专利名称：动态测定植物组培苗自养能力的方法
技术领域：
本发明涉及一种测定植物组培苗自养能力的方法，属于生物工程领域。
背景技术：
植物组织培养是指植物的离体器官、组织或细胞在人工控制的环境下培养发育再 生成完整植株的技术。植物组织培养快繁技术比常规的繁殖技术有很多优越性，已经在农 业、林业、园艺和医药等方面广泛地应用。在植物组织培养过程中，组培苗的生长方式有三 种一是小植株靠光合作用进行的自养生长；二是小植株靠培养基中的糖进行异养生长； 三是小植株既靠培养基中的糖又靠人工光照，同时进行异养和自养的兼养生长。现在常规 的植物组织培养快繁技术大多数是以第三种方式进行。小植株的自养能力的大小决定了组 培苗生长的好坏，仅行异养生长的组培苗，将会导致植株生理、形态上的紊乱，造成生长发 育延缓或死亡，引起玻璃苗、生根困难等问题。因此，动态测定植物组培苗自养能力，控制培 养环境因子，对工厂化的苗木生产，具有重要的意义。首先，目前组培苗的光合速率的测定所涉及到的对象是大型容器(或组培箱)(徐 志刚，崔瑾，焦学磊，丁为民，李式军，农业工程学报，2003，第19卷第4期，pp. 38-40; 王立文，丁为民，丁永前，农业机械学报，2005，第36卷第5期，pp. 93-96)，测定的原理是依 据容器内的二氧化碳浓度的变化来获取二氧化碳交换速率的。这种方法，对无糖培养较适 合，但不适合对于常规小容器培养的、同时进行异养和自养的兼养生长的组培苗的自养能 力的测定。因为，组培苗一方面可以利用培养基中糖的分解，获取生长所需要的物质和能 量，另一方面可以利用自身的光合作用生成有机物，供其生长发育所需。分解糖时，放出二 氧化碳，进行光合作用时植株吸收二氧化碳。依据容器内的二氧化碳浓度的变化获取的二 氧化碳交换速率，不能反映小植株的自养能力，这是因为呼吸作用(糖的分解)和光合作用 都会受到内部和外部环境的影响。其次，目前组培苗的二氧化碳交换速率的测定都以容器内的植株或小植株的数目 为单位进行测定。由于植株的大小不同，光合速率也不同，因此，用容器内的植株或小植株 的数目为单位来度量光合能力，会有极大的误差。最后，目前为了获得准确的单位质量组培苗的二氧化碳交换速率，采用了破坏性 获取小植株的质量，不是动态地测定组培苗的自养能力。因此，动态测定植物组培苗自养能力，必须在线获取组培苗的质量，既考虑到单位 质量下的光合速率，又考虑到培养基中糖在分解过程中的二氧化碳的释放。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种动态测定植物组培苗自养能力的方法，该 方法既考虑到单位质量下的光合速率，又考虑到培养基中糖在分解过程中的二氧化碳的释 放，动态测定植物组培苗自养能力，以克服现有技术中存在的不适合对于常规小容器培养 的、同时进行异养和自养的兼养生长的组培苗的自养能力的测定等不足。
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本发明采用以下技术方案组培苗培养一段时间后进行初次测定；初次测定步骤 为将二氧化碳分析仪的进气口和出气口塞上抗菌过滤棉，并对接口、胶管和带孔的橡胶塞 进行无菌处理，通过带孔的橡胶塞，在无菌环境下连接到组培瓶上，形成密封的系统，计算 出密封系统的空气体积；分别记录在培养光强下和黑暗下单位时间内组培瓶中的CO2浓度 的变化；采用图像处理法获得组培苗的质量；根据组培瓶中的CO2浓度的变化，构建二氧化 碳浓度随时间变化的模型，依据各自模型，将CO2浓度的变化速率换算到标准二氧化碳浓度 下的CO2浓度的变化速率；根据光下得到的标准二氧化碳浓度下的CO2浓度的变化速率和黑 暗处得到的标准二氧化碳浓度下的CO2浓度的变化速率计算出组培苗绝对自养能力；将该 瓶组培苗的绝对自养能力换算成单位质量的组培苗自养能力；在培养过程中，每隔一段时 间(3到7天，一般为5天)重复初次测定的步骤，获得不同时期的该瓶组培苗组培苗绝对自 养能力和单位质量的自养能力；最终获取不同时期的该组培苗的自养能力的动态信息。所述的初次测定是当组培苗培养到10天后，开始第一次测定。所述的采用图像处理法获得组培苗的质量，是将待检测的组培苗加入到不同的已 知质量的组培苗中间，获得彩色图像；将彩色图像转化为灰度格式，再将灰度格式的图像经 过亮度和对比度调整，最后将图像进行反转，根据反转图像对各瓶组培苗进行像素点数的 统计；已知质量的组培苗为内标，6-8个内标的质量和像素点进行线性回归，获得线性回归 方程；将未知待测样品的像素点代入该方程，获得该瓶组培苗的质量。所述的构建二氧化碳浓度随时间变化的模型，是将组培瓶中的CO2浓 度记为Y，测定时间记为X，组培瓶中的CO2浓度Y随时间X变化，逐渐增 大或减小；组培瓶中的CO2浓度Y随时间X逐渐增大用非线性双曲线方程
a. X
T = Y0 +—-来拟合，组培瓶中的CO2浓度Y随时间X逐渐减小用非线性双曲线方程 b + X
3 . K
Y = Y0 +「—=来拟合；其中，Y为即时CO2浓度，单位为μ mol · mor1, X为测定时间，单位
b + A
为S，Ytl为t=0时的CO2浓度；a、b均为拟合参数。所述的将CO2浓度的变化速率换算到标准二氧化碳浓度下的CO2浓度的变化速 率，是当组培瓶中的CO2浓度Y随时间X逐渐增大时，将Y为标准大气二氧化碳浓度值，
-Y
即360 ymol ^mor1带入非线性双曲线方程Y= Y0I^7,计算出对应的时间Xb值，
b + X
Xb =b ；将非线性双曲线方程Y=Yq以Y对时间X求一阶导数，可
a-3b0 + lo0 b + X
得Y' = (b+xy ，将Xb值带入该式，得到该时刻对应的标准co2浓度变化速率参数\，
,a · b
A
(b + Xb)2
当组培瓶中的CO2浓度Y随时间X逐渐增小时，将Y为360 μ mol · mo Γ1带入非线性
,a 100 + Y
双曲线方程Y= Y0 +U，计算出对应的时间Xb值，Xb= ■ ° b ；将非线性双曲 0 b + X360-Y0
5a ’ "hfa ’ "h
线方程Y= Y0+^r；以Y对时间X求一阶导数，可得Y = M2，将Xb值带入该式， b + XCb+Xj
得到该时刻对应的标准CO2浓度变化速率参数K, K= d2 。所述的根据光下得到的标准二氧化碳浓度下的CO2浓度的变化速率和黑暗处 得到的标准二氧化碳浓度下的CO2浓度的变化速率计算出组培苗绝对自养能力的获取， 是组培苗绝对自养能力AT根据光下测定的标准二氧化碳浓度下的CO2浓度的变化速率 怂和黑暗处测定的标准二氧化碳浓度下的CO2浓度的变化速率Ad进行计算，计算公式为 AT=-(Al-Ad) X 1000V/22. 4，单位为nmol · s—1，V为密封系统的空气体积。所述的将该瓶组培苗的绝对自养能力换算成单位质量的组培苗自养能力，是依据 组培苗绝对自养能力AT和该瓶组培苗的质量M,换算成单位质量的组培苗自养能力ATpm， 换算公式为ATpm=AT/M。所述的的获取不同时期的该组培苗的自养能力的动态信息是在培养过程中，每隔 一段时间(3到7天，一般为5天)，重复初次测定的步骤，进行组培苗的自养能力的测定。本发明的原理是组培苗在黑暗下进行呼吸，主要是利用培养基的糖，这个过程是 释放二氧化碳的过程；组培苗在光下既有小植株自身的光合作用也有呼吸作用，此时的二 氧化碳交换是光合作用和呼吸作用综合表现。而植株的自养能力则是这光合作用的部分。本发明的优点如下
1)本方法能动态测定植物组培苗自养能力。2)本方法能在线、无菌、动态的测定组培苗自养能力。3)本方法测定的为标准状态下、组培苗单位质量的自养能力，可为比较不同的组 培苗的自养能力提供依据。
图1为在黑暗下组培苗1在培养10天时记录的组培瓶中CO2浓度随测定时间的 变化示意图2为在光下组培苗1在培养10天时记录的组培瓶中CO2浓度随测定时间的变化示 意图。
具体实施例方式
具体实施例方式本发明包含以下过程
第一、组培苗培养一段时间后(一周至两周，一般为10天)进行初次测定；初次测定步 骤为
1、光下和黑暗下单位时间内组培瓶中的CO2浓度的变化。将二氧化碳分析仪如Li-840 型C02/H20分析仪的进气口和出气口塞上抗菌过滤棉，对接口、胶管和带孔的橡胶塞等进行 无菌处理，通过带孔的橡胶塞，在无菌环境下连接到组培瓶上，形成密封的系统，计算出密 封系统的空气体积V，单位为L。分别记录在培养光强下和黑暗下单位时间内组培瓶中的CO2 浓度的变化。同时采用图像处理法获得该组培瓶中组培苗的质量M，单位为g。2、构建二氧化碳浓度随时间变化的模型。将组培瓶中的CO2浓度记为Y，测定时间
6记为X。组培瓶中的CO2浓度Y随时间X变化，逐渐增大或减小。组培瓶中的CO2浓度Y随 时间X逐渐增大用非线性双曲线方程(1)来拟合，组培瓶中的CO2浓度Y随时间X逐渐减小 用非线性双曲线方程(2)来拟合
权利要求
一种动态测定植物组培苗自养能力的方法，其特征在于组培苗培养一段时间后进行初次测定；初次测定步骤为将二氧化碳分析仪的进气口和出气口塞上抗菌过滤棉，并对接口、胶管和带孔的橡胶塞进行无菌处理，通过带孔的橡胶塞，在无菌环境下连接到组培瓶上，形成密封的系统，计算出密封系统的空气体积；分别记录在培养光强下和黑暗下单位时间内组培瓶中的CO2浓度的变化；采用图像处理法获得组培苗的质量；根据组培瓶中的CO2浓度的变化，构建二氧化碳浓度随时间变化的模型，依据各自模型，将CO2浓度的变化速率换算到标准二氧化碳浓度下的CO2浓度的变化速率；根据光下得到的标准二氧化碳浓度下的CO2浓度的变化速率和黑暗处得到的标准二氧化碳浓度下的CO2浓度的变化速率计算出组培苗绝对自养能力；将该瓶组培苗的绝对自养能力换算成单位质量的组培苗自养能力；在培养过程中，每隔一段时间重复初次测定的步骤，获得不同时期的该瓶组培苗组培苗绝对自养能力和单位质量的自养能力；最终获取不同时期的该组培苗的自养能力的动态信息。
2.根据权利要求1所述的动态测定植物组培苗自养能力的方法，其特征在于组培苗 培养到10天后，开始第一次测定，即初次测定。
3.根据权利要求1所述的动态测定植物组培苗自养能力的方法，其特征在于采用图 像处理法获得组培苗的质量，是将待检测的组培苗加入到不同的已知质量的组培苗中间， 获得彩色图像；将彩色图像转化为灰度格式，再将灰度格式的图像经过亮度和对比度调整， 最后将图像进行反转，根据反转图像对各瓶组培苗进行像素点数的统计；已知质量的组培 苗为内标，6-8个内标的质量和像素点进行线性回归，获得线性回归方程；将未知待测样品 的像素点代入该方程，获得该瓶组培苗的质量。
4.根据权利要求1所述的动态测定植物组培苗自养能力的方法，其特征在于构建二 氧化碳浓度随时间变化的模型，是将组培瓶中的CO2浓度记为Y，测定时间记为X，组培瓶中 的CO2浓度Y随时间X变化，逐渐增大或减小；组培瓶中的CO2浓度Y随时间X逐渐增大用a. X非线性双曲线方程Y=YQ +b + X来拟合，组培瓶中的CO2浓度Y随时间χ逐渐减小用非线性双曲线方程γ = Y0 +A来拟b + X合；其中，Y为即时CCU农度，单位为ymol 'πιοΓ1，X为测定时间，单位为S，Y。为t=0时的 CO2浓度；a、b均为拟合参数。
5.根据权利要求1所述的动态测定植物组培苗自养能力的方法，其特征在于将CO2浓 度的变化速率换算到标准二氧化碳浓度下的CO2浓度的变化速率，是当组培瓶中的CO2浓度 Y随时间X逐渐增大时，将Y为标准大气二氧化碳浓度值，即360 μ mol · mo Γ1带入非线性双曲线方程γ = Ytj+—，计算出对应的时间xb值，& = 3:么· b ;将非线性双曲b 十 IT3, -J50U T XQ线方程Y = Yq+fl以Y对时间X求一阶导数，可得=Yi = , a^2 ,将Xb值带入该式， b + X(b + X)2得到该时刻对应的标准CO2浓度变化速率参数Ab，Ab a'bCb+ Xb)2当组培瓶中的CO2浓度Y随时间X逐渐增小时，将Y为360 μ mol · mo Γ1带入非线性a u_ a-360 + Yo ,双曲线方程Y = Y0,计算出对应的时间Xb值，Xb = ° -b ；将非线性双曲 线方程Y = Y0以Y对时间X求一阶导数，可得= (b:)2 ,将Xb值带入该式，得到该时刻对应的标准CO2浓度变化速率参数Ab，At =。
6.根据权利要求1所述的动态测定植物组培苗自养能力的方法，其特征在于根据光 下得到的标准二氧化碳浓度下的CO2浓度的变化速率和黑暗处得到的标准二氧化碳浓度下 的CO2浓度的变化速率计算出组培苗绝对自养能力，是组培苗绝对自养能力AT根据光下测 定的标准二氧化碳浓度下的CO2浓度的变化速率怂和黑暗处测定的标准二氧化碳浓度下的 CO2浓度的变化速率Ad进行计算，计算公式为AT=- (Al-Ad) X 1000V/22. 4，单位为nmol -s"1, V为密封系统的空气体积。
7.根据权利要求1所述的动态测定植物组培苗自养能力的方法，其特征在于将该瓶 组培苗的绝对自养能力换算成单位质量的组培苗自养能力，是依据组培苗绝对自养能力AT 和该瓶组培苗的质量M,换算成单位质量的组培苗自养能力ATpm，换算公式为ATpm=AT/M。
8.根据权利要求1所述的的动态测定植物组培苗自养能力的方法，其特征在于在培 养过程中，每隔3到7天，重复初次测定的步骤，进行组培苗的自养能力的测定。
全文摘要
本发明公开了一种动态测定植物组培苗自养能力的方法，组培苗培养一段时间后进行初次测定；其步骤为将二氧化碳分析仪在无菌环境下连接到组培瓶上，计算出密封系统的空气体积；分别记录在培养光强下和黑暗下单位时间内组培瓶中的CO2浓度的变化；采用图像处理法获得组培苗的质量；根据组培瓶中的CO2浓度的变化构建模型，将CO2浓度的变化速率换算到标准浓度的变化速率；根据光下得到的标准浓度的变化速率和黑暗处得到的标准浓度的变化速率计算出组培苗绝对自养能力；将该瓶组培苗的绝对自养能力换算成单位质量的组培苗自养能力；每隔一段时间重复初次测定的步骤；最终获取不同时期的该组培苗的自养能力的动态信息。
文档编号A01G7/02GK101953298SQ201010263569
公开日2011年1月26日 申请日期2010年8月26日 优先权日2010年8月26日
发明者刘丛强, 刘莹, 吴沿友, 李萍萍, 王宝利, 许文祥 申请人:中国科学院地球化学研究所