专利名称：：甜高粱组织培养的方法及其专用培养基的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物
技术领域：
，特别涉及一种甜高粱组织培养的方法及其专用培养基。
背景技术：
：高粱(Sorghumbicolor(L.)Moench)是世界范围内继小麦、水稻、玉米和大麦之后位居第五位的重要谷物。长期以来，在亚洲、非洲和美洲的高温少雨地区，高粱作为一种多用途作物而被广泛种植，以提供粮食、饲料、燃料、酿酒以及工业用淀粉。由于化石能源资源的大量使用所带来的能源资源枯竭、环境污染，以及面临全球C02减排的巨大压力，生物质能源的需求在不断增加。甜高粱作为高粱的一个变种，由于其茎秆汁液中富含糖分，生物量高，抗逆性强，已成为一种重要的能源作物正逐渐受到人们的极大关注。直到现在，对甜高粱农艺性状的改良主要还是通过传统的植物育种方法，而遗传转化技术的应用必将极大地促进甜高粱的种质改良。此外，甜高粱的遗传转化在甜高粱分子遗传学和分子育种等基础理论研究中也处于重要的地位。常用的基因枪或者农杆菌介导的遗传转化方法都依赖于植物组织培养技术，而高效的离体培养再生体系的建立是成功实现遗传转化的前提和保证。高粱被认为是组织培养及再生最困难的植物之一。因此，高粱的遗传转化研究远远落后于其他谷类作物。尽管国内外有以高粱幼穗、幼胚、成熟种子、茎尖分生组织、成熟胚等作为外植体而建立高粱再生体系的报道，但由于基因型依赖性反应、酚类或者色素物质的产生，其再生效率低并遇到炼苗困难等问题。
发明内容本发明的目的在于提供一种愈伤组织诱导培养基。本发明提供的愈伤组织诱导培养基是在MS基本培养液的基础上，添加如下物质得到的培养基水解酪蛋白、脯氨酸、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、维生素C、2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)、ZT(玉米素)、蔗糖和凝胶剂。上述MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示；表1.MS基本培养液的溶质<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>愈伤组织诱导培养基中水解酪蛋白的终浓度为0.3-lg/L，脯氨酸的终浓度为0.3-lg/L，PVP的终浓度为50-200mg/L，维生素C的终浓度为5_20mg/L，2，4_D的终浓度为1.Omg/L-4.Omg/L，ZT的终浓度为0.l_4mg/L，蔗糖的终浓度为20_40g/L。进一步，愈伤组织诱导培养基中水解酪蛋白的终浓度为0.5g/L，脯氨酸的终浓度为0.6g/L，PVP的终浓度为100mg/L，维生素C的终浓度为10mg/L，2，4_D的终浓度为1.Omg/L-4.Omg/L，ZT的终浓度为0.lmg/L-4mg/L，蔗糖的终浓度为30g/L。上述凝胶剂可以为琼脂，琼脂的用量以培养基能成为固体培养基为准。该培养基中琼脂的终浓度为8g/L，培养基的pH可为5.8。更进一步，上述愈伤组织诱导培养基中2，4_D和ZT的终浓度分别是如下1)或2)或3)或4)或5):1)2，4-D为l-3mg/L，ZT为0.l_4mg/L;2)2，4-D为2.Omg/L，ZT为Omg/L;3)2，4-D为2.Omg/L，ZT为lmg/L;4)2，4-D为2.Omg/L，ZT为2.Omg/L;5)2，4-D为2.Omg/L，ZT为4.Omg/L。本发明的另一目的在于提供一种生产甜高粱再生苗的方法。本发明提供的方法，包括以下步骤1)将外植体置于上述的愈伤组织诱导培养基中诱导，得到愈伤组织；2)将步骤1)中得到的愈伤组织转接到继代培养基中进行培养，得到增殖的愈伤组织；3)将步骤2)中得到的增殖的愈伤组织置于再生分化培养基中培养，得到分化苗；4)将步骤3)中得到的分化苗在生根培养基中培养，得到生根的再生苗。上述步骤1)和步骤2)的培养条件均为暗培养，温度是25±1°C;步骤3)的培养条件为光照强度是25ymo1m—2s—、光照时间为16小时/天，温度25±1°C;步骤4)的培养条件为光照强度是22ymo1m—2s—、光照时间为16小时/天，温度25±rc。进一步，上述步骤2)的继代培养基为上述的愈伤组织诱导培养基。进一步，上述步骤3)的再生分化培养基是在MS基本培养液的基础上，添加如下物质得到的培养基水解酪蛋白、脯氨酸、PVP、维生素C、6-BA(6-苄基氨基腺嘌呤)、KT(激动素)、IAA(吲哚乙酸)、蔗糖和凝胶剂。MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示。再生分化培养基中水解酪蛋白的终浓度为0.3-1.0g/L，脯氨酸的终浓度为0.3-1.0g/L，PVP的终浓度为5-50mg/L，维生素C的终浓度为5-20mg/L，6-BA的终浓度为0.5mg/L-3mg/L，KT的终浓度为0.lmg/L-lmg/L，IAA的终浓度为0.lmg/L-lmg/L，蔗糖的终浓度为20-40g/L。上述凝胶剂可为琼脂，琼脂的用量以培养基能成为固体培养基为准。该培养基中琼脂的终浓度具体为8g/L，培养基的pH可为5.8。进一步，再生分化培养基中水解酪蛋白、脯氨酸、PVP、维生素C、6-BA、KT、IAA和蔗糖的终浓度分别是水解酪蛋白为0.5g/L，脯氨酸为0.6g/L，PVP为10mg/L，维生素C为10mg/L，6-BA为2mg/L，KT为0.5mg/L，IAA为0.5mg/L，蔗糖为30g/L。进一步的，步骤4)的生根培养基是在1/2MS基本培养液的基础上，添加NAA(萘乙酸)、蔗糖和琼脂得到的培养基。所述1/2MS基本培养液的溶剂是水、溶质与表1所示的MS基本培养液的溶质相同，所述1/2MS基本培养液的溶质中的大量元素的浓度是所述MS基本培养液的溶质中的大量元素的浓度的一半，其余溶质(微量元素、有机元素和铁盐)浓度不变。生根培养基中NAA的终浓度为0.lmg/L-2mg/L，蔗糖的终浓度为15g/L，琼脂的终浓度可为8g/L;其中NAA的终浓度优选为0.5mg/L，生根培养基的pH为5.8。进一步的，上述外植体为甜高粱幼穗。所述甜高粱幼穗是经过预处理的，所述预处理是在甜高粱幼穗上加洗涤剂后在流动的自来水下冲洗30分钟左右，再用75%(体积百分比)的乙醇灭菌约2-3分钟，接着用0.1%(质量百分比)的升汞灭菌10-15分钟进行消毒，然后用无菌水冲洗至少一次。上述甜高粱幼穗是指幼穗分化第IV期-第VI期的幼穗。上述甜高粱是凯勒(Sorghumbicolor(L.)Moench'Keller，)。上述生产甜高粱再生苗的方法，还可以包括将步骤4)得到的再生苗炼苗后，移栽到经消毒的基质中生长培养，获得再生植株。进一步的，基质包括蛭石和泥土，所述蛭石和泥土的比例为1:1。更进一步的，生长培养的1-2周内保持空气湿度为80%以上。本发明的愈伤组织诱导培养基可有效地诱导甜高粱幼穗的愈伤组织。本发明的方法是用甜高粱幼穗进行组织培养得到再生体系的，本发明方法建立的再生体系再生效率高，可达到90%以上，并且非常稳定，重复性良好，完全能满足遗传转化对受体系统再生频率的要求(80%以上)，生产的再生植株形态正常、一致，遗传稳定性好。图1为甜高粱幼穗诱导的愈伤组织；图2为甜高粱幼穗诱导的愈伤组织的再生分化的分化苗；图3为再生分化苗的生根培养；图4为移栽成活后的甜高粱再生植株。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1、甜高粱再生苗的获得及其统计观察—、甜高粱再生苗的获得1、愈伤组织的制备及统计观察1)外植体的预处理以甜高粱品种凯勒(Sorghumbicolor(L.)Moench'Keller')的幼穗(幼穗分化第IV期-第VI期)为外植体。预处理具体操作先挑选生长健壮的甜高粱植株，采取带叶的10cm长度以下的甜高粱幼穗，加入洗涤剂将材料表面尘土清洗干净后，在流动的自来水下冲洗30分钟左右，然后于超净工作台中进行消毒处理，先用75%(体积百分比)的乙醇灭菌2-3分钟，再用0.1%(质量百分比)的升汞灭菌10-15分钟，最后用无菌水清洗4-5次。2)愈伤组织的获得将上述步骤1)中预处理好的外植体甜高粱幼穗剥去包裹在幼穗外周的叶组织，将幼穗的小枝梗从主穗轴上摘取，接种愈伤组织诱导培养基上，两周后愈伤组织块开始形成，可获得愈伤组织。其中，愈伤组织诱导培养基是在MS基本培养液的基础上，添加如下物质得到的培养基水解酪蛋白、脯氨酸、PVP、维生素C、2，4-D、ZT、蔗糖和琼脂；其中水解酪蛋白的终浓度为0.5g/L，脯氨酸的终浓度为0.6g/L，PVP的终浓度为100mg/L，维生素C的终浓度为10mg/L，2，4-D的终浓度为2.0mg/L，ZT的终浓度为0mg/L，蔗糖的终浓度为30g/L，琼脂的终浓度为8g/L;该培养基的pH为5.8;其中MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示。培养条件是暗培养，培养室温度控制在25±1°C。3)统计观察上述实验重复3次，实验结果如图1和表2所示。由表2可知外植体对该愈伤诱导培养基反应良好，愈伤诱导效率高。表2.愈伤组织诱导率统计7重复外植体(个)I30II30in30愈伤组织(块)愈伤组织诱导率(％)3010030100301002、继代培养将上述步骤2)中得到的愈伤组织转接到继代培养基中进行培养，每两周继代一次，培养一个月后，可得到大量增殖的愈伤组织。其中继代培养基与愈伤组织诱导培养基一样，即为同一培养基。继代培养的培养条件也和上述步骤2)—样。3、再生分化培养获得分化苗及其统计观察1)再生分化培养获得分化苗将上述步骤2中继代培养得到的愈伤组织接种到再生分化培养基上培养，每两周继代培养一次，培养一个月后，可获得再生苗。其中，再生分化培养基是在MS基本培养液的基础上，添加如下物质得到的培养基水解酪蛋白、脯氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、维生素C、6-BA、KT、IAA、蔗糖和琼脂；其中水解酪蛋白的终浓度为0.5g/L，脯氨酸的终浓度为0.6g/L，PVP的终浓度为10mg/L，维生素C的终浓度为10mg/L，6-BA的终浓度为2mg/L，KT的终浓度为0.5mg/L，IAA的终浓度为0.5mg/L，蔗糖的终浓度为30g/L，琼脂的终浓度为8g/L，该培养基的pH为5.8;其中MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示。培养条件是将培养瓶放置在光照强度为25iimo1m-2s-l的条件下培养，光照时间为16小时/天，培养室温度控制在25±rc。2)统计观察对再生分化培养的愈伤组织的再生分化情况进行观察，并统计再生分化率，实验重复3次，实验观察如图2所示，统计结果见下表3。由表3可知愈伤组织在该培养基上可以获得高效再生分化。表3.再生分化率统计重复IIIIII愈伤组织(块)303030再生分化苗数(株)292828再生分化率(％)96.793.393.34、生根培养得到再生苗及其统计观察81)生根培养得到再生苗将上述步骤3中芽分化良好的分化苗转移至生根培养基中培养，两周以后，可获得生根良好的再生苗。其中，生根培养基是在1/2MS基本培养液的基础上，添加NAA、蔗糖和琼脂得到的培养基；该培养基中NAA的终浓度为0.5mg/L，蔗糖的终浓度为15g/L，琼脂的终浓度为8g/L;此生根培养基的pH为5.8;所述1/2MS基本培养液的溶剂是水、溶质与表1所示的MS基本培养液的溶质相同，所述1/2MS基本培养液的溶质中的大量元素的浓度是所述MS基本培养液的溶质中的大量元素的浓度的一半，其余溶质浓度不变。培养条件为光照强度是22iimo1m—2s—、光照时间为16小时/天，温度25±1°C。2)统计观察对上述生根培养得到再生苗的生根情况进行观察，并统计其生根率。实验重复3次，实验观察如图3所示，统计结果见下表4。由表4可知再生分化苗在该生根培养基上可以较好地生根。表4.生根率的统计重复IIIIII再生分化苗数(株)202020诱导生根的苗数(株)161816生根率(％)8090805、炼苗移栽获得再生植株及其统计观察1)炼苗移栽获得再生植株将上述步骤4得到的已生根的再生苗炼苗后，再将再生苗从培养瓶中取出，并将残留在再生苗根系的培养基冲洗干净，移栽到经消毒的基质中进行生长培养，便可获得再生植株。其中，炼苗的具体步骤为将装有再生苗的培养瓶的封口膜打开，在培养室内，温度为25士rC，光照强度为25iimo1m—2s—1的条件下，炼苗2天。移栽用的基质为蛭石和泥土的混合物，其中蛭石和泥土的比例为1:l，移栽后进行生长培养的1-2周内要求保持空气湿度为80%以上。2)统计观察对以上炼苗移栽获得再生植株的炼苗移栽情况进行观察，并统计其成活率。实验重复3次，实验观察如图4所示，统计结果见下表5。由表5可知经炼苗移栽后，已生根的再生分化苗全部移栽成活。表5.成活率统计重复IIIIII已生根的再生苗数(株)151515移栽成活的再生植株数(株)151515成活率(％)100100100实施例2、甜高粱再生苗的获得本实施例与实施例1的区别在于愈伤组织诱导培养基，其余步骤完全相同本实施例的愈伤组织诱导培养基是在MS基本培养液的基础上，添加水解酪蛋白、脯氨酸、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、维生素C、2，4-D、蔗糖和琼脂得到的培养基，其中水解酪蛋白的终浓度为0.5g/L，脯氨酸的终浓度为0.6g/L，PVP的终浓度为100mg/L，维生素C的终浓度为10mg/L，2，4-D的终浓度为2.Omg/L，ZT的终浓度为1.Omg/L，蔗糖的终浓度为30g/L，琼脂的终浓度为8g/L;该培养基的pH为5.8;其中MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示。实验结果见表6，从表6可以看出，与实施例1相比，实施例2同样可以获得高愈伤组织诱导率、再生分化率，生根率及移栽成活率。表6.实施例2甜高粱幼穗的组织培养效果重复IIIIII外植体(个)303030愈伤组织(块)303030愈伤组织诱导率(％)100100100再生分化苗数(株)272827再生分化率(％)9093.3卯诱导生根的苗数(株)252425生根率(％)92.685.792.6已生根的再生苗数(株)202020移栽成活的再生植株数(株)202020成活率(％)100100100实施例3、甜高粱再生苗的获得本实施例与实施例1的区别在于采用的愈伤组织诱导培养基不同，其余步骤完全相同本实施例的愈伤组织诱导培养基为在MS基本培养液的基础上，添加水解酪蛋白、脯氨酸、PVP、维生素C、2，4-D、ZT、蔗糖和琼脂得到的培养基，其中水解酪蛋白的终浓度为0.5g/L，脯氨酸的终浓度为0.6g/L，PVP的终浓度为10mg/L，维生素C的终浓度为10mg/L，2，4-D的终浓度为2.Omg/L，ZT的终浓度为2.Omg/L，蔗糖的终浓度为30g/L，琼脂的终浓度为0.8%;该培养基的pH为5.8;其中MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示。实验结果见表7，从表7可以看出，与实施例1、实施例2相比，实施例3同样可获得高愈伤组织诱导率、再生分化率，生根率及成活率。10表7.实施例3甜高粱幼穗的组织培养效果重复iIIIII外植体(个)303030愈伤组织(块)303030愈伤组织诱导率(％)100100100再生分化苗数(株)292728再生分化率(％)96.7卯93.3诱导生根的苗数(株)272627《賸93.196.396.4已生根的再生苗数(株)202020移栽成活的再生植株数(株)202020成活率(％)100100腦实施例4、甜高粱再生苗的获得本实施例与实施例1的区别在于以下一点，其余步骤完全相同1、愈伤组织诱导培养基在MS基本培养液的基础上，添加水解酪蛋白、脯氨酸、PVP、维生素C、2，4-D、ZT、蔗糖和琼脂得到的培养基，其中水解酪蛋白的终浓度为0.5g/L，脯氨酸的终浓度为0.6g/L，PVP的终浓度为10mg,/L，维生素C的终浓度为lOmg,U，4-D的终浓度为2.Omg/L，ZT的终浓度为4.Omg/L，蔗糖的终浓度为30g,ZL，琼脂的终浓度为8g/L;该培养基的pH为5.8;其中MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示。将实验结果见表8，从表8可以看出，与实施例1、实施例2和实施例3相比，实施例4同样可获得高愈伤组织诱导率、再生分化率，生根率及成活率。表8.实施例4甜高粱幼穗的组织培养效果重复IIIIII外植体(个)303030愈伤组织(块)303030愈伤组织诱导率(％)100100100再生分化苗数(株)282728再生分化率(％)93.39093.3诱导生根的苗数(株)262526《撒92.992.692.9己生根的再生苗数(株)202020移栽成活的再生植株数(株)202020成活率(％)1001001001权利要求一种愈伤组织诱导培养基，它是在MS基本培养液的基础上，添加如下物质得到的培养基水解酪蛋白、脯氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、维生素C、2，4-D、ZT、蔗糖和凝胶剂；所述MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示；所述愈伤组织诱导培养基中水解酪蛋白的终浓度为0.3-1.0g/L，脯氨酸的终浓度为0.3-1.0g/L，聚乙烯吡咯烷酮的终浓度为50-200mg/L，维生素C的终浓度为5-20mg/L，2，4-D的终浓度为1.0mg/L-4.0mg/L，ZT的终浓度为0.1-4mg/L，蔗糖的终浓度为20-40g/L。2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于所述培养基中水解酪蛋白的终浓度为0.5g/L，脯氨酸的终浓度为0.6g/L，聚乙烯吡咯烷酮的终浓度为100mg/L，维生素C的终浓度为10mg/L，2，4-D的终浓度为1.0mg/L-4.Omg/L，ZT的终浓度为0.1-4mg/L，蔗糖的终浓度为30g/L。3.根据权利要求1或2所述的培养基，其特征在于所述培养基中2，4-D和ZT的终浓度分别是如下1)或2)或3)或4)或5):1)2，4-D为l-3mg/L，ZT为0.l-4mg/L;2)2，4-D为2.Omg/L，ZT为Omg/L;3)2，4-D为2.Omg/L，ZT为lmg/L;4)2，4-D为2.Omg/L，ZT为2.Omg/L;5)2，4-D为2.Omg/L，ZT为4.Omg/L。4.一种生产甜高粱再生苗的方法，包括以下步骤1)将外植体置于权利要求1-3中任一所述的愈伤组织诱导培养基中诱导，得到愈伤组织；2)将步骤1)中得到的愈伤组织转接到继代培养基中进行培养，得到增殖的愈伤组织;3)将步骤2)中得到的增殖的愈伤组织置于再生分化培养基中培养，得到分化苗；4)将步骤3)中得到的分化苗在生根培养基中培养，得到生根的再生苗。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于步骤l)和步骤2)的培养条件均为暗培养，温度是25士rc;步骤3)的培养条件为光照强度是25ymo1m—2s—、光照时间为16小时/天，温度25±rc;步骤4)的培养条件为光照强度是22ymo1m—2s—、光照时间为16小时/天，温度25士rc。6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于所述步骤2)的继代培养基为权利要求1-3中任一所述的愈伤组织诱导培养基；所述步骤3)的再生分化培养基是在MS基本培养液的基础上，添加如下物质得到的培养基水解酪蛋白、脯氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、维生素C、6-BA、KT、IAA、蔗糖和凝胶剂；所述MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示；所述再生分化培养基中水解酪蛋白的终浓度为O.3-1.0g/L，脯氨酸的终浓度为0.3-1.Og/L，聚乙烯吡咯烷酮的终浓度为5-50mg/L，维生素C的终浓度为5-20mg/L，6-BA的终浓度为0.5mg/L-3mg/L，KT的终浓度为0.lmg/L-lmg/L，IAA的终浓度为0.lmg/L-lmg/L，蔗糖的终浓度为20-40g/L。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述的再生分化培养基中水解酪蛋白、脯氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、维生素C、6-BA、KT、IAA和蔗糖的终浓度分别是水解酪蛋白为0.5g/L，脯氨酸为0.6g/L，聚乙烯吡咯烷酮为10mg/L，维生素C为10mg/L，6-BA为2mg/L，KT为0.5mg/L，IAA为0.5mg/L，蔗糖为30g/L。8.根据权利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于所述步骤4)的生根培养基是在1/2MS基本培养液的基础上，添加NAA、蔗糖和琼脂得到的培养基；所述1/2MS基本培养液的溶剂是水、溶质与表1所示的MS基本培养液的溶质相同，所述1/2MS基本培养液的溶质中的大量元素的浓度是所述MS基本培养液的溶质中的大量元素的浓度的一半，其余溶质浓度不变；所述生根培养基中NAA的终浓度为0.lmg/L-2mg/L，蔗糖的终浓度为15g/L，琼脂的终浓度为8g/L;其中NAA的终浓度优选为0.5mg/L。9.根据权利要求4-8中任一所述的方法，其特征在于所述外植体为甜高粱幼穗；所述甜高粱幼穗是指幼穗分化第IV期-第VI期的幼穗；所述甜高粱是凯勒(Sorghumbicolor(L.)Moench'Keller，)。10.根据权利要求4-9中任一所述的方法，其特征在于所述方法还包括将步骤4)得到的再生苗炼苗后，移栽到经消毒的基质中生长培养，获得再生植株；所述基质包括蛭石和泥土，所述蛭石和泥土的比例为1:1;所述生长培养的l-2周内保持空气湿度为80%以上。全文摘要本发明公开了一种甜高粱组织培养的方法及其专用培养基。本发明提供的专用培养基是甜高粱幼穗组织培养愈伤组织诱导的专用培养基，是在MS基本培养液的基础上，添加水解酪蛋白、脯氨酸、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、维生素C、2，4-D、ZT、蔗糖和凝胶剂得到的培养基；其中水解酪蛋白的终浓度为0.3-1g/L，脯氨酸的终浓度为0.3-1g/L，PVP的终浓度为150-200mg/L，维生素C的终浓度为5-20mg/L，2，4-D的终浓度为1.0mg/L-4.0mg/L，ZT的终浓度为0.1mg/L-4mg/L，蔗糖的终浓度为20-40g/L。本发明的方法是利用甜高粱幼穗为外植体建立组织培养体系，得到再生植株。本发明的方法及专用培养基可得到稳定，重复性良好的高效再生体系。文档编号A01H4/00GK101766122SQ20091024463公开日2010年7月7日申请日期2009年12月31日优先权日2009年12月31日发明者刘宣雨,刘树君,宋松泉,赵利铭申请人:中国科学院植物研究所