专利名称：一种冻存细胞的方法
技术领域：
本发明涉及一种改进的冻存细胞的方法，属生物技术领域。
背景技术：
随着生物学技术的发展，细胞体外培养被广泛应用到各种生物学研究领域，在 体外细胞培养工作中，为了保存细胞，并使其长期具有生物活性，细胞的冻存与复苏成 为至关重要的环节。对于体外培养的细胞，必须能够以较高的效率实现冻存与复苏，才 能达到生物学对细胞的要求。因此探讨供体细胞有效的冻存方法是很必要的。细胞冻存与复苏的基本原则是“慢冻速溶”，这样可以最大限度的保持细胞活 性。细胞冻存过程中，降温的速度，直接关系到冻存效果，“缓慢冰冻”是保护细胞使 之不发生严重损伤的关键因素。细胞在冷冻过程中会发生如下变化当细胞被冷至_5°C时，因溶液中加有冷冻 保护剂而降低溶液的冰点，细胞内外溶液仍未结冰；当被冷至_5 -15°C之间时，细胞 外溶液先出现结冰而细胞内仍保持未结冰状态，细胞内未结冰的水分子会比细胞外结冰 的水分子具有更高的化学能，其结果是，细胞内水分子为了与细胞外水分子保持化学能 的平衡，会向细胞外流动。冷冻速度不同，细胞内水分向外流动的情况也不相同如果 冷冻速度慢，细胞内水分外渗多，细胞脱水，体积缩小，细胞内溶质浓度增高，细胞内 不会发生结冰；如果冷冻速度快，细胞内水分没有足够的时间外渗，结果随着温度的下 降而发生细胞内结冰。不同的冷冻速度能使细胞内发生不同的生理变化，也能对细胞产生不同的损 伤。当冷冻速度过慢时，细胞脱水严重，细胞体积严重收缩，超过一定程度时即失去活 性，同时还会引起细胞外溶液部分结冰，从而使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度增高， 产生溶质损伤。当冷冻速度过快时，细胞内水分来不及外渗，会形成冰晶，造成细胞膜 及细胞器的损坏，产生细胞内冰晶损伤。科学合理的控制降温速度，是细胞冻存成功的关键。根据控制降温速度方法的 不同，目前常用的细胞冻存方法有两种1、传统的逐级降温法，即利用各种温级的低温 设备逐级降温至-70°c -80°c，然后直接投入液氮进行保存；2、程控降温仪降温法， 冻存细胞按照设定的降温速度从室温降至-100°C以下，再直接投入液氮进行保存。应用 程控降温仪可以准确控制细胞冻存的降温速度，效果较好；但程控降温仪价格昂贵，使 用成本太高，仅少数部门能够使用。目前国内外学者多采用逐级降温法进行细胞冻存， 相比程控降温仪成本低了很多，更经济实用。传统的逐级降温法的操作程序为活性细胞悬液一4°C、0.5 1小时 —-20°C、0.5 2小时一-80°C、8 16小时一浸入液态氮(_196°C)。本方法用到了 4°C、-20-80°C,液氮容器四种不同的低温设备，分阶段的低温环境延缓了细胞降温 速度，符合“缓慢冰冻”原理。但是这种逐级降温细胞冻存着历经四步降温，程序复 杂、操作繁琐，设备成本高，并且细胞的复苏存活率不高，冻存半年后，一般复苏存活率均低于80%。为了简化操作程序、降低工作成本、提高冻存细胞的复苏存活率，有必 要寻找一种更好的新方法或改进方法，以解决上述问题。
发明内容
本发明 所要解决的技术问题是克服现有技术之缺陷，提供一种冻存细胞的方 法，该方法具有操作程序简化、工作成本低、冻存细胞的复苏存活率高等优点。本发明所述技术问题是由以下技术方案实现的。一种冻存细胞的方法，它按以下步骤操作
a.细胞的消化用胰蛋白酶液消化细胞后，弃去消化液，加入含有10%小牛血清的 细胞培养液，使细胞悬浮，以800-1000 r/min离心5 min，弃去上清液；
b.冻存液稀释细胞用冻存液将细胞沉淀悬浮，调整至适合的细胞密度后分装于细 胞冻存管中；
c.冷冻降温将冻存管直立放入聚苯乙烯保温盒中，封好聚苯乙烯保温盒盖，放 于-80°C低温设备中，静置12 16小时；
d.浸入液态氮将冻存管从聚苯乙烯保温盒中取出迅速浸入液氮(_196°C)中，长 期保存。上述冻存细胞的方法，所述胰蛋白酶液质量浓度为0.25%。上述冻存细胞的方法，所述细胞培养液为MEM (Minimum Essential Medium)、 DMEM (Dulbecco,s Modified Eagle Medium)、RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute-1640)或 M199 (Medium 199)。上述冻存细胞的方法，所述冻存液由20%的胎牛血清、10%的二甲基亚砜 (DMSO)和70%的细胞培养液组成。上述冻存细胞的方法，所述细胞密度为1 X 106-1 X 107个/ml。上述冻存细胞的方法，所述聚苯乙烯保温盒的结构尺寸为壁厚1.4-1.6cm，长 20-25cm、宽 15-20cm、高 10cm。本发明冻存细胞的方法在传统的逐级降温细胞冻存法的基础上进行了创新，以 普通聚苯乙烯保温盒为载体，细胞冻存仅分两步完成，省去了放置于4°C、-20°C两个温 度阶段，而是直接放入-80°C低温设备，然后再转入液氮中长期保存。本发明的基本原理 是聚苯乙烯保温盒具有一定的隔热效果，它减缓了在-80°C低温设备中细胞温度下降 的速度，符合细胞缓慢冰冻原理；单一-80°C环境温度使得细胞温度下降速度均勻，细 胞脱水、可溶性物质浓缩反应效果更好，减少了细胞内冰晶形成，降低了细胞损伤，保 证了冻存细胞的复苏存活率。本发明提供的冻存细胞的方法，与现有技术相比，具有以 下优点
1)以普通聚苯乙烯保温盒为载体，细胞冻存仅分两步完成，省去了放置于 4°C、-20°C两阶段，从而节省了 4°C和-20°C两种低温设备购买和维护费用，降低了工作 成本；
2)较之逐级降温细胞冻存法的四步操作程序，只需放置-80°C和液氮两步，冻存操 作即可完成，既节省人力，又提高了工作效率；
3)细胞冻存半年后，复苏存活率在85%以上，细胞冻存效果比现有技术有了明显提高。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。实施例1 MDBK细胞和Marc-145细胞的冻存与复苏冻存
a.细胞的消化取培养生长成单层的MDBK细胞，用0.25%的胰蛋白酶液消 化3min，弃去胰蛋白酶液，加入含有10%小牛血清的DMEM培养液使细胞悬浮，以 800-1000 r/min离心5 min,弃去上清液；
b.冻存液稀释细胞用冻存液(70%DMEM +20%胎牛血清+10% DMSO)将细胞 沉淀悬浮，调整细胞密度均为5X106个/ml，分装于2ml冻存管中(所述冻存管的规格 为 1.2ml、2ml、3.5ml 或 5ml)，每管 1.5ml ；
c.冷冻降温将冻存管直立放入壁厚1.4cm，长20cm、宽15cm、高IOcm的聚苯乙 烯保温盒中，用胶带将盖子封好，放置于-80°C低温设备中12小时；
d.浸入液态氮将冻存管从盒中取出迅速浸入液氮中，长期保存。Marc-145细胞的冻存同上。复苏
存活率6个月后，将冻存管从液氮中取出，移至40°C水浴中迅速解冻，加入到事 先加有8.5 ml无血清DMEM的离心管中，1000 r/min离心5 min，无血清DMEM洗3次， 台盼蓝染色活细胞计数，计算MDBK细胞和Marc-145细胞的存活率，结果MDBK细 胞和Marc-145细胞的存活率分别为88.1%和85.9%。繁殖生长37°C、5% C02细胞培养箱中培养48小时后，MDBK细胞和 Marc-145细胞均长成致密的单层，且形态较好。比较例传统的逐级降温细胞冻存法MDBK细胞和Marc-145细胞的冻存与 复苏
冻存
1)取培养生长成单层的MDBK细胞，用0.25%的胰蛋白酶液消化3min，弃掉消胰 蛋白酶液，加入含有10%小牛血清的DMEM培养液使细胞悬浮，以800-1000 r/min离心 5 min,弃去上清液；
2)用冻存液(70%DMEM+20%胎牛血清+10% DMSO)将细胞沉淀悬浮，调整细 胞密度为5 X 106个/ml，分装于2ml冻存管，每管1.5ml ；
3)将冻存管直立依次放入4°C、30分钟一-20°C、1小时一_80°C、12小时一浸入液 态氮(_196°C)长期保存。Marc-145细胞的冻存同上。复苏
存活率6个月后，将冻存管从液氮中取出，移至40°C水浴中迅速解冻，加入到事 先加有8.5 ml无血清DMEM的离心管中，1000 r/min离心5 min，无血清DMEM洗3 次，台盼蓝染色活细胞计数，计算存活率，结果MDBK细胞和Marc-145细胞的存活率 分别为79.3%和75.2%。
繁殖生长37°C、5% C02细胞培养箱中培养48小时后，MDBK细胞和 Marc-145细胞均长成致密的单层，且形态较好。实施例2 PK15细胞和ST细胞的冻存与复苏冻存
a.细胞的消化取培养生长成单层的PK15细胞，用质量浓度为0.25%的胰蛋白酶 液消化5min，弃掉消胰蛋白酶液，加入含有10%小牛血清的MEM细胞培养液使细胞悬 浮，以800-1000 r/min离心5 min,弃去上清液；
b.冻存液稀释细胞用冻存液(70%MEM+20%胎牛血清+10% DMSO)将细胞沉 淀悬浮，调整细胞密度均为3X106个/ml，分装于3.5ml冻存管，每管2.5ml ；
C.冷冻降温将冻存管直立放入壁厚1.6cm，长25cm、宽20cm、高IOcm的聚苯乙 烯保温盒中，用胶带将盖子封好，放置于-80°C低温设备中16小时； d.浸入液态氮将冻存管从盒中取出迅速浸入液氮中，长期保存。ST细胞的冻存同上。复苏
存活率6个月后，将冻存管从液氮中取出，移至40°C水浴中迅速解冻，加入到事 先加有15 ml无血清MEM的离心管中，1000 r/min离心5 min，无血清MEM洗3次，台 盼蓝染色活细胞计数，计算存活率，结果PK15细胞和ST细胞的存活率分别为87.5% 禾口 88.4%。繁殖生长37°C、5% C02细胞培养箱中培养48小时后，PK15细胞和ST细胞 均长成致密的单层，且形态较好。比较例传统的逐级降温细胞冻存法PK15细胞和ST细胞的冻存与复苏冻存
1)取培养生长成单层的PK15细胞，用质量浓度0.25%的胰蛋白酶液消化5min，弃 掉消胰蛋白酶液，加入含有10%小牛血清的MEM细胞培养液使细胞悬浮，以800-1000 r/min离心5 min,弃去上清液；
2)用冻存液(70%MEM+20%胎牛血清+10% DMSO)将细胞沉淀悬浮，调整细 胞密度均为3 X 106个/ml，分装于3.5ml冻存管，每管2.5ml ；
3)将冻存管直立依次放入4°C、30分钟一-20°C、1小时一_80°C、14小时一浸入液 态氮(_196°C)长期保存。ST细胞的冻存同上。复苏
存活率6个月后，将冻存管从液氮中取出，移至40°C水浴中迅速解冻，加入到事 先加有15 ml无血清MEM的离心管中，1000 r/min离心5 min,无血清MEM洗3次，台 盼蓝染色活细胞计数，计算存活率，结果PK15细胞和ST细胞的存活率分别为77.6% 禾口 78.4%。繁殖生长37°C、5% C02细胞培养箱中培养48小时后，PK15细胞和ST细胞 均长成致密的单层，且形态较好。本发明中的细胞冻存、复苏的质量可以通过存活率来衡量，即在细胞解冻、洗 涤之后，用台盼蓝进行细胞计数，经台盼蓝染色，活细胞呈无色，晶莹透亮，死细胞呈蓝色，暗淡无光；存活率=活细胞数/细胞 总数χ 100%。实施例1-2中，应用本发明冻 存细胞的方法，四种细胞冻存半年后，复苏存活率均高于85%，比对应的应用传统方法 的复苏存活率高，说明本发明冻存细胞的方法具有显著的进步。
权利要求
1.一种冻存细胞的方法，其特征在于，它按以下步骤操作a.细胞的消化用胰蛋白酶液消化细胞后，弃去消化液，加入含有10%小牛血清的 细胞培养液，使细胞悬浮，以800-1000 r/min离心5 min，弃去上清液；b.冻存液稀释细胞用冻存液将细胞沉淀悬浮，调整至适合的细胞密度后分装于细 胞冻存管中；c.冷冻降温将冻存管直立放入聚苯乙烯保温盒中，封好聚苯乙烯保温盒盖，放 于-80°C低温设备中，静置12 16小时；d.浸入液态氮将冻存管从聚苯乙烯保温盒中取出迅速浸入液氮中，长期保存。
2.根据权利要求1所述的冻存细胞的方法，其特征在于，所述步骤a中胰蛋白酶液的 质量浓度为0.25%。
3.根据权利要求2所述的冻存细胞的方法，其特征在于，所述步骤a中细胞培养液为 MEM、DMEM> RPMI-1640 或 M199。
4.根据权利要求3所述的冻存细胞的方法，其特征在于，所述步骤b中冻存液由20% 的胎牛血清、10%的二甲基亚砜和70%的细胞培养液组成；所述细胞培养液为MEM、 DMEM、RPMI-1640 或 M199。
5.根据权利要求4所述的冻存细胞的方法，其特征在于，所述步骤b中细胞密度为 IX 106 IX 107 个/ml。
6.根据权利要求5所述的冻存细胞的方法，其特征在于，所述步骤c中聚苯乙烯保温 盒的结构尺寸为壁厚1.4-1.6cm，长20-25cm、宽15_20cm、高10cm。
全文摘要
一种冻存细胞的方法，它包括细胞的消化、冻存液稀释细胞、-80℃冷冻降温、浸入液态氮四步骤。该方法以普通聚苯乙烯保温盒为载体，细胞冻存降温仅分两步即可完成，省去了放置于4℃、-20℃两个温度阶段，而是直接投放于-80℃低温设备中、再转入液氮中长期保存，该方法具有操作程序简化、工作成本低、冻存细胞的复苏存活率高等优点。
文档编号A01N1/02GK102007901SQ201010566199
公开日2011年4月13日 申请日期2010年11月30日 优先权日2010年11月30日
发明者刘涛, 杨保收, 焦玉兰, 赵玉龙, 郁宏伟 申请人:瑞普(保定)生物药业有限公司