中添加、取 代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物，具有相同功能的序 列也能达到本发明的目的。本发明的另一个目的是提供一种用OsSPRl基因进行高效的植物转化的方法，具 体地说，本发明提供了具有SEQ ID NO :1所示的序列的基因片段的载体。本发明还提供了一种利用植物表达载体转化植物细胞调控水稻根生长能力及铁 含量的方法。本发明的有益效果在于利用一个短不定根及短侧根水稻突变体为研究材料，通过图位克隆策略克隆到引 起突变表型的基因，通过表型分析与生理分析以及对克隆到基因的亚细胞定位分析及功能 回复验证，确定该基因参与调控水稻根长的发育。该基因的功能缺失突变体表现为叶片铁 含量减少，根中铁的含量和野生型是一致的。而恢复该基因的表达则能恢复叶片中铁的含 量。表明该基因能调控叶片中铁的含量。本发明提供了水稻根系生长发育以及铁离子体内 转运的分子调控机制，并为通过基因工程手段调控水稻根系结构及铁的含量提供了基础。
图1是OsSPRl基因在水稻第1染色体上的定位图和基因结构图。图1中A为OsSPPl基因精细定位结果，其位于STS标记STSl和STS2之间，该区域 被BAC克隆P0506A10所覆盖；B为OsSPRl基因结构及等位突变体突变位点图。3个等位突 变体分别为 sprl-1 (CDS 2533bp 处 C 变为 Τ)，sprl-2 (CDS 1684bp 处 A 变为 Τ)，sprl-3 (CDS 250bp处A变为Τ)，黑色方块代表外显子；C为OsSPRl蛋白结构图。图中方块依次为预测 的线粒体导肽(l-29aa)、两个代表预测的夸膜结构域(427-447aa、500-518aa)、预测的卷 曲螺旋结构域(740-835aa)。图2是野生型和突变体Ossprl在Fe(II)和Fe(III)条件下的表型及组织Fe含量。图2中A为野生型(WT)和突变体(sprl)在Fe (II)、Fe (III)条件下生长15天 苗的叶绿素含量；B为野生型(WT)和突变体(sprl-Ι，sprl-2)及突变体转正常OsSPRl基 因的回复转基因株系(OV)在不同形态铁供应条件下15天苗叶片Fe的含量；C为在不同形 态铁供应条件下15天苗根Fe的含量。
具体实施例方式下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。从浙江大学植物生理学与生物化学国家重点实验室发展的 EMS(ethylmethylsulfonate)诱变的籼稻(Oryza Sativa L. ssp indica)地方品种 Kasalath突变体库中筛选到一个水稻不定根及侧根长缺陷突变体Ossprl，该突变体是一 个符合单基因控制遗传规律的隐性突变体。为了分离OsSPRl基因，本发明采用基因图位克隆方法。首先创建了一个F2定位群体，由Ossprl突变体为母本，野生型粳稻Nipponbare为父本杂交获得的F2中的隐性个体组 成。并利用SSR(Simple Sequence Repeats)分子标记对OsSPRl位点进行初步定位。定位 结果表明，OsSPRl初步定位在第1染色体介于RM5759和RM13619两个标记之间。通过对 两个标记之间的BAC序列分析，发展新的STS (Sequence Tagged Site)标记，将OsSPRl精 确定位于BAC P0506A10上STSl和STS2标记之间，该区间有18. Ikb大小(图1中A)，根 据水稻基因注释信息，该区间有2个未知基因。突变体和野生型中2个基因的ORF测序结 果表明，在突变体中，其中一个基因的ORF (L0C_0s01 g67290)发生了一个单碱基突变在ORF 的2533bp处C变为T，出现提前终止密码子，造成氨基末端136个氨基酸的缺失。接着我 们对另外两个相似表型的突变体进行该基因的序列测定，结果也表明它们分别在该基因的 1684bp处由A变为T及250bp处由A变为T都分别造成提前终止密码子。生物信息学分析表明OsSPRl蛋白的1-29氨基酸为线粒体定位信号肽，为了观察 OsSPRl的亚细胞定位情况，将OsSPRl氨基端108个氨基酸按通读框架构建到35S_sGFP表 达载体内，用洋葱的瞬时表达系统来观察蛋白的亚细胞定位。提取该融合表达载体质粒及 AOX融合RFP的质粒，用金粉分别包裹，进行基因枪轰击洋葱表皮细胞实验。轰击后于暗环 境下培养1天后，用激光共聚焦显微镜观察。结果发现，和AOX融合RFP的对照载体一样， OsSPRl融合GFP的绿色荧光分布于线粒体中，两者的表达部位吻合的很好(图2)。表明 OsSPRl为线粒体定位蛋白。为了进一步证明突变体突变表型是由OsSPRl的突变引起的，对突变体进行了转 基因回复验证。将由35S启动子驱动的完整的OsSPRl ORF(SEQ ID NO=D克隆到双元植物 转基因载体PCAMBIA1300改中。将构建好的回复载体通过农杆菌介导转化突变体愈伤，进 行诱导。TO的转基因苗直接观察不定根、侧根的情况。结果表明，转化了正常OsSPRl基因 的突变体的不定根、侧根长度回复到Kasalath野生型的长度(表1)。而且地上部铁含量也 回复到野生型的水平，在Fe (II)条件下根中铁的含量比野生型要高。抽提Kasalath野生 型、突变体Ossprl和两个回复表型明显的转基因株系的叶片的RNA，逆转录成cDNA。半定 量RT-PCR结果表明，根毛得到回复的转基因阳性植株的确超表达了 OsSPRl基因。Southern 杂交检测证明这两个回复株系为独立的转基因株系。上述结果证明了该突变体的确是由于 OsSPRl的突变引起的，表明本发明获得了使突变体恢复正常功能的转基因水稻。由这些结果表明，我们克隆的水稻OsSPRl基因具有调控植物根系生长发育及叶 片组织中铁含量的作用，有较高的应用价值。我们可以通过利用该基因来调控根系的生长 发育，从而提高根系吸收水分和各种养分的能力，进而提高作物的耐旱性和产量。此外还可 以利用该基因来调控植物体的铁的分布，从而提高粮食作物的铁含量。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明范围。实施例1、突变体的筛选和表型以EMS诱变的Kasalath突变体库为突变体筛选对象，M2种子用蒸馏水冲洗干净， 0.6%稀HNO3破休眠处理16hr，37°C暗处催芽至露白。将露白的种子播于水稻培养液(培 养液配方为国际水稻所标准配方)上浮着的尼龙网纱上面，在温度为30/22°C (昼/夜) 左右、光照12小时条件下，培养7天，以根构型(不定根长，侧根长，不定根数，侧根数等) 的改变为筛选标准进行突变体的筛选，从中筛选到一个不定根侧根皆短的突变体。该突变体的地上部长度与野生型之间没有显著性差异，主根长度稍短，但不定根长及侧根长则 显著受到抑制(表1)。为了进一步观察突变体与野生型的之间的差异，我们将突变体和 野生型分别在供应不同形态铁培养条件下培养15天，结果发现突变体在Fe (III)条件下 明显比野生型要黄，类似于缺铁的症状。进一步用ICP-MS(inductively coupled plasma massspectrometry)测定根中及叶片中的铁表明突变体叶片中铁含量明显比野生要低，而 在3价铁条件下则更低(图2)。表1. 7天苗株高及主要根参数 *指突变体(sprl)和野生型(WT)间有显著性差异(t测验，P < 0. 01), OV为SPRl 回复转基因株系。实施例2、基因定位F2定位群体是由纯合体(OsSrai)和粳稻品种Nipponbare杂交获得的，总共鉴定 出1511个不定根、侧根长缺陷表型的F2个体，采用水稻微量DNA的快速提取方法从水稻叶 片中提取用于基因定位的基因组DNA。取大约0. Ig水稻幼嫩叶片，经液氮冷冻，在1. 5ml的 离心管中将叶片磨成粉末，提取总DNA，获得的DNA溶解于200 μ 1无菌水中。每个SSR和 STS反应用2μ 1 DNA样品。在OsSPRl基因的初步定位试验中，对100个F2个体进行SSR分析。根据公布的粳 稻和籼稻创建的分子遗传图谱，选取近似均勻分布于各条染色体上的SSR引物，根据已知 的反应条件进行PCR扩增，然后在7%的丙烯酰胺凝胶电泳分离，检测PCR产物的多态性。在精细定位OsSPRl基因时，对由1511 F2个体组成的群体进行STS分析。根 据分子标记RM5759和RM13619之间的BAC序列和公布的kasalath BAC术端序列， 我们设计了 2个STS分子标记(STS1，STS2)，1个CAPS标记(CAPSl)，引物序列为 STS1U-5' CGTATAAAGGGAATCGAACC 3', STS1L-5' CTTTTGGCTCAATGGAATATGTAT 3', STS2U-5' GCGTGGGAATCCGTTACTG 3', STS2L-5‘ GCTCCAATTTATCTATAGCCAATC 3', CAPS1U-5' CCCATATTGTCCAGATCCATAA 3，，CAPS1L-5' GAGGAGCACAAATACAAATACACC 3'利用 这3个分子标记对1511 F2个体进行连锁分析。实施例3、基因预测和序列分析根据精细定位的结果，Ossprl基因位于BAC克隆P0506A10上STSl和STS2标记之 间的 18. Ikb 范围之内(图 1 中 A)。根据 TIGR (http://www. tigr. org/tdb/e2kl/osal/)的 水稻基因注释信息和EST数据库(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)，对定位的染色体区段 内基因预测分析，该区间有2个未知基因。用Kasalath野生型和OsSPRl突变体根的cDNA为模板对两个基因进行扩增，扩增产物分别测序，测序结果进行比对分析。在突变体中，其 中一个基因的ORF(LOC 0s01g67290)发生了一个单碱基突变在基因的2533bp处C变为T， 出现提前终止密码子，造成氨基酸末端136个氨基酸的缺失。接着我们对另外两个相似表 型的突变体进行该基因的序列测定，结果也表明它们分别在该基因的1684bp处由A变为T 及250bp处由A变为T都造成提前终止密码子(图1中B)。因此，得到=OsSPRl基因具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，其编码的蛋白质具 有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。实施例4、突变体中OsSPRl基因的功能互补验证。根据OsSPRl 基因的 ORF 序列，设计引物如下F5，ggatccAGAAGATGGGGGTGATGT 3' ；R 5’ ggatccCTATCGCCCAGCAGCTCT 3，。以籼稻 Kasalath 的根部 cDNA 为模板，扩增出 OsSPRl基因的编码区，与pUCm-T连接，连接产物热激转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞。测序 确定序列正确后继续以下操作。T-OsSPRl用BamHI酶切，连入用BamHI酶切的pCAMBIA1300 改载体中，连接产物热激转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞。酶切检测正确方向插入后备用。 PCAMBIA1300改为本实验室改造载体，该载体是以pCAMBIA_1300载体(该载体购自Cambia 公司)为基本骨架，在多克隆位点插入35S启动子和Nos终止子而得到的增强表达载体 (图2)。将得到的正确克隆的质粒通过农杆菌株系EHA105介导的水稻遗传转化体系导入 到突变体Ossprl中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、 练苗移栽，得到转基因植株。农杆菌(EHA105)介导的水稻遗传转化体系主要应用Hiei等 人(1994)报道的方法基础上进行优化。为了检测不定根侧根长得到回复的转基因阳性植株是否超表达了 OsSPRl基因， 采用Trizol法分别提取Kasalath和2个转基因回复株系叶片的总RNA(我们构建的回复载 体为CaMV 35S组成型表达启动子，如果为转基因阳性植株，那么原本不表达的地上部也会 超表达Ossprl基因)，逆转录成cDNA。半定量反应时，各样品的cDNA模板量先通过OsActin 基因的表达量调成一致(扩增条件58°C，26个循环)，再扩增目的基因。目的基因的引物 同上面的ORF引物，扩增条件为68°C，30个循环。半定量RT-PCR结果如图3C。为了检测这两个回复的转基因株系是不是独立株系，进行了 Southern杂交检测， 剪取叶片按CTAB法提取总DNA，分别用HindIII酶切后，进行0. 8%琼脂糖凝胶电泳，转移 到尼龙膜上，用600bp潮霉素基因片段作为探针，使用Roche公司的DIG High Prime DNA Labelingand Detection Starter Kit II试剂盒进行探针的标记和杂交检测。实施例5、OsSPRl的线粒体定位实验设计如下引物来扩增包含有OsSPRIN端108氨基酸序列， 5-RRRRtaccAGAAGATGGGGGTGATGTC 和 5~cRRRatccGATCCTTGCATGAACACAGAA 以野生型的 cDNA 为模板，扩增SLRl蛋白的N端序列，长度为324bp，其中下划线部分分别为BamHI和KpnI酶 切位点。经BamHI和KpnI双酶切后，连入同样酶切的35S_sGFP载体中(35S_sGFP为实验 室在PCAMBIA1300的多克隆位点引入35S-MCS-sGFP_N0S表达盒所构建的sGFP表达载体)， 转化DH5ci。所得阳性克隆经测序确定正确。提取构建好的质粒及AOX-RFP融合的线粒体定定位质粒各2g用金粉包裹，用 Bio-rad公司的PDS-1000/He型基因枪进行轰击，采用IlOOpsi的氦压轰击洋葱表皮。轰击 后于暗培养1天后，用激光共聚焦显微镜观察。结果说明=OsSPRl为线粒体定位蛋白。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发 明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容 直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
一种水稻根长发育控制基因OsSPR1编码的蛋白质，其特征在于，具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，还包括下述氨基酸序列，该氨基酸序列 是在SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸生成的衍 生物。
3.一种编码权利要求1所述蛋白质的基因，其特征在于，该基因具有SEQ ID N0:1所 示的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于，还包括下述核苷酸序列，该核苷酸序列是 在SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸生成的突变 体、等位基因或衍生物。
全文摘要
本发明涉及植物基因工程领域，旨在提供一种水稻根长发育控制基因OsSPR1编码的蛋白质，以及编码该蛋白质的基因。该蛋白质具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，该基因具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。本发明利用一个短不定根及短侧根水稻突变体为研究材料，确定该基因参与调控水稻根长的发育。该基因的功能缺失突变体表现为叶片铁含量减少，根中铁的含量和野生型是一致的。而恢复该基因的表达则能恢复叶片中铁的含量。表明该基因能调控叶片中铁的含量。本发明提供了水稻根系生长发育以及铁离子体内转运的分子调控机制，并为通过基因工程手段调控水稻根系结构及铁的含量提供了基础。
文档编号A01H5/00GK101891808SQ20101012722
公开日2010年11月24日 申请日期2010年3月18日 优先权日2010年3月18日
发明者吴平, 吴忠长, 毛传澡, 贾立强, 陈婕妤 申请人:浙江大学