一种植物衰老特异性启动子及其应用的制作方法

专利名称：一种植物衰老特异性启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种植物衰老特异性启动子及其应用。
背景技术：
启动子是指基因中一段能准确有效起始基因转录的DNA序列，通常位于基因上游。启动子是基因表达调控的重要元件，它与RNA聚合酶及其他蛋白辅助因子等反式作用因子(转录因子)相互作用来调控基因转录的水平及其时空表达的特异性。目前使用最广泛的组成型启动子是烟草花叶病毒(CaMV)35S启动子。同时， 人们高度重视从植物本身克隆组成型启动子并初见成效，肌动蛋白(Actin)和泛素 (Ubiquitin)等基因的启动子已被克隆。Mariani等成功地利用烟草花药绒毡层特异表达基因启动子TA^驱动核酸酶Barnase、RnaseTl基因在花药中特异表达，破坏绒毡层，获得雄性不育油菜，这是首次通过基因工程创造出雄性不育系。小麦叶中表达ipt基因，提高细胞分裂素含量，可使叶绿素降解减缓，叶衰老变慢。目前植物转基因技术通常使用的是组成型表达启动子，例如花椰菜花叶病毒CaMV 35S启动子。但组成型启动子调控的基因在植物发育各个时期和组织都是持续高效表达的， 没有时空的特异性，对于植物来说不但是一种不必要的资源浪费，不利于植物的健康发育， 而且一些本来是可能改变农艺性状的基因如果在不必要的部位和时期表达，反而可能会对植物的生长发育带来一定的毒害作用。综上，有必要开发新的具有特定功能的启动子，以有效地、准确地改变植物的农艺性状，实现植物的品种改良。

发明内容
本发明的目的在于提供一种植物衰老特异性启动子及其应用。在本发明的第一方面，提供一种分离的植物(如植物的叶片)衰老特异性启动子， 所述的启动子(a)位于脱镁叶绿酸氧化酶编码基因的5’端及其上游；(b)碱基长度为500-3000个；(c)具有引发转录的必要位点及转录起始点；且(d)具有响应植物衰老信号并启动目的基因特异性表达功能。在一个优选例中，所述的脱镁叶绿酸氧化酶来源于拟南芥 (Arabidopsisthaliana) 0在另一优选例中，(a)中，位于脱镁叶绿酸氧化酶基因上游1800至编码区第200 位。较佳地，位于脱镁叶绿酸氧化酶上游-2000至编码区第200位；更佳地，位于脱镁叶绿酸氧化酶上游-1907至编码区第186位。在另一优选例中，所述的启动子含有TATA-盒结构。
在另一优选例中，所述的植物是十字花科植物。在另一优选例中，所述的植物是拟南芥。在另一优选例中，所述的启动子是(I)SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列的启动子；(2)核苷酸序列与SEQ ID NO 1有95%以上相同性且具有响应植物衰老信号并启动目的基因特异性表达功能的启动子；或(3)核苷酸序列与SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列完全互补的启动子。在本发明的另一方面，提供一种载体，所述的载体含有所述的启动子。在另一优选例中，所述的载体还含有与所述的启动子可操作地连接的目的基因。在本发明的另一优选例中，所述的目的基因是结构基因。在本发明的另一优选例中，所述的目的基因可编码具有特定功能的蛋白。在本发明的另一优选例中，所述的目的基因是外源基因。在本发明的另一优选例中，所述的目的基因包括(但不限于)β_葡萄糖苷酶 (GUS)基因，细胞分裂分化相关基因(包括细胞分裂素等)、生长素代谢途径相关基因(包括生长素合成和降解相关基因，生长素转运基因等)，营养运输相关基因(如异戊烯基转移酶基因)，改善植物品质或性状或表型相关的基因(如人乳铁蛋白基因、赖氨酸合成酶基因、beta胡萝卜素合成基因、直链与支链淀粉合成酶基因等)、以及种子中激素合成相关基因等。在本发明的另一优选例中，所述的目的基因位于所述启动子的下游，且与所述启动子区直接邻近的编码基因的序列。通常，所述启动子与目的基因的间隔小于IOOObp(优选的，小于500bp ；更优选的，小于IOObp ；最优选的，小于50bp)。在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，所述的细胞含有所述的载体；或其基因组中整合有外源的所述的启动子。在本发明的另一方面，提供一种使目的基因在植物衰老进程中表达的方法，所述的方法包括将构建物转化植物细胞，所述的构建物含有所述的启动子以及与所述的启动子可操作地连接的目的基因；筛选出转入了所述构建物或染色体中整合有所述构建物的植物细胞；和将所述植物细胞再生成植株，所述植物中目的基因在植物衰老进程中表达。在另一优选例中，所述的方法包括(a)提供携带表达载体的农杆菌，所述表达载体中含有构建物，所述的构建物含有所述的启动子以及与所述的启动子可操作地连接的目的基因；(b)将植物细胞、组织或器官(如花器官)与步骤(a)中的农杆菌接触，从而使所述的构建物转入植物细胞、组织或器官；(c)选择出转入了所述构建物的植物细胞、组织或器官；以及(d)将步骤(C)中的植物细胞、组织或器官再生成植物，所述植物中目的基因在植物衰老进程中表达。在本发明的另一方面，提供所述的启动子的用途，所述的启动子用于响应植物衰老信号并启动目的基因在植物衰老进程中表达。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。


图1显示了在暗诱导条件下，AtPaO基因的表达量随暗诱导天数增加的变化情况。图2显示了转基因植株自然衰老调节下⑶S染色结果。其中，A、转基因植株的俯视图，可观察到子叶和真叶。B、拟南芥各叶片的衰老情况。从左至右为拟南芥全部莲座叶，包括2片子叶、第
1片真叶，第2片真叶，第3片真叶......第10片真叶。可观察到最左边的叶子最黄，沿
着从左至右的方向叶子越来越绿，也即最左边的叶子衰老程度最高，沿着从左至右的方向叶子衰老程度递减。C和D、⑶S染色结果显示拟南芥各莲座叶的⑶S表达情况。可观察到，最左边的叶子蓝色最深，沿着从左至右的方向，蓝色由深到浅。图3显示了转基因植株自然衰老调节下⑶S染色结果。A、拟南芥各叶片的衰老部位。从左至右为拟南芥的部分莲座叶，依次包括第1、 3、5、7、9、11、13片莲座叶。可观察到最先开始开衰老的部位为叶尖及叶边缘，如箭头所
7J\ οB、⑶S染色结果显示拟南芥各莲座叶的⑶S表达情况。可观察到叶尖及叶边缘最先观察到被GUS染液染成蓝色。图4显示了暗诱导下，叶片GUS染色结果。可观察到暗处理0天的叶片染色不明显，而暗诱导2天后开始在叶片边缘可观察到GUS染色，4天叶片大部分部位开始观察到 ⑶S基因表达。
具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，首次分离到一个能够响应植物衰老信号，并调节目的基因特异性高表达的启动子。所述的启动子对于在植物衰老进程中调节目的基因的表达以改变植物性状、状态或衰老进程是非常有用的。在此基础上完成了本发明。术语如本文所用，所述的“植物”没有特别的限制，包括(但不限于)水果植物、蔬菜植物、农作物等。水果植物例如但不限于柑橘科、蔷薇科、葫芦科、芭蕉科的植物等。蔬菜植物例如但不限于菊科，茄科，唇形科，伞形科，十字花科(如拟南芥)的植物。农作物例如但不限于禾本科、石蒜科的植物等。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。如本文所用，所述的“可操作地连接”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。如本文所用，所述的“启动子”或“启动子区(域)”是指一种核酸序列，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’端)，能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地，启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。在本文中，所述的启动子或启动子区包括启动子的变体，其通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。如本文所用，术语“特异性表达”是指目的基因在特定的时间和/或特定的组织表达。所述的“衰老特异性启动子”是指在这类启动子调控下，目的基因在植物衰老的进程中表达。如本文所用，“外源的”或“异源的”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的，则启动子对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。如本文所用，“顺式调控元件”是指对基因的转录起始和转录效率起调节作用的保守性碱基序列。如本文所用，“目的基因”是指可由本发明的启动子启动或指导表达的基因。合适的目的基因包括但不限于改良植物品质、性状或代谢相关的基因。合适的目的基因包括但不限于β-葡萄糖苷酶(GUQ基因，细胞分裂分化相关基因(包括细胞分裂素等)、生长素代谢途径相关基因(包括生长素合成和降解相关基因，生长素转运基因等)，营养运输相关基因(如异戊烯基转移酶基因)，改善植物品质或性状或表型相关的基因(如人乳铁蛋白基因、赖氨酸合成酶基因、beta胡萝卜素合成基因、直链与支链淀粉合成酶基因等)、以及种子中激素合成相关基因等。如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......构
成”、“基本上由......构成”、和“由......构成”；“主要由......构成”、“基本上
由......构成”和“由......构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。如本文所用，所述的植物“衰老进程”包括了 “自然衰老进程”和“诱导(或人工)
衰老进程”。所述的“自然衰老进程”是指植物在生长发育过程中自行启动的衰老过程。例如， 拟南芥的莲座叶不是同时衰老的，而是按叶龄先后逐步衰老的，从子叶开始衰老然后是第1
片真叶，第2片真叶......到第10片真叶。植物衰老过程可以通过对植物的表观观察而
得知，例如大多数植物(如拟南芥等)的叶子由绿变黄代表了叶子发生衰老，黄色越明显则衰老程度越高。所述的“诱导(或人工)衰老进程”是指外界条件或认为干扰植物的生长发育进程，创造植物发生衰老的氛围或环境。例如，改变植物的生长环境，使得植物在黑暗条件下生长，则植物会在黑暗的诱导下启动衰老进程，并随着诱导时间的增加衰老进程也增加。启动子本发明提供一种植物衰老特异性启动子，所述的启动子具有以下特点(a)位于脱镁叶绿酸氧化酶基因(在拟南芥中称为AtfaO)的上游(较佳地位于脱镁叶绿酸氧化酶上游-2800至编码区第200位)；(b)具有响应植物衰老信号并启动目的基因特异性表达功能；(c)具有引发转录的必要位点及转录起始点；且(d)碱基长度为500-3000个。作为本发明的一种实施方式，所述的启动子具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列的启动子。多核苷酸的杂交是本领域技术人员熟知的技术，特定的一对核酸的杂交特性指示它们的相似性或同一性。因此，本发明还涉及与前述指定的核苷酸序列杂交且两个序列之间具有至少50%，较佳地至少70%，更佳地至少80% (例如85%、90%、95%、96%、97%、 98%、或99%)相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。“严格条件”(或“严紧条件”)是指(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0. 2XSSC，0. 1%SDS，60°C;或⑵杂交时加有变性剂，如50% (ν/ν)甲酰胺，0. 小牛血清/0. 1% Ficoll，42°C等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在50%，优选60% 以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上或90%以上，更优选是95%以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸也具有响应植物衰老信号的功能。本发明还包括与本发明的任一种启动子序列具有50%或以上(优选60%以上， 70%以上，80%以上，更优选90%以上，最优选95%以上，如98%、99% )相同性的核酸，所述核酸也具有响应植物衰老信号并启动目的基因特异性表达功能。“相同性”是指按照位置相同的百分比，两条或多条核酸之间的相似水平(即序列同源性、相似性或同一性)。应理解，尽管本发明的实例中提供了来源于拟南芥的该启动子及其功能，然而，来源于其它类似的植物的与该启动子具有一定相同性(保守性)的启动子也包括在本发明的范围内，只要本领域技术人员在阅读了本申请后根据本申请提供的信息可以方便地从其它植物中分离得到该启动子。启动目的基因表达本发明的启动子可以被可操作地连接到目的基因上，该目的基因相对于启动子而言可以是外源(异源)的。对所述目的基因的核酸序列没有特别的限制(如一种结构性核酸序列)，所述的目的基因优选编码具有特定功能的蛋白，例如某些在农业或植物改良上具有重要特性或功能的蛋白。本发明的启动子还可以被可操作地连接到被改进的目的基因序列上，该目的基因相对于启动子是外源(异源)的。所述的目的基因可以被改进来产生各种期望的特性。例如，目的基因可以被改进来增加必需氨基酸的含量，提高氨基酸序列的翻译，改变翻译后的修饰(如磷酸化位点)，将翻译产物转运到细胞外，改善蛋白的稳定性，插入或删除细胞信5寸。此外，启动子和目的基因可以设计成下调特定基因。这一般是通过将启动子连接到目的基因序列上来实现，该序列以反义反向被引导。本领域的普通技术人员熟悉这种反义技术。任何核酸序列可以以这种方式被调节。任何一种前述的启动子和/或目的基因序列可被包含在重组载体中。作为一种方式，所述的重组载体包括本发明的启动子，在所述启动子的下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。当需要表达目的基因时，将目的基因连接入适合的多克隆位点或酶切位点内，从而将目的基因与启动子可操作地连接。作为另一种方式，所述的重组载体包括(从5’到3’方向)启动子，和目的基因。 如果需要，所述的重组载体还可以包括3’转录终止子，3’多聚核苷酸化信号，其它非翻译核酸序列，转运和靶向核酸序列、抗性选择标记、增强子或操作子。
用于制备重组载体的方法是本领域熟知的。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被采用的。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含有本发明所述的启动子和/或目的基因序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。 表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及绿色荧光蛋白 (GFP)等。重组载体中除了含有本发明的启动子，还可含有一种或多种其它启动子。所述的其它启动子例如是组织特异性的、组成型的或诱导型的。例如甘露氨酸合成酶的花椰菜花叶病毒 19S 和!35S(CaMV19S CaMV35S)、增强的 CaMV、烟草 RB7 等。包含上述适当的启动子和目的基因的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母； 植物细胞等。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理， 所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。作为一种方式，制备转基因植物的方法是将携带启动子和目的基因(两者可操作地连接)的载体转入农杆菌，农杆菌再将含启动子和目的基因的载体片段整合到植物的染色体上。涉及的转基因受体植物例如是拟南芥、烟草、果树等。在本发明的实例中，所述的重组载体是PBI101双元载体，其自带β -葡萄糖苷酶 (GUS)基因，将本发明的启动子构建到该载体中GUS基因的上游，转化植株，启动子将激活 GUS基因的表达，所述启动受到启动子区各顺式作用元件的调控，模拟了基因在体内被激活转录的状况。在本发明的实例中，本发明人发现，在所述的启动子的启动或指导下，可以使GUS 基因特异地在植物衰老进程中表达。因此可见，本发明的启动子是一种响应衰老信号并在接受信号后启动目的基因发生表达的启动子。所述的启动子对于在植物衰老进程中改良植物的品质是特别有用的。葡萄糖苷酶(GUS)能催化裂解一系列的葡萄糖苷，产生具有发色团或荧光的物质，可用分光光度计、荧光计或组织化学等方法对GUS活性进行定量和空间定位分析。在本技术领域中，GUS基因已被广泛地用作转基因植物、细菌和真菌的报告基因，特别是其可被用于研究外源基因表达的具体细胞和组织部位。应用
本发明的衰老特异性启动子在理论研究和农艺改良中具有重要的应用价值。本发明可广泛应用于植物基因工程启动子作为植物基因工程中一个重要工具可与目标基因融合，通过转基因载体，转化植物并获得转基因植株。随着植物年龄的增长，该启动子便会启动下游目标基因(可以是感兴趣的任何可以改变农艺性状的功能基因)的表达，并随着衰老进程逐步提高该基因的表达量，从而达到在衰老阶段人为控制某一功能基因表达量的目的。在农作物生产上，某些作物叶片易发生过早衰老，使植株整体光合作用水平下降， 光合产物减少，导致作物产量低、品质差。如某些杂交水稻在发育后期叶片和功能的早衰导致结实率低，空秕率高，严重影响了杂交稻产量潜力的进一步发挥。该启动子可与抑制衰老的相关基因融合(如细胞分裂素、生长素代谢途径上的基因，外源异戊烯基转移酶(ipt) 等)，转化植物，提供延衰基因随着衰老进程的正调控，从而延缓植物的衰老过程。可广泛应用于蔬菜保鲜及赏叶植物的延衰。另外，本发明中提供了该启动子的载体构建方法，并在植物体中证实在衰老信号诱导下该启动子调控下游GUS基因表达的可行性。为进一步研究该启动子及衰老现象提供了基石出。本发明的主要优点在于(1)本发明的启动子属于特异型启动子。它在自然衰老过程中，响应衰老信号，才启动下游基因表达，而在未开始衰老的阶段和器官表达量很低，既能使外源基因在植物体内有效发挥作用，同时又减少对植物的不利影响，利用衰老特异性启动子调控基因表达是个很好的途径。(2)由于衰老特异性，本发明的启动子可用于衰老相关的研究，在延迟植物衰老方面提供广泛的应用。(3)本发明的启动子具有响应迅速，且随着衰老进程功能加强的特性。即植物越衰老，该启动子调控的下游基因表达量越高。(4)该基因也可在黑暗诱导的离体叶片中驱动下游基因表达。随着暗诱导时间的延长，表达量有明显提高。该特点可用于蔬菜的离体储藏。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人，分子克隆实验室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。I.材料和方法1启动子克隆及载体构建以拟南芥基因组DNA为模板，设计正向引物Atfa0_GUS_FP2’ 5，CTCGAGTTGTTGCGGTGGTC 3，和反向引物 AtPa0_GUS_RP2 :5，CGTCGAATCCGAAGTGGGTA 3，， 通过PCR的方法扩增出At3g44880起始密码子ATG上游约21Λ的DNA片段。
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将扩增的启动子序列连接载体pMD19-T Vector (购自TAKARA)，再将连接到 PMD19-T Vector上的启动子片段和含有⑶S报告基因载体ρΒΙΙΟΙ. 3分别用限制性内切酶 Xhol+Xbal和Ml I+Xbal进行酶切。回收酶切产物用T4 DNA连接酶连接。2转基因植物的获得将构建好的载体转化农杆菌菌株C58(获自加州大学)。转基因植物的获得通过常规的花浸法。在含50ug/ml卡那霉素的MS培养基上筛选转基因植株。3⑶S组织化学染色将转基因植物的不同处理的叶片取下，放在离心管中，加入适量的⑶S染色液于 37°C保温过夜，用70%的乙醇脱色2-3次，到对照材料显现白色为止。肉眼或显微镜下观察 ⑶S表达部位(蓝色即为⑶S表达部位)，并通过照相记录染色结果。II.实施例实施例1、启动子的扩增、克隆和序列分析以拟南芥基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到一个约2093bp的DNA扩增产物， 连接到pMD 19-T Vector上，经测序，结果正确。启动子的全序列如SEQ ID N0:1所示。在拟南芥中该序列为叶绿素降解途径关键酶AtPaO的启动子。因此，通过常规的 Realtime PCR方法，检测AtPaO在暗诱导条件下的表达情况。结果发现，在暗诱导条件下，AtPaO基因的表达量随暗诱导天数增长上调，见图1。 因此，可见AtPaO基因的启动子为衰老特异性启动子。实施例2、启动子植物表达载体的构建先用Xhol I和BamH I双酶切回收2Kb的启动子序列，再用Ml I和BamHI双酶切pBI 101.3(购自Takara)，回收大片段，回收的两片段连接，转化大肠杆菌，抽提质粒并进行酶切鉴定，启动子正确连入载体ρΒΙΙΟΙ. 3，获得ρΒΙΙΟΙ. 3-Promoter-GUS。用电击转化法将重组载体ρΒΙΙΟΙ. 3-Promoter-GUS转化到农杆菌C58中，经PCR 扩增，在的琼脂糖凝胶电泳鉴定有约2Kb条带，证明ρΒΙΙΟΙ. 3-Promoter-GUS载体已经转入农杆菌C58中。实施例3、转基因植株的获得应用农杆菌介导的遗传转化得了 10个转基因植株，PCR鉴定，结果表明大多数株系均能产生大小约为2Kb的片段，证明与GUS基因融合的启动子片段已整合入拟南芥基因组中。经过GUS组织化学染色分析，发现有6个株系携带启动子与GUS嵌合基因，在卡那霉素抗性筛选条件下获得的这些植株均能正常生长。实施例4、转基因植株自然衰老调节下⑶S染色结果已构建的该启动子与报告基因GUS融合载体，转化拟南芥，获得转化植株6个株系，在自然衰老条件下进行GUS染色结果表明幼嫩的叶片中，染色很浅，甚至没有；而随着叶龄的增长染色越来越深。如图2所示，从左至右为拟南芥全部莲座叶包括2片子叶、第1
片真叶，第2片真叶，第3片真叶......第10片真叶，⑶S染色结果也呈现由浅到深的变
化趋势。现有技术已知，拟南芥的莲座叶不是同时衰老的，而是按叶龄先后逐步衰老的，从子叶开始衰老然后是第ι片真叶，第2片真叶......到第10片真叶。
如图3所示在开始自然衰老的叶片中，发黄的叶片比仍是绿色的叶片GUS染色要深；而同一片叶，最先开始开衰老的部位为叶尖及叶边缘，这些部位最先观察到被⑶S染液染成蓝色，即使叶片还尚未出现肉眼可观察的明显的变黄迹象。以上现象也进一步说明该启动子响应衰老信号的灵敏性。实施例5、暗诱导下，叶片⑶S染色结果黑暗作为叶片衰老的启动调节，用黑暗诱导离体叶片也可以提高该启动子下游 ⑶S基因的表达。将拟南芥植株置于黑暗环境中，结果如图4，用黑暗处理21天的转基因植物叶片， 并进行GUS染色分析发现，暗处理0天的叶片染色不明显，而暗诱导2天后开始在叶片边缘可观察到GUS染色，4天叶片大部分部位开始观察到GUS基因表达。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种分离的植物衰老特异性启动子，其特征在于，所述的启动子(a)位于脱镁叶绿酸氧化酶编码基因的5’端及其上游；(b)碱基长度为500-3000个；(c)具有引发转录的必要位点及转录起始点；且(d)具有响应植物衰老信号并启动目的基因特异性表达功能。
2.如权利要求1所述的启动子，其特征在于，所述的脱镁叶绿酸氧化酶来源于拟南芥。
3.如权利要求1所述的启动子，其特征在于，(a)中，位于脱镁叶绿酸氧化酶基因上游-2800至编码区第200位。
4.如权利要求1任一所述的启动子，其特征在于，所述的启动子是(1)SEQID NO 1所示的核苷酸序列的启动子；(2)核苷酸序列与SEQID NO :1有95%以上相同性且具有响应植物衰老信号并启动目的基因特异性表达功能的启动子；或(3)核苷酸序列与SEQID NO :1所示的核苷酸序列完全互补的启动子。
5.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求1-4任一所述的启动子。
6.如权利要求5所述的载体，其特征在于，所述的载体还含有与所述的启动子可操作地连接的目的基因。
7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述的细胞 含有权利要求6所述的载体；或其基因组中整合有外源的权利要求1所述的启动子。
8.一种使目的基因在植物衰老进程中表达的方法，其特征在于，所述的方法包括 将构建物转化植物细胞，所述的构建物含有权利要求1-4任一所述的启动子以及与所述的启动子可操作地连接的目的基因；筛选出转入了所述构建物或染色体中整合有所述构建物的植物细胞；和将所述植物细胞再生成植株，所述植物中目的基因在植物衰老进程中表达。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的方法包括(a)提供携带表达载体的农杆菌，所述表达载体中含有构建物，所述的构建物含有权利要求1所述的启动子以及与所述的启动子可操作地连接的目的基因；(b)将植物细胞、组织或器官与步骤(a)中的农杆菌接触，从而使所述的构建物转入植物细胞、组织或器官；(c)选择出转入了所述构建物的植物细胞、组织或器官；以及(d)将步骤(c)中的植物细胞、组织或器官再生成植物，所述植物中目的基因在植物衰老进程中表达。
10.权利要求1-4任一所述的启动子的用途，其特征在于，所述的启动子用于响应植物衰老信号并启动目的基因在植物衰老进程中表达。
全文摘要
本发明涉及一种植物衰老特异性启动子及其应用。本发明首次分离到一个能够响应植物衰老信号并调节目的基因特异性高表达的启动子。所述的启动子对于在植物衰老进程中调节目的基因的表达以改变植物性状、状态或衰老进程是非常有用的。
文档编号A01H5/00GK102268433SQ201010190818
公开日2011年12月7日 申请日期2010年6月1日 优先权日2010年6月1日
发明者刘芳, 郭房庆 申请人:中国科学院上海生命科学研究院