控制黄龙病的驱虫剂组合物和基因方法

专利名称：控制黄龙病的驱虫剂组合物和基因方法
技术领域：
本发明涉及含有倍半萜以控制柑橘类植物中黄龙病(HLB)的驱虫剂组合物。也公开了通过柑橘类植物的遗传修饰控制HLB的方法。
背景技术：
黄龙病(HLB)，也知道为柑橘静脉韧皮部变性(CVPD)、柑橘绿化病、黄梢病(从中文黄龙病翻译)、台湾的立枯病(由作为立即枯萎病的中文翻译)、菲律宾的叶黄斑病和印度的柑橘枯病，可能是由媒介物病原体(vectored pathogen)引起的最严重的柑橘疾病。病原体是能运动的细菌，韧皮部杆菌(Candidatus Liberibacter spp.),其通过亚洲柑桔木虱(胸喙类木虱科)——也知道为柑桔木風——、或在非洲通过非洲木虱(Triozaerytreae)、非洲柑桔木風传染。HLB主要分布在亚洲的热带和亚热带。它在亚洲中的所有柑橘生长区中都有报道。在中国、台湾、印度、斯里兰卡、马来西亚、印度尼西亚、緬甸、菲律宾、巴基斯坦、泰国、琉球群岛、尼泊尔、留尼汪、毛里求斯、和阿富汗，该疾病已经影响了庄稼。在亚洲之外地区诸如沙特阿拉伯、巴西和美国的佛罗里达也报道了该疾病。虽然已有的杀虫剂和驱虫剂组合物在控制HLB可以是有用的，但是这些组合物的安全性受到怀疑，因为许多这些组合物对于生态系统中的其它生物是过度有毒的。另外，许多这些组合物是寿命超长，且在它们所施加的环境中几乎无限期地持续。而且，许多昆虫种类已经进化出对于多种已知杀虫剂和驱虫剂组合物的耐性。因此，存在对于相对无毒、短寿命、有效的驱虫剂组合物的需求，诸如生物驱虫剂组合物。在越南很早就知道邻近柑橘生长、或与柑橘间作的番石榴对于亚洲柑桔木虱具有杀虫剂或驱虫剂作用。番石槽是番石槽属(genus Psidium)桃金娘科(桃金娘科(Myrtaceae))的植物，所述科包括大约100种热带灌木和小树。最经常遇到的物种和通常简称为“番石榴”的一种是苹形番石榴(番石榴(Psidium guajava))。套种番石榴和柑橘的保护作用可能是由于番石榴叶产生的挥发物，因为该保护作用是整年存在的。从番石榴叶的水蒸馏中得到的番石榴叶油使用GC-MS鉴定出57种成分，包括27种萜(或倍半萜)连同14种醇和4种酯，解释番石榴的保护作用的准确机理是未知的。最近的报道(Rouseff 等人，Sulfur Volatiles in Guava (Psidium guajava L.)Leaves:Possible Defense Mechanism, J. Agric. Food Chem, 56:8905-10，2008)提议硫挥发物诸如二甲基二硫醚对于番石榴的相斥作用承担责任，而不是主要挥发物诸如β -石竹烯，因为后者也在柑橘中存在。但是，番石榴叶中含有的硫挥发物在微小的水平放出和仅在受伤后大约30分钟的时间段中持续，表明这些化合物与在越南柑橘-番石榴中所观察到的无关或者极少的关系。另一方面，β_石竹烯在未损害的柑橘叶中通常以O. 2%以下的总挥发物的浓度存在，而其通常占多于50%的番石榴叶放出的总挥发物。仍然存在控制柑橘类植物中的HLB的需求，而本发明提供了对该问题的新的解决方案。发明概沭
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已经发现，由番石榴叶产生的倍半萜诸如β-石竹烯和α-可巴烯驱除柑桔木虱(Diaphorina citri)和/或非洲木風(Tryoza erytrae)昆虫。因此,本发明满足在柑橘类植物中通过提供含有倍半萜的生物驱虫剂组合物控制HLB的产业的需求。同时提供通过柑橘类植物的遗传修饰以过度表达编码倍半萜合成酶来控制HLB的方法。因此，本发明总体上涉及在柑橘类植物中控制HLB的方法，其包括表达至少一种编码柑橘类植物中具有倍半萜合成酶活性的多肽的基因，以驱除柑桔木虱和/或非洲木虱昆虫来控制HLB，其中过度积累的倍半萜是β-石竹烯、α-可巴烯或、其组合。在该方法中，至少一种基因具有β_石竹烯合成酶和/或α-可巴烯合成酶活性。在某些实施方式中，至少一种基因的表达通过其自身的启动子和终止子区所驱动。在其它优选的实施方式中，至少一种基因的表达通过异源调节子区驱动，所述异源调节子区提供强的组成型组织专一或诱导型表达。更优选地，异源调节子区提供细胞溶胶、叶绿体或、线粒体中的强的组织专一的表达。在另外的实施方式中，本方法进一步包括表达编码法尼焦磷酸合成酶的基因，以增加由具有倍半萜合成酶活性多肽产生的倍半萜的积累。本发明也涉及控制柑橘类植物的黄龙病(HLB)的方法，包括施加至少一种纯化的倍半萜，其驱除柑桔木虱和/或非洲木虱昆虫，以控制柑橘类植物的HLB病，其中至少一种倍半萜选自石竹烯和α-可巴烯、或其组合。在该方法中，至少一种纯化的倍半萜由选自植物、细菌和酵母的生物进行纯化。在优选的实施方式中，至少一种纯化的倍半萜由番石榴植物纯化，优选地，番石榴植物的叶提取物。在一些优选的实施方式中，至少一种倍半萜通过缓慢的递送系统施加到柑橘类植物，所述系统如由昆虫学者用于递送信息素的那些。


图IA和B示出SEQ ID NOs: I和3的核苷酸序列以及EQ ID N0s:2和4蛋白质序列。图2示出由番石榴叶放出(上色谱)和提取(下色谱)的挥发性萜。图3示出从不同柑橘基因型的叶放出的挥发物的代表性的气相色谱分离。图4示出在不同发育阶段的番石榴叶放出的挥发物的代表性的气相色谱分离A，新条；B，幼小；C，成熟；D，老年。图5A示出SEQ ID NO:2的倍半萜的代表性的总离子色谱。测定用法尼焦磷酸作为底物体外表达的蛋白质粗提物进行。峰2对应于内标。图5B示出背景校正的峰I的TIC碎片图和从库得到的β_石竹烯的质谱的比较。图6示出分别在两臂和四臂气味测量计柑桔木虱对于柑橘挥发物土番石榴气味(A)和柑桔木虱对于番石榴挥发物对清洁空气(B)的选择的代表性百分比和数量。图7示出青蒿素(Artemisia annua)的β _石竹烯合成酶QHSl的氨基酸序列(登录号AAL79181)、薇甘菊(Mikania micrantha)的β -石竹烯合成酶的氨基酸序列(登录号ACN67535)、黄瓜(Cucumis sativus)的β -石竹烯合成酶的氨基酸序列(登录号AAU05952)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)的β_石竹烯/ α _蛇麻烯合成酶的氨基酸序列(登录号ΑΑ085539)、玉米(Zea mays)的(E) - β-石竹烯合成酶的氨基酸序列(登录号ABY79206)和稻(Oryza sativa)的(E) - β -石竹烯/ β -榄香烯合成酶的氨基酸序列(登录号ABJ16553)的对比。以黑色突出和以灰色突出的分别是这些序列中相同和相似的残基。图8Α和8Β青蒿素的β _石竹烯合成酶QHSl的氨基酸序列(登录号AAL79181)、薇甘菊的石竹烯合成酶的氨基酸序列(登录号ACN67535)、黄瓜的β -石竹烯合成酶的氨基酸序列(登录号AAU05952)、拟南芥的β -石竹烯/ α -蛇麻烯合成酶的氨基酸序列(登录号ΑΑ085539)的对比(Α)，以及玉米的(E)-β -石竹烯合成酶的氨基酸序列(登录号ΑΒΥ79206)和稻的(E) - β -石竹烯/ β -榄香烯合成酶的氨基酸序列(登录号ABJ16553)的对比(B)。以黑色突出和以灰色突出的分别是这些序列中相同和相似的残基。图9示出青蒿素的β_石竹烯合成酶QHSl的氨基酸序列(登录号AAL79181)、薇甘菊的石竹烯合成酶的氨基酸序列(登录号ACN67535)、黄瓜的β -石竹烯合成酶的氨基酸序列(登录号AAU05952)、香橙(Citrus junos) (E) - β -金合欢烯合成酶的氨基酸序列(登录号ΑΑΚ54279)、香橙萜烯合成酶的氨基酸序列(登录号AAG01339)、推定的葡萄柚(Citrus X paradise)職烯合成酶的氨基酸序列(登录号AAM00426)、和拟南芥的β-石竹烯/α-蛇麻烯合成酶的氨基酸序列(登录号ΑΑ085539)的比对。以黑色突出和以灰色突出的分别是这些序列中相同和相似的残基。设计用于扩增β_石竹烯合成酶基因的引物以下划线示出。图10示出对应于柑橘倍半萜合成酶的部分DNA序列(SEQ ID NO: 3)和应用RACE方法学快速扩增其5,-和3,-端的引物。图11示出拟南芥法尼焦磷酸合成酶I (FPPSl)的核苷酸和氨基酸序列(登录号X75789)的比对。下划线示出的是用于设计扩增编码功能FPP合成酶基因的全长cDNA的引物的序列。
具体实施例方式本发明涉及控制HLB的方法，其基于以下观察由番石榴叶产生的倍半萜驱除HLB媒介柑桔木風和/或非洲木風昆虫。萜烯是基于异戊二烯单元(C5H8)的不饱和烃，其可以是无环的或者环状的。倍半職是基于C15结构的職烯。番石榴，像其它芳香植物或精油植物一样，在它们的叶中积累了大量的倍半萜。典型地，倍半萜诸如石竹烯和α-可巴烯占由番石榴叶放出的挥发物的总量的50-60%。在番石榴植物中，倍半萜通常在叶和茎表面上的特定的解剖结构、腺毛或分泌腔中进行合成和积累。在植物中积累的倍半萜可以通过不同方式诸如蒸汽蒸馏法进行提取，所述蒸汽蒸馏法产生所谓的含有浓缩倍半萜的精油。在本发明的某些实施方式中，作为控制HLB的方法，从番石榴植物提取的至少一种倍半萜，优选地为β_石竹烯，通过喷洒或缓慢的递送系统施加到柑橘类植物。缓慢的递送系统已经由昆虫学家用于递送信息素。在这种系统中，纯的β-石竹烯放置在PVC树脂中，所述树脂保存和释放化合物。该树脂直接施加到果园中的柑橘树。其具有在3-4月的时间段期间中释放化合物的性能。植物天然提取物的价格和可用性依赖于丰富、油产量和植物的地理来源。由于它们结构的复杂性，通过化学合成生产单独的倍半萜分子通常被该方法的成本所限制，并且不总是化学上或财政上可行的。因此，生产倍半萜分子的生化途径的工程学需要倍半萜的生物合成的清楚的理解和分离编码涉及特定生物合成步骤的酶的基因的分离。植物中倍半萜的生物合成已经被广泛研究。所有萜烯的共同的五-碳前体是异戊烯焦磷酸(IPP)。催化导致IPP的步骤的大部分的酶已经进行了克隆和表征。IPP生物合成的两个截然不同的途径在植物中共存。甲羟戊酸途径在细胞溶胶和内质网中发现，而非-甲羟戊酸途径(或脱氧-5-磷酸木酮糖(DXP)途径)在质体中发现。在下一个步骤中，IPP通过异戊烯转移酶进行重复地浓缩形成倍半萜的无环异戊二烯基焦磷酸萜烯前体、法尼焦磷酸(FPP)。这些前体作为倍半萜合成酶的底物，所述酶可以催化复杂的多步环化。因此，β-石竹烯生物合成的第一个关键步骤是通过倍半萜合成酶的环化通用的倍半萜前体FPP。编码β-石竹烯合成酶的一组基因已经由植物克隆。这些合成酶常常涉及不同倍半萜的产生。例如，由拟南芥的β_石竹烯合成酶基因编码的单个蛋白质能够转化FPP成为倍半萜产物(-)-α-可巴烯、-蛇麻烯、和(-)-(Ε)-β-石竹烯(Chen 等人，Biosynthesis and emission ofterpenoid volatiles from Arabidopsis flowers, Plant Cell 15:481-494(2003);Tholl等人，Twosesquiterpene synthases are responsible for the complex mixture ofsesquiterpenes emitted from Arabidopsis flowers, The Plant J. 42:757-771 (2005))。玉蜀黍的β -石竹烯合成酶产生-榄香烯、-蛇麻烯、和(-)-(Ε) —石竹烯(Kollner等人，A maize (E) —caryophyllene synthase implicated in indirect defense responsesagainst herbivores is not expressed in most American maize varieties, The PlantCell20:482-494 (2008)) □ β -石竹烯合成酶已经从青蒿素(Cai等人，A cDNA clone forβ -caryophyllene synthase from Artemisia annua, Phytochem 61:523-529(2002))、黄瓜(Mercke 等人，Combined transcript and metabolite analysis reveals genesinvolved in spider mite induced volatile formation in cucumber plants, PlantPhys. 135:2012-2024)、稻(Cheng 等人，The rice (E)—caryophyllene synthase (0sTPS3)accounts for the major inducible volatile sesquiterpenes,Phytochem68:1632-1641 (2007))和牛至(Degenhardt 等人，Restoring a maize root signalthat attracts insect-kiIling nematodes to control a major pest, PNAS106:13213-218(2009))中分离。编码倍半萜合成酶的嵌合基因已经被用于遗传转化植物，目的是吸引/驱除传粉者(Kessler 等人，Field experiments with transformed plants reveal thesense of floral scents, Science 321:1200-1202 (2008))、吸引害虫杀死昆虫(Kappers等人,Genetic engineering of terpenoid metabolism attracts bodyguards toArabidopsis, Science 309:2070-2072 (2005) ; Schnee 等人，The products of a singlemaize sesquiterpene synthase form a volatile defense signal that attractsnatural enemies of maize herbivores, PNAS 103:1129-1134(2006))和线虫类(Degenhardt 等人，Restoring a maize root signal that attracts insect-killingnematodes to control a major pest, PNAS 106:13213-218 (2009))，且直接杀死害虫(Wu 等人，Redirection of cytosolic or plastidic isoprenoid precursors elevates
6terpene production in plants, Nature Biotechnology, 24:1441-1447 (2006)),表明针对增加这种倍半萜、包括β_石竹烯的积累的转基因策略可以是生态上合理选择，其单独或者与杀虫剂的减少使用进行组合，将预防由害虫传播的破坏性疾病引起的损坏。本发明的一个实施方式涉及编码柑橘类类物、属于芸香科植物的柑橘类相关植物、番石榴、桃金娘科的番石榴相关的植物、或任何其它生物体的倍半萜合成酶的核酸的分离。如本文使用，倍半萜合成酶是催化倍半萜合成的任何酶。一个人可以确定由本发明的核酸编码的多肽是否具有倍半萜合成酶活性，通过在本文实施例中描述的酶表征试验。在本发明的合适的实施方式中，核酸选自(a)包含基本如在SEQ ID NO: I中说明的核苷酸序列的核酸；或(b)编码基本如在SEQ ID N0:2中说明的多肽的核酸，其中由所述核酸编码的多肽具有倍半萜合成酶活性。在本发明的核酸的另一个实施方式中，核酸选自(a)包含基本如在SEQ ID N0:3中说明的核苷酸序列的核酸；或(b)编码基本如在SEQ ID N0:4中说明的多肽的核酸，其中由所述核酸编码的多肽具有倍半萜合成酶活性。优选地，本发明的核酸和/或多肽从柑橘类植物中分离。在一个实施方式中，核酸从番石榴植物中分离。优选地，根据本发明的核酸包括SEQ ID NO: I。在具体实施方式
中，本发明涉及某些分离的核苷酸序列，其包括基本没有污染内源性材料的那些。术语“核酸”或“核酸分子”指以单链或双链形式的脱氧核糖核酸或核糖核酸聚合物，除了另外限定，其将包含天然核苷酸的已知类似物，所述类似物可以以类似于天然存在的核苷酸方式起作用。“核苷酸序列”也指多聚核苷酸分子或寡核苷酸分子，以分离片段的形式或者作为较大核酸的成分。本发明的一些核酸分子来源于DNA或RNA，从前至少以基本纯的形式和以实现通过标准生物化学方法进行其组成核苷酸序列的鉴定、操作和回收的量或浓度。这些方法的实例，包括如在本文可以使用的PCR方案的方法，所述方法在以下公开Sambrook 等人·，Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd ed. , ColdSpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989),由 F. A. Ausubel 等人编辑的 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1987)，，和Innis, M.等人编辑，PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications, AcademicPress (1990)。如本文描述，本发明的核酸分子包括以单链和双链形式的DNA，以及RNA其补体。DNA包括，例如，cDNA、基因组DNA、化学合成DNA、通过PCR扩增的DNA、和其组合。基因组DNA，包括翻译、非翻译和控制区，可以通过常规技术分离，例如，使用本发明的任一的cDNAs、或其合适片段，作为探针，以鉴定一块基因组DNA，其然后可以使用本领域公知的方法进行克隆。一般而言，在本发明的范围内的核酸分子包括与本发明的序列在本发明的序列的双链DNA解链温度以下5° CUO0 C、15° C、20° C、25° C、或30° C的温度进行杂交的序列，包括在这些范围内包含的任何范围的条件。在另一个实施方式中，本发明的核酸包括基本如在SEQ ID NO: I活SEQ ID NO: 3中说明的序列。在一个实施方式中，核酸是与SEQ ID NO: I活SEQ ID N0:3的核苷酸至少是70%、至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%是相同的，并且每个核酸编码具有倍半萜合成酶活性的蛋白质，例如，如所证明，在实施例中描述的酶测定中，与由SEQ ID N0:1活SEQID N0:3编码的多肽相比，具有增加的稳定性和功效。在一个实施方式中，核酸包括核苷酸序列SEQ ID N0:1。在另一个实施方式中，核酸包括核苷酸序列SEQ ID N0:3。在还另一个实施方式中，核酸包括SEQ ID N0:1或SEQ ID NO:3的至少50、100、250、500、或750邻接核酸的连续一段序列。这些核苷酸的连续片段也可以包含至少一个突变，只要突变体序列保持源序列的功能性以及低或高严谨条件下与这些核苷酸杂交的能力，诸如，例如，在中等或高严谨条件下。例如，这些片段可以来源于SEQ ID N0:1或SEQ IDNO: 3 的(nt)200 至 nt 1700、nt 800 至 nt 1700、nt 1000 至 nt 1700、nt 200 至 nt 1000的核苷酸。如上描述，通过本发明的核酸编码的多肽被本发明所包含。本发明的分离的核酸可以选自编码基本如在SEQ ID N0:2或SEQ ID NO:4中说明的多肽的核酸。在一个实施方式中，多肽与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4至少40%、至少55%、至少70%、至少85%、至少90%、或至少95%同一的，且所述多肽具有倍半萜合成酶活性，例如，如在以下描述酶测定中证明的。由于遗传密码的简并性，其中多于一个密码子可以编码相同氨基酸，多个DNA序列可以编码相同多肽。这种变体DNA序列可以产生于遗传漂变或人工操作(例如，在PCR扩增期间出现或者作为天然序列的故意突变发生的产物)。因此，本发明包括衍生自SEQ IDNO: I或SEQ ID NO: 3的任何核酸，能够编码基本如在SEQ IDN0:2活SEQ ID NO: 4中说明的多肽。天然序列的故意突变发生可以使用本领域熟知技术多个技术实现。例如，可以应用寡核苷酸定向特定的突变发生步骤，特别是当期望突变基因，使得预定的限制核苷酸或密码子通过替代、缺失或插入进行变更。做这种变更的示例性方法在以下公开=Walder等人(Gene 42:133，1986);Bauer 等人(Gene 37:73, 1985);Craik(BioTechniques, Jaη. 12-19, 1985);Smith 等人(Genetic Engineering!Principles and Methods, PlenumPress, 1981) ; Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488，1985) ; Kunkel 等人(Methods inEnzymoI. 154:367，1987);以及美国专利号 4，518，584 和 4，737，462。在一个实施方式中，本发明提供分离的多肽。如本文使用，术语“多肽”指包含一类在本文鉴定的氨基酸序列的多肽或肽片段以及较小片段。可选地，多肽可以根据对于本发明的核酸序列编码的任何多肽的其抗原相关性进行定义。因此，在一个实施方式中，在本发明的范围内的多肽被定义为含有与本发明的核酸序列的编码的任何多肽具有共同的线性或3-维表位的氨基酸序列。可选地，在本发明的范围内的多肽通过抗体进行识别，所述抗体专一地识别由本发明的核酸序列编码的任何多肽。抗体被定义为专一结合，如果它们以大于或等于大约IO7M4的1^结合本发明的多肽，例如大于或等于IO8M'如本文所指的多肽“变体”指与天然多肽基本同源性的多肽，但是其具有不同于任一本发明的核酸序列编码的氨基酸序列，由于一个或多个缺失、插入或替代。变体可以包括保守替代的序列，指特定氨基酸序列被具有类似的物理化学特征的残基替代。保守替代的实例包括一种α残基替代另一种，例如，lie、Val、Leu、或Ala替代另一个，或者一种极性残基替代另一种，例如在Lys和Arg之间；Glu和Asp ;或Gln和Asn0 参见，Zubay, Biochemistry, Addison-ffesley Pub. Co. , (1983)。这种替代的作用可以使用替代得分矩阵如PAM-120、PAM-200、和PAM-250进行计算，如在Altschul中(J. Mol.Biol. 219:555-65, 1991)描述。其它这种保守替代，例如，具有类似的疏水特征的整个区域的替代，是熟知的。天然出现多肽变体也被本发明所包含。这种变体的实例是产生于交替的mRNA剪接事件或产生于本文描述的多肽的蛋白酶剪切的蛋白质。可归因于蛋白酶解的变体，例如，包括在N-或C-端中差别，当在不同类型的宿主细胞中表达时，由于蛋白水解从本发明的序列编码的多肽中去除一个或多个末端氨基酸。本发明的倍半萜合成酶的变体可以用于达到期望的增强或减小的酶活性，改进区域化学或立体化学，或者更改底物利用或产物分布。而且，可以制备变体以具有至少一种改进的性质，例如，对于底物增加的亲和力，对于一种或多种期望化合物的产物的提高的专一性，不同的产物分布，不同的酶活性，酶反应的速度的增加，在特定环境(pH、溶剂等等)中更高的活性或稳定性、在期望的表达系统中提高的表达。位点定向突变的变体可以通过本领域任何方法制备。如以上说明，本发明提供重组和非重组、分离和纯化的多肽，诸如来自番石榴或柑橘植物。天然多肽的变体和衍生物可以通过分离其它或相同植物系或种天然存在的变体、或者变体的核苷酸序列得到，或者通过人工编程编码天然番石榴或柑橘多肽的核苷酸序列的突变。天然氨基酸序列的变更可以通过任一的多种常规方法实现。因此，本发明提供制备变体功能性倍半萜合成酶的方法，所述方法包括以下步骤(a)从SEQ ID NO: I或3中选择任一核酸，(b)变更核酸序列以得到突变突变体核酸的种群，和(c)用突变体核酸转化宿主细胞以表达多肽，和(d)筛选具有至少一种改进性能的功能性多肽的多肽。改进的性能可以是任何期望的性能，例如，上述性能。例如，选择的核酸更改可以通过随机突变、位点定向突变或DNA改组进行。更改可以是至少一个点突变、缺失或插入。例如，具有通过由改组技术得到的核酸编码的氨基酸序列的多肽，包括SEQ ID NO: I或3的至少任一个，也被本发明所述所包含。根据本发明的这个实施方式的方法的步骤，诸如筛选功能多肽的多肽，是本领域技术人员熟知的，其将常规地使已知方案适应期望的特定的改进性能。例如，突变可以通过合成含有突变体序列的寡核苷酸在特定的基因座引入，实现与天然序列的片段的连接的限制位点位于侧面。在连接后，得到尘垢的序列编码具有期望的氨基酸插入、替代、或缺失的类似物。可选地，寡核苷酸定向位点专一的突变步骤可以使用以提供更改的基因，其中预定的密码子可以通过取代、缺失或插入更改。本发明也包括从更改的本发明的核酸得到核酸，例如，为了得到变体多肽。在本领域中有数种用于产生转基因植物的方法。这些包括，但是不限于植物原生质体的电穿孔、脂质体介导的转化、土壤杆菌属介导的转化(Agrobacterium-mediatedtransformation)、聚乙二醇介导的转化、植物细胞的显微注射、和使用病毒的转化。在一个实施方式中，使用土壤杆菌属介导的转化。根癌土壤杆菌属介导的转化是用于转化柑橘类植物的最常用的方法。它使用在其基因组中携带感兴趣的基因(一个或多个)的解甲的根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens-mediated)菌株作为载体，以通过共培养转化柑橘细胞或组织几天。自然通过土壤杆菌种作物系统进行基因转化，以在感染的植物细胞中插入它们的DNA的片段。通过植物中细菌转化的基因的表达导致植物中冠瘿瘤的引出，通常在受伤部位。在根癌土壤杆菌中，转化的DNA称为T-DNA和其存在大质粒中，称为Ti (来自肿瘤诱导)质粒。解甲的Ti质粒可以通过去除参与肿瘤形成的T-DNA基因进行加工。然后，具有合适调节区的异源基因可以插入新的嵌合T-DNA中，一旦在携带解甲的Ti质粒土壤杆菌细胞中并入，可以用于在植物细胞中整合和表达外源基因。通过使用标准组织培养系统，从转化植物细胞再生整个转基因植物是可能的。通过粒子轰击的直接基因转移提供转化植物组织的另一种实例。在这种技术中，用DNA包被的颗粒、或微粒被射出穿过细胞的物理屏障。粒子轰击可以用于将DNA引入任何目标组织，所述组织通过DNA包被的颗粒是可穿透的，但是对于稳定的转化，使用可再生细胞是必要的。典型地，颗粒是由金或钨制成。使用在本领域熟知的CaCl2或乙醇沉淀法，颗粒用DNA包被。DNA包被的颗粒射出颗粒枪之外。合适的颗粒枪可以从Bio-RadLaboratories (Hercules, Calif.)购买。颗粒穿透通过变化的参数进行控制,诸如爆炸性破裂的强度、颗粒的大小、或者到达目标组织颗粒必须行进的距离。用于包被颗粒的DNA可以包括适合于引发感兴趣的基因表达的表达盒，其将包括可操作连接到感兴趣基因的启动子。提供粒子轰击进行直接基因转移的方法在Tomes等人的美国专利号5，990，387中公开。在一个实施方式中，转染的DNA整合入染色体或者非-人生物，诸如稳定的重组系统结果。在本领域已知的任何染色体整合方法可以在本发明的实施中使用，包括但不限于重组酶介导性序列盒交换(RMCE)、病毒位点特异性染色体插入(viral site specificchromosomal insertion)、腺病毒、和前核注射。除了在操作实例中外，或当另外指出外，在本说明书和权利要求书中使用的成分、反应条件等等所有数字表达的数量应该被理解为在所有情况下被术语“大约”所述修饰。因此，除非相反地支持外，在本说明书和权利要求书中说明的数字参数是近似值，并且其可根据本发明寻求得到的期望的参数进行变化。至少，不是作为试图对于权利要求的范围的等同物原则的应用的限制，每个数字参数应该根据有效数字的数量和普通四舍五入方法进行解释。尽管说明本发明的宽范围的数值范围和参数是近似值，但是在特定实例中说明的数值是尽可能精确地进行报道。然而，任何数值固有地包含一些误差，必然产生于它们各自测试测量中发现的标准偏差。以下实施例意欲说明本发明、因此没有限制发明的。百分比
是基于重量给出。除非另外定义，在本文使用的所有技术和科技术语具有本发明领域的普通技术人员所理解的相同含义。虽然与本文描述类似或等同的任何方法和材料也可以在实施本发明中使用，但是示例性方法和材料为了说明目的进行描述。在本申请中提到的出版物通过引用并入，以公开和描述连同出版物中引用的方法和/或材料。另外，在本文讨论的出版物仅提供用于在本申请的申请日之前的它们的公开内容。在本文没有东西被解释为承认由于现有的发明，本发明不具有先于这些出版物的权利。进一步地，提供的出版物的日期可能不同于实际出版日期，实际出版日期可能需要独立地确认。实施例
以下实施例意欲说明本发明的优选的实施方式，因此没有限制范围。材料在本实施例中使用柑橘类植物从柑橘种质自然库(Citrus Germplasm Bank)(Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias(IVIA), Moncada, Valencia, Spain)得到。番石榴种子从越南和巴西的当地种植者得到，并且在IVIA的温室中进行生长。番石榴成材植物来自于巴伦西亚(西班牙)的理工大学和植物园(PolitechnicalUniversity and Botanical Garden)。实施例I柑橘和番石榴植物的叶挥发物含量和放出的分析研究不同基因型(番石槽(Psidium guajava)、柑桔(Citrus sinensis)、来檬(Citrus aurantifolia)和克莱门柚(Citrus Clementina))的叶中挥发物含量和放出。使用在不同发育阶段的叶进行分析，所述叶在每天的不同时刻和不同季节中进行收集。每个样品至少分析四次(两次生物重复加上两次技术重复)。为了测定挥发物含量，收集的页组织立即在液氮中冷冻和在-80° C中贮存，直到提取。冻结材料(200mg)在螺纹阀帽派热克斯耐热玻璃管中称重，随后立即加入3mL的冷却的戊烷。样品在冰上用Yellowline均质器(型号DI25)均质30s。悬浮液涡旋15s，然后加入3mL的Milli-Q水，进一步涡旋30s和在4° C 1800g离心lOmin。有机相用巴斯德吸管回收，而水相用3mL的戊烷重新提取两次。等分的2L汇集的有机相直接注射入GC-MS用于挥发物分析(参见以下)。当液上气体分析给出植物放出和对于植物挥发物应答的昆虫发觉到的挥发物情况的更真实写照时，进行固相微提取(SPME)设备的静态液上取样。页样品装入50mL螺纹阀帽派热克斯耐热玻璃管中，在其顶部具有隔膜和含有ImL的milli-Q水用于避免页氢压力(leaf hydric stress)。SPME 纤维(100m 聚二甲娃氧烧，Supelco, Bellefonte, PA)暴露，在22°C的控制温度、在I和4小时之间。随即，纤维转移到GC注射器(220° C)和热解吸延长至4分钟。结果显示通过挥发物含量鉴定的主要化合物也是由叶放出的主要挥发物(代表性实例，参见图2)。如在文献中描述，柑橘叶含有和放出的超过80%的总的挥发物是单萜烯，在所有分析的基因型和取样日期中里哪醇是最丰富的一种(图3)。在这些样品中，β -石竹烯没有检测到或以非常低浓度检测到且不是在所有重复中。在番石榴叶中，倍半萜是主要的挥发物，且在所有分析的样品中，β_石竹烯占总化合物至少50%(图4)。实施例2GC-MS分析使用耦合到Thermo DSQ质谱仪的电子电离模式(EI)，所述质谱仪具有在70eVA。离子源和输送线分别在200和260°C。挥发物化合物在HP-INNOWax (Agilent J&C Columns)柱(30mx0. 25mm i. d. xO. 25m膜)上分离。柱温度编程5分钟40°C上，以5° C mirT1上升到150°C，然后20° C mirT1上升到250°C，并在250°C保持2分钟。注射器温度为220°C。氦气是载气，在无分流模式中I. 5mL mirT1。电子轰击质谱在30-400原子质量单位范围记录,具有0. 5scans^的扫描速度。化合物通过获得的质谱与在参考库(NIST，MAINLIB, REPLIBT)中贮存的那些匹配、或者当可得时来自可信标准化合物的那些进行匹配鉴定。实施例3亚洲柑桔木虱(D. citri)对番石榴挥发物的应答设计一系列试验，为了研究番石榴叶挥发物对于亚洲柑桔木虱行为的影响。混合性的成虫亚洲柑桔木虱从柠檬(C. Iimonia)幼苗上的连续培养培养物得到，所述幼苗维持在巴西柑橘生产行业协会(阿拉拉夸拉，巴西)，在25± I ° C、70± 10%相对湿度和L14:D10A光周期。具有一个12. 5cm长的入口臂和两个21. Ocm长的试验臂(O. 6cm内径)的Y-管嗅觉器用于行为测定。碳净化空气(颗粒状4_8mm. Applichem GmbH, Darmstadt, Germany)通过两个2L的含有挥发物源的玻璃瓶泵入，所述挥发物源由空气或番石榴幼苗组成。在10分钟后测定40个木虱，具有已经被传递10. Ocm的那些记录为“应答的”。结果显示，番石榴挥发物驱除或固定木虱、或者限制柑橘吸引(图6A)。使用四臂嗅觉器进行进一步研究。碳净化空气通过穿过充满水的玻璃杯(IL)的通路进行加湿和分离成为四个流(0.4L mirT1)，其每一个指向四嗅觉器领域中的一个。流入嗅觉器的测试领域中的空气穿过含有样品或净化空气的玻璃杯(IL)，在每个试验中测定40个木虱，且每个试验至少每个重复三次进行。番石榴对净化空气的结果显示番石榴挥发物具有驱除作用(图6B)。β -石竹烯(纯度 >98. 5%; Sigma-Aldrich, Germany)和 α -可巴烯(纯度>90. 0%; Sigma-Aldrich, Germany)对于亚洲柑桔木風的作用使用四臂嗅觉器也进行了评估。在每次观察中，木虱放置在嗅觉器的中间，所述嗅觉器被来自其四个伸长臂中的每一个的空气所渗透。在两个臂中，泵入净化空气，同时在剩下的臂中，通过含有IOL的纯化合物的玻璃容器泵入空气。每次观察持续5分钟，并且记录每个单独木虱的最后选择。使用至少29个木虱用于研究对于每种化合物的应答。在净化空气的初步试验中，在臂之间没有得到显著差别，显示它们所有都是等同的，并且在选择试验中没有引入任何偏差。用β-石竹烯和α -可巴烯进行的测定显示较高浓度的木虱进入无气味的臂，设想这些化合物的驱除作用(表I)。表I
权利要求
1.控制柑橘类植物中HLB的方法，包括在柑橘类植物中表达编码具有倍半萜合成酶活性多肽的至少一种基因，以驱除柑桔木虱和/或非洲木虱昆虫来控制HLB，其中过度积累的倍半萜是石竹烯、α-可巴烯、或其组合。
2.根据权利要求I所述的方法，其中由所述至少一种基因编码的多肽具有石竹烯合成酶和/或α -可巴烯合成酶活性。
3.根据权利要求I所述的方法，其中所述至少一种基因具有一个或多个突变，与其野生型相比，其中由所述至少一种基因编码的多肽保留倍半萜合成酶活性，且其中由所述至少一种基因编码的多肽具有增加的稳定性和功效。
4.根据权利要求I所述的方法，其中所述至少一种基因的表达由组成型启动子和终止子区驱动。
5.根据权利要求I所述的方法，其中所述至少一种基因的表达由异源调节子区驱动，所述异源调节子区提供强的组成型组织专一或诱导型表达。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述异源调节子区提供细胞溶胶、叶绿体或、线粒体中的强的表达。
7.根据权利要求I所述的方法，其进一步包括表达编码法尼焦磷酸合成酶的基因，以增加由具有倍半萜合成酶活性多肽产生的倍半萜的积累。
8.控制柑橘类植物的黄龙病(HLB)的方法，包括施加至少一种纯化的倍半萜，其驱除柑桔木虱和/或非洲木虱昆虫，以控制柑橘类植物的HLB病，其中所述至少一种倍半萜选自β-石竹烯和α-可巴烯、或其组合。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述至少一种纯化的倍半萜由选自植物、细菌和酵母的生物进行纯化，或其遗传改性的负体能够过量产生这些倍半萜化合物。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述至少一种纯化的倍半萜由番石榴植物纯化。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述至少一种纯化的倍半萜由番石榴植物的叶、果或茎提取物纯化。
12.根据权利要求8所述的方法，其中所述至少一种纯化的倍半萜通过缓慢递送系统施加到所述柑橘类植物。
全文摘要
本发明提供通过在柑橘类植物中表达编码倍半萜合成酶的基因控制柑橘类植物的黄龙病(HLB)的方法，所述倍半萜诸如β-石竹烯、α-可巴烯和其组合。也公开控制HLB的方法，其包括施加至少一种驱除柑桔木虱和/或非洲木虱昆虫的纯化的倍半萜，以控制柑橘类植物的HLB病。
文档编号A01N65/28GK102933084SQ201080058337
公开日2013年2月13日 申请日期2010年10月26日 优先权日2009年10月28日
发明者贝特拉·阿尔克萨·加西亚, 阿纳·罗德里格斯·拜绍利, 何塞普·佩里斯·罗德里戈, 莱安德罗·培尼亚·加里亚, 安德烈娅·恩里克, 马塞洛·佩德雷拉·德米兰达, 佩德罗·隆夫·山本, 马塞尔·贝拉托·斯波西托, 内尔松·阿尔诺·伍尔夫, 迪瓦·多卡尔莫·泰克塞拉, 安东尼奥·茹利亚诺·艾雷斯, 牛顿·卡瓦尔坎蒂·德诺罗尼亚二世, 若泽·毛里西奥·西蒙斯·本托, 若泽·罗伯托·波斯塔利·帕拉 申请人:柑橘病虫害预防基金会, 瓦伦西亚农业研究所