专利名称：一种用于细叶百合组织培养的培养基的制作方法
技术领域：
本发明属于植物生物技术领域，具体地说，涉及一种细叶百合(Lilium pumilum) 的组织培养中各个阶段的培养基。本发明筛选出用于细叶百合组织培养中不同时期的最佳培养基，确定了培养基中各激素的配比，按照本发明的配方配制的培养基可满足了细叶百合各个时期的营养需要和生长发育。
背景技术：
细叶百合(Lilium pumilum)又名山丹花，是百合科百合属多年生鳞茎类花卉。细叶百合生长在干旱、半干旱地区，有顽强的生命力，可以在野外顺利越冬，在雨水少、无浇灌的情况下也能正常生长，在性能和美观上都能达到绿化的要求，可以在抗旱绿化景观中加以利用和推广。但由于来自人类或非人类两方面的威胁，使其种群未能在自然条件下大量繁殖，数量极少且存在着自然退化问题。解决的办法就是启动对细叶百合的组织培养，这是快速繁殖和脱毒复壮的有效方法。百合的组织培养始于20世纪50年代，自1957年RcAb首次用百合鳞片进行组织培养获得成功后，百合离体繁殖技术日益成熟，优良品种的快速繁殖、新品种培育以及种质资源保存等方面发展较快。迄今为止，国内外组织培养成功的百合种及品种已超过数百个， 但多见于报道的是用于鲜切花生产的栽培品种，对中国野生百合的组织培养研究较少。总结近20年来的文献数据，仅十余种野生百合组织培养成功，有关细叶百合的更是屈指可数。在实验室条件下，控制细叶百合的生长和繁殖是一项需实践去摸索和探讨的新课题。现有技术可以参考的资料不多，都必须通过试验来逐一解决，关键要解决外植体取材部位、时期；各培养时期培养基的选择；培养条件以及成苗后快繁技术等。用我国丰富的野生资源进行品种创新，应用多样化的育种手段，在重视常规杂交育种的基础上，结合现代生物技术手段进行新品种选育，同时以脱毒组培种苗作为生产性原种来进行种球的工厂化开发，是百合组织培养的发展方向。细叶百合的人工繁殖仍主要采用分植小鳞茎、播种法及鳞片扦插法，繁殖数量有限且极易导致病害感染和品质退化。但目前可用于解退化问题和更新复壮的组织培养法繁殖研究较少，因此深入开展细叶百合组织培养研究已成为科研工作者亟待进行的工作之一。组织培养法繁殖取材方便，不受自然条件的限制，可以不断进行大量繁殖，是细叶百合引种栽培、快速繁殖、脱毒复壮以及新品种培育的最有效方法，可以在短期内获得大量小苗，解决了栽培中种源较少的问题，为细叶百合今后的研究以及规模化、产业化开发利用提供了理论依据。目前国内外诸多学者对百合的组织培养也进行了研究，目前已应用于百合生产中，但多见于报道的是栽培品种用于鲜切花生产的，培养基和方法并不适用于细叶百合，本发明系统地研究了细叶百合组培中不同阶段的最佳培养基，此培养基还可适用于野生卷丹百合和部分栽培百合
发明内容
组织培养的完整过程一般分为制定培养方案、外植体选择与处理、接种、初代培养、继代培养、壮苗与生根培养、试管苗的驯化移栽等几个技术环节。组织培养在离体培养条件下，不同植物以及同种植物不同部位的组织细胞对营养要求不同，只有满足了它们各自的特殊要求，才能更好地生长发育。而掌握培养基的配制及筛选方法是取得组培成功的关键环节之一。本发明的目的是筛选出用于细叶百合组织培养中不同时期的最佳培养基，确定了培养基中各激素的配比，按照本发明的配方配制的培养基可满足了细叶百合各个时期的营养需要和生长发育。本发明在进行了信息搜集、汇总与分析的基础上制定了实施方案，全面、多方位的进行组培实验，本发明筛选了从初代诱导一继代增值一生根培养一结球培养等不同时期的培养基。使初代、增殖、生根和结球各个时期的培养达到最佳效果。本发明的实施方案包含细叶百合整个组织培养过程中各生育期的最佳培养基，它们是经过周密、反复多次试验得出的，是在基本培养基的基础上根据细叶百合各生育期的需要添加了不同类型的植物生长剂和不同的配比。在本发明的实施方案中，提供了一种细叶百合(Lilium pumilum)组织培养过程各阶段所需的培养基，其特征在于，该培养基由初代诱导培养基、增殖培养基、生根培养基、结球培养基组成。这些细叶百合组培各个阶段最佳培养基是经过比较试验筛选出的。本发明的实施方案之一是提供了一种细叶百合(Lilium pumilum)的初代诱导培养基MS+6-BA lmg/L+NAA 0. lmg/L+Vc 5mg/L。通过研究发现，无激素的培养基对小鳞茎的诱导作用很小，常用激素有NAA、6-BA等。其中NAA及IAA有利于根的形成；而6-BA对于芽的诱导是不可缺少的成分，但6-BA浓度过高时，虽然分化出的小鳞茎球状突起多，但很细弱，最终为玻璃化的无效苗，NAA/6-BA影响初代培养中根或芽的分化程度，从而筛选出最佳初代诱导培养基的配方为 MS+6-BA 1. Omg/L+NAA 0. lmg/L+Vc 5mg/L。本发明的实施方案之一是提供了一种细叶百合(Lilium pumilum)的增殖培养基MS+6-BA 0. 2mg/L+NAA 0. 01mg/L。通过研究发现，同样高浓度的6_BA对百合鳞茎增殖有抑制作用，浓度过高，可抑制芽的生长，随着6-BA浓度的增高，当6-BA浓度超过2. Omg/ L时，丛生矮化明显，易产生玻璃化苗。筛选出的最佳增殖培养基配方为MS+6-BA 0. 2mg/ L+NAAO. 01mg/L。本发明的实施方案之一是提供了一种细叶百合(Lilium pumilum)生根培养基 1/2MS+IBA 0.5mg/L。从生根培养20天的试验结果来看，低盐浓度对野生百合根的生长有利，适宜生根的培养基的配方是V2MS+IBA 0. 5mg/L。本发明的实施方案之一是提供了一种细叶百合(Lilium pumilum)结球培养基: 1/2MS+IBA 0. 5mg/L+白糖2%。通过研究发现，细叶百合无论是在MS还是在1/2MS培养基中，食用白糖的质量/体积百分比含量增加，对结球都有促进作用，相比1/2MS+IBA 0. 5mg/ L+白糖2 %更为理想，结球数量多，鳞茎较大，移植出苗率效果最佳。在本发明实施方案中，在本领域技术人员公知范围内，NAA、6_BA、IBA、V。分别是萘乙酸、6-苄氨基嘌呤、吲哚丁酸、维生素C的简称。本发明选出的细叶百合整个组织培养过程中各生育期的最佳培养基能充分满足了细叶百合各个时期的营养需要和生长发育，是保证细叶百合组织培养成功实施，达到流程化生产的关键和核心，为细叶百合再生体系的建立和规模化生产提供了强有力的支持。
具体实施例方式实施例1.细叶百合的材料和筛选统计方法实验用的细叶百合于采自呼和浩特市近郊区大青山，将采集到的鳞茎种植于本公司的试验苗圃，根据试验进展、不同时期取样并随时取样补充。外植体为细叶百合的鳞茎。以MS为基本培养基，用3. 5g/L的卡拉胶作固化剂，3 %的食用白糖代替蔗糖作为碳源，以自来水代替蒸馏水，分别添加不同配比的细胞分裂素和生长素进行培养基的筛选。实施例2.细叶百合组培各个阶段最佳培养基的筛选1、诱导分化培养基的选择将6-BA 的浓度设 0. 2mg/L、0. 5mg/L、l. 0mg/L、2. Omg/L 五个浓度梯度，NAA 的浓度设0. Img/L、0. 2mg/L、0. 3mg/L、0. 5mg/L四个浓度梯度，进行不同组配，接种时每瓶接一片
鳞茎，观察鳞片在不同培养基上不定芽的发生情况。从表1可见，7种激素组合均可诱导百合鳞片分化小鳞茎，但各个组合的分化率不同，1号MS+6-BA 0. lmg/L+NAA 0. lmg/L是细叶百合鳞片培养基是最佳的诱导培养基，不但诱导率高，而且每个外植体新增芽数多，分化率最高，其分化率可达60. O %。具体统计公式为成活率=有生活力的外植体数/接种的外植体总数)X 100%初代芽诱导率=(出芽的外植体数/接种的外植体总数)X 100%继代增殖倍数=(诱导出的丛生芽数/接入单株芽的总数)X 100%生根率=(分化根的外植体数/接种的外植体总数)X 100%小鳞茎诱导率=(分化小鳞茎的外植体数/接种的外植体总数)X 100%表1激素浓度及其组合对细叶百合鳞片不定芽诱导的影响
权利要求
1.细叶百合(Liliumpumilum)组织培养过程各阶段所需的培养基，其特征在于，该培养基由初代诱导培养基，继代增殖培养基，生根培养基，结球培养基组成。
2.权利要求1中所述的初代诱导培养基，其组成为含1.0mg/L6-BA,0. lmg/L NAA， 5mg/LVc的MS培养基。
3.权利要求1中所述的增殖培养基，其组成为含0.2mg/L 6-BA,0. Olmg/LNAA的MS培养基。
4.权利要求1中所述的生根培养基，其组成为含0.5mg/L IBA的1/2MS培养基。
5.权利要求1中所述的结球培养基，其组成为含0.5mg/L IBA,附加2%白糖的1/2MS培养基。
全文摘要
本发明筛选出用于细叶百合(Lilium pumilum)组织培养中不同阶段的最佳培养基，确定了培养基中各激素的配比，按照本发明的配方配制的培养基可满足了细叶百合各个时期的营养需要和生长发育。这些培养基分别为由MS、1.0mg/L 6-BA、0.1mg/LNAA组成的初代诱导培养基，由MS、0.2mg/L 6-BA、0.01mg/L NAA组成的继代增殖培养基，由1/2MS、0.5mg/LIBA组成的生根培养基，由1/2MS、0.5mg/L IBA、2％糖组成的结球培养基。
文档编号A01H4/00GK102210266SQ20111007133
公开日2011年10月12日 申请日期2011年3月24日 优先权日2011年3月24日
发明者姚裕琪, 梁德霖, 王召明 申请人:内蒙古和信园蒙草抗旱绿化股份有限公司