专利名称：猕猴属灵长类动物精液超低温冷冻保存方法
技术领域：
本发明属于动物繁殖的方法，特别涉及灵长类动物精子保存方法。
技术背景 自从英国生物学家Polge等用甘油作为防冻剂冷冻保存精子以来，应用冷冻精子 进行体外受精和人工授精被广泛应用于人类不育不孕症的治疗和家畜动物的繁殖育种，也 为珍稀濒危动物遗传多样性保护提供了一条途径。猕猴属灵长类动物，如猕猴、食蟹猴、熊 猴、藏酋猴等是人类的近亲，在组织结构，生理生化、免疫和代谢等方面与人类高度相似，是 建立病毒等传染性疾病模型、精神神经性疾病模型、心血管疾病模型、肿瘤模型和生殖生理 等研究的最佳实验动物。随着世界上第一只携带绿色荧光蛋白的转基因猕猴和亨廷顿舞蹈 病转基因猕猴的诞生，应用灵长类动物模型研究和治疗人类重大功能性疾病成为一个非常 热门和重要的研究领域。猕猴属各灵长类物种被列为国家一、二级保护珍稀濒危动物，但一 方面，人类受到各种重大功能性疑难疾病不断困扰，迫切需要大量猕猴动物用于自然科学 研究和解决人类健康问题，另一方面，随着持续破坏所导致的环境恶化，野生灵长类动物野 外生存条件丧失使其繁殖能力下降。依据现代生殖生物理论，一个雄性动物的精子可以获 得成千上万个后代个体，因此，高效保存动物精子能显著降低保养活体动物个体和种群的 高额负担，缩短繁殖周期，提高生产效率。相对于人类和家畜动物，猕猴属灵长类动物精子在冷冻过程中对温度和冷冻条件 的变化非常脆弱和敏感，冷冻精子的运动能力、精子质膜和顶体的完整率急剧下降，精子存 活时间缩短、体外受精的受精率和人工授精的受孕率及产仔率低下。提高灵长类动物冷冻 保存精子的复苏运动度、质膜和顶体的完整率、存活时间及受精能力的关键是防冻液的研 制和冷冻降温程序的设计。甘油是动物精子冷冻保存最常用的渗透性防冻剂，甘油可渗入细胞，取代细胞内 的水分子，引起细胞脱水，减少冷冻过程中胞内冰晶的形成；甘油可与质膜磷脂的亲水基团 形成静电结合，起到膜稳定剂的作用。甘油的浓度是影响精子冷冻的重要参数，浓度太低达 不到冷冻保护的目的，浓度过高会导致精子指标下降，而且，不同物种的精子对甘油的耐受 能力不同，如袋鼠精子冷冻时甘油的浓度高达10-20%，猪精子甘油浓度超过3%会因顶体 受到的损伤而失去受精能力，牛精子通常使用4-8%的甘油，因而，不同物种必需选择该物 种最适甘油浓度。糖类物质是用于精子冷冻保存的非渗透性防冻剂，除了调节渗透压，使细胞脱水， 减少胞内冰晶的形成以及糖的羟基基团与精子质膜磷脂亲水的磷酸基团结合，稳定精子质 膜外，糖类通过降低溶液的冰点和取代膜周围的水分子，抑制胞外结冰，缩短危险温度区， 减少冰晶生长对细胞膜造成的损伤。此外，糖类还可影响冷冻过程中结冰的方式、冰晶的形 状、冰晶之间未冻结溶液通道的宽度以及冻结溶液的机械属性，因此，可以降低冷冻对精子 的损伤。而在冷冻复苏过程中糖分子结合在质膜周围产生空间效应，可阻止细胞皱缩引起 的质膜变形、折叠所致的膜融合。同样，糖类对不同物种的的冷冻保护作用存在差异，特别是冷冻保护猕猴精子的甘油和糖类最适当配合浓度的防冻液还未有报道。
发明内容
本发明目的是针对现有技术方法的不足，提供一种可广泛应用于猕猴属各灵长类物种的精液超低温冷冻保存方法，包扩甘油和糖类组合构成的防冻液，以及应用防冻液进 行精液超低温冷冻保存和复苏的方法。本发明目的通过以下步骤实现(1)取 0.2g Tris、1.2g TES、2g 乳糖、2g 葡萄糖、0. 2g 棉籽糖、10000IU 青霉素 G 钠盐、5mg硫酸链霉素依次溶于60mL Milli-Q超纯水中，加入20mL鸡蛋卵黄，混合均勻后加 水定容至IOOmL ；(2)将溶液以7000g离心1小时，收集上清液制成稀释液；(3)取45mL稀释液加入5mL的甘油制成防冻液，预冷至4°C ；(4)在室温下，将精液与稀释液按1 9的体积比在试管中混合、封口，以室温水 浴，再放入4°C冰箱中缓慢降温平衡2小时；(5)向试管中加入等体积的防冻液，混合均勻后分装入麦管中于液氮中保存；混 合均勻后分装入0. 25mL麦管中于液氮中保存；(6)复苏时将冷冻麦管由液氮中迅速转移至37°C的水浴中解冻2分钟。所述方法步骤(4)的室温为22_25°C。所述方法步骤(5)是将防冻液分五次加入试管，每次加入1/5体积，每次间隔5分 钟，甘油的终浓度为5%。所述方法步骤(5)是把麦管置于液氮面上方5cm处冷冻10分钟，降温速率为 300C /min，再于液氮中保存。所述方法步骤(5)麦管容积为0. 25mL。Tris和TES分别为三羟甲基氨基甲烷和N-三(羟甲基)甲基_2_氨基乙烷磺酸 钠的英文缩写。本发明具有的积极效果是本发明选取的甘油浓度对于提高猕猴属灵长类动物冷冻精子的复苏运动度、质膜 和顶体的完整率、存活时间有显著效果。本发明防冻液中的葡萄糖，可以一定程度的通过细胞膜进入精子，并为ATP合成 能力低下的精子提供代谢能量。乳糖和棉籽糖分子结构中C H比率低，而羟基基团的数 量比单糖多，能够更好的保护精子的细胞膜，显著提高对猕猴精子的冷冻保护效果。在精液冷冻降温过程中，稀释精液后先于4°C降温平衡2小时，分5次加入含有甘 油的防冻液并最终达到5%的甘油终浓度，这种模式可以有效地缓解由于甘油的加入导致 细胞体积因环境渗透压升高引起的剧烈变化而受到的损伤，而且预冷的防冻液中甘油的毒 副作用在4°C也相对于室温下减弱了很多，这种方法有利于精子的存活和细胞结构与功能 的保持。此外，降温模式、降温速率和在液氮蒸气中的冷冻时间也构成了本发明防冻液使用 效果的显著特征。本发明方法简单，取材容易且成本价格低廉，不需要特殊设备，易于推广。实验结果表明，本发明的方法能够有效地提高猕猴属各种灵长类动物冷冻精子的复苏运动度，保护冷冻复苏精子质膜和顶体结构，表现出了良好的精子冷冻保护作用和防 冻效果，进而提高了冻精的受精率。以下通过实施例对本发明做进一步说明，实施例内容包括但不限制具体实施方式
的范围。
具体实施例方式实施例1 称量0. 2g Tris、1.2g TES、2g 乳糖、2g 葡萄糖、0. 2g 棉籽糖、10000IU 青霉素、5mg 硫酸链霉素依次溶于60mLMilli-Q超纯水中，再加入20mL鸡蛋卵黄，混合均勻后加水定容 至IOOmL ；于7000g的速率离心1小时，收集上清液制成精液稀释液；向精液稀释液中加入 10% (体积比)的甘油制成精液冷冻保存的防冻液；在室温条件下(22-25°C)，将猕猴精液 与稀释液按1 9的体积比在4mL的试管中混合，然后将试管封口放入装有200mL室温水 的烧杯中，并将此烧杯放入4°C的冰箱中缓慢降温平衡2小时；向试管中加入等体积的预冷 至4°C的含有甘油的防冻液，混合均勻，将稀释精液分装入0. 25mL冷冻麦管放入液氮保存。对冷冻保存的猕猴精液，分别用活体荧光染料碘化丙啶PI染色法和异硫氰荧光 素联接的花生四烯酸FITC-PNA荧光染色法实验测定冷冻精子复苏后精子的复苏运动度、 存活时间、精子质膜完整率，精子顶体的完整率，其结果表明冷冻复苏精子的复苏运动度 为56%，于37°C培养12小时后精子运动度仍可维持在30%以上，精子质膜完整率为57%， 顶体完整率为82%。利用冷冻复苏精子与猕猴卵母细胞进行体外受精，受精率为82%，受 精卵在体外发育至囊胚的发育率为39%。生产的囊胚经过胚胎移植后可以顺利着床并产生 子代。实施例2 称量0. 2g Tris、1.2g TES、2g 乳糖、2g 葡萄糖、0. 2g 棉籽糖、10000IU 青霉素、5mg 硫酸链霉素依次溶于60mLMilli-Q超纯水中，再加入20mL鸡蛋卵黄，混合均勻后加水定容 至100mL。于7000g的速率离心1小时后，收集上清液制成精液稀释液。向精液稀释液中 加入10% (体积比)的甘油制成精液冷冻保存的防冻液。在室温条件下(22-25°C)，将熊 猴的精液与稀释液按1 9的体积比在4mL的试管中混合。然后将试管封口后放入装有 200mL室温水的烧杯中，并将此烧杯放入4°C的冰箱中缓慢降温平衡2小时。向试管中分五 次加入等体积的预冷至4°C的含有甘油的防冻液，每次加入1/5体积，每次间隔5分钟，甘油 的终浓度为5 %，混合均勻后，分装稀释精液入0. 25mL冷冻麦管中，将麦管置于液氮面上方 5cm处以30°C /min冷冻10分钟后，放入液氮中保存。对冷冻保存熊猴精液，用与实施例1相同的实验测定冷冻精子复苏后精子的复苏 运动度、存活时间、精子质膜完整率，精子顶体的完整率，其结果表明冷冻复苏精子的复苏 运动度可达61 %，于37°C培养12小时后精子运动度仍维持在20%以上，精子质膜完整率为 64%,顶体完整率为85%。利用冷冻复苏精子进行体外受精，受精率可达53%。实施例3 称量0. 2g Tris、1.2g TES、2g 乳糖、2g 葡萄糖、0. 2g 棉籽糖、10000IU 青霉素、5mg 硫酸链霉素依次溶于60mLMilli-Q超纯水中，再加入20mL鸡蛋卵黄，混合均勻后加水定容 至IOOmL ；于7000g的速率离心1小时，收集上清液制成精液稀释液。向精液稀释液中加入10% (体积比)的甘油制成精液冷冻保存的防冻液；在室温条件下(22-25°C)，将食蟹猴的 精液与稀释液按1 9的体积比在4mL的试管中混合，然后将试管封口后放入装有200mL 室温水的烧杯中，并将此烧杯放入4°C的冰箱中缓慢降温平衡2小时，向试管中分五次加入 等体积的预冷至4°C的含有甘油的防冻液，每次加入1/5体积，每次间隔5分钟，甘油的终 浓度为5%，混合均勻后，将稀释精液分装入0. 25mL冷冻麦管中置于液氮面上方5cm处以300C/min冷冻10分钟后，放入液氮中保存。 对冷冻保存食蟹猴的精液，用与实施例1相同的实验测定冷冻精子复苏后精子的 复苏运动度、存活时间、精子质膜完整率，精子顶体的完整率，其结果表明，冷冻复苏精子的 复苏运动度为50%，精子质膜完整率为59%，顶体完整率为83%。
权利要求
猕猴属灵长类动物精液超低温冷冻保存方法，包括如下步骤(1)取0.2gTr i s、1.2g TES、2g乳糖、2g葡萄糖、0.2g棉籽糖、10000IU青霉素G钠盐、5mg硫酸链霉素依次溶于60mL Mil li-Q超纯水中，加入20mL鸡蛋卵黄，混合均匀后加水定容至100mL；(2)将溶液以7000g离心1小时，收集上清液制成稀释液；(3)取45mL稀释液加入5mL的甘油制成防冻液，预冷至4℃；(4)在室温下，将精液与稀释液按1∶9的体积比在试管中混合、封口，以室温水浴，再放入4℃冰箱中缓慢降温平衡2小时；(5)向试管中加入等体积的防冻液，混合均匀后分装入麦管中于液氮中保存；混合均匀后分装入0.25mL麦管中于液氮中保存；(6)复苏时将冷冻麦管由液氮中迅速转移至37℃的水浴中解冻2分钟。
2.根据权利要求1所述的冷冻保存方法，其特征是所述方法步骤⑷的室温为 22-25 °C。
3.根据权利要求1、2所述的冷冻保存方法，其特征是所述方法步骤(5)是将防冻液分 五次加入试管，每次加入1/5体积，每次间隔5分钟，甘油的终浓度为5%。
4.根据权利要求1、2所述的冷冻保存方法，其特征是所述方法步骤(5)是把麦管置于 液氮面上方5cm处冷冻10分钟，降温速率为30°C /min,再于液氮中保存。
5.根据权利要求3所述的冷冻保存方法，其特征是所述方法步骤(5)是把麦管置于液 氮面上方5cm处冷冻10分钟，降温速率为30°C /min，再于液氮中保存。
6.根据权利要求1、2所述的冷冻保存方法，其特征是所述方法步骤(5)麦管容积为 0.25mL。
7.根据权利要求3所述的冷冻保存方法，其特征是所述方法步骤(5)麦管容积为 0.25mL。
8.根据权利要求4所述的冷冻保存方法，其特征是所述方法步骤(5)麦管容积为 0.25mL。
全文摘要
猕猴属灵长类动物精液超低温冷冻保存方法，属于动物繁殖方法。本发明将Tris、TES、乳糖、葡萄糖、棉籽糖、青霉素G钠盐、硫酸链霉素等溶于水，离心取上清液制成精液稀释液，加甘油配成防冻液，再用稀释液稀释精液降温至4℃，与等体积的预冷至4℃的防冻液混合，分装冷冻麦管中并于液氮蒸汽降温后放入-196℃液氮中保存。使用时，解冻复苏精子。本发明可以提高猕猴属灵长类动物冷冻精子复苏运动度、存活时间、质膜和顶体完整率及受精率。
文档编号A01N1/02GK101843238SQ20101019871
公开日2010年9月29日 申请日期2010年6月12日 优先权日2010年6月12日
发明者司维, 季维智, 牛昱宇, 王宏, 纪少珲 申请人:昆明亚灵生物科技有限公司