专利名称：一种美国白蜡组织培养快速繁殖增殖培养基及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及林木组织培养，具体地说是一种美国白蜡组织培养快速繁殖增殖培养基及其应用。
背景技术：
美国白蜡(Fraxinus americana)又名白涔，木犀科落叶乔木，原产北美。美国白蜡耐旱、耐寒、耐涝、耐盐碱，是沿海湿地造林的优良树种。它生长快，绿化效果好，生态效益高，且材质优良，质地坚硬，纹理通直，结构细勻，耐腐力强，富有弹性和光泽，易加工，素有 “水曲柳”之美称(文献1.董必慧，苏国兴.美国白蜡树的生物学特性及经济用途。江苏林业科技，2003，30，(1) :32-34)。白蜡长期以来以种子繁殖为主，由于其幼龄期长，且具明显的结实间隔期，严重影响种子的生产与繁殖。因此，无性繁殖和生物技术在白蜡上的应用有很大潜力。同时，对那些经选择、品种改良和遗传操作的个体，进行无性繁殖可加速白蜡的良种繁育进程(文献2.孔冬梅，谭燕双，沈海龙.白蜡树属植物的组织培养和植株再生.植物生理学通讯，2003，39 (6) :677-680)。不同树种、不同外植体培养所要求的基本培养基均有差异，适宜的培养基，能有效的提高增殖系数(文献3.张彦妮.复叶槭组织培养再生体系建立及其遗传转化初步研究.中国博士学位论文，2005,05:1-99)。在培养基的各种成分之中，植物生长调节物质对于组织培养中的器官形成，起着重要而明显的调节作用(文献4.王慧梅.喜树组织培养与遗传转化的研究.中国博士学位论文，2004,06:1-91)。大叶白蜡小苗在MS+6-BA 0.2+KT 0. 8+IBA 0. 2培养基上增殖率为2. 5 (文献6.洪源范，沈雨佳，洪青，李顺鹏。大叶白蜡的离体培养与快速繁殖.植物生理学通讯，2006，42 (6) 1139)； 绒毛白蜡以茎段为外植体，在MS+BA4. 0 6. 0mg/L+NAA2. Omg/L培养基上，平均增殖系数为3.59(文献6.王磊，李淑娟，徐云刚。詹亚光绒毛白蜡成熟胚和茎段培养繁殖体系的建立.林业科技，2008，33 (3) 1-3) 0而利用本发明的培养基，美国白蜡扩繁增殖系数达到了 6-7。因此，研究美国白蜡组培快繁增殖培养基，为今后美国白蜡的工厂化生产提供了可行方案，对这一树种的开发和推广具有重大的意义。组织培养是用植物的一部分组织或器官在无菌的人工培养基上进行离体培养，以获得完整植株的无性繁殖方法。由于培养物是脱离植物母体在试管中培养的，所以也称离体培养。植物组织培养是20世纪之初以植物生理学为基础发展起来的一门新兴技术，这项技术已在科研和生产上得到广泛应用。该技术具有加速育种，缩短繁殖过程，改良品质，节省空间，减少劳动，周年实验生产，不受自然条件限制等特点，且组培苗的体积小，便于携带和资源交流。目前，离体快繁和工厂化是在林业中应用最为广泛、发展最为成熟的现代生物技术，在提高林木产量和质量方面产生了重要的作用，带来了巨大经济效益、社会效益和生态效益。培养基是植物组织培养的重要组成部分，是组培苗生长发育的依托。因植物生长发育所需的养分不同，所以不同品种的植物需要不同种类的培养基，只有选择出最适宜的培养基，才能最大程度的获得再生植株，有效的提高增殖系数。
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植物生长调节剂是培养基中的关键物质，虽然量极少，但在植物组织培养中起着十分重要和明显的调控作用。常用于组织培养的植物生长调节剂有两大类即细胞分裂素类和生长素类。细胞分裂素类的主要作用是促进细胞的分裂和扩大，使茎增粗，诱导芽的分化；生长素类主要作用是促进细胞的伸长生长，促进生根。在植物组织培养中，常用的植物细胞分裂素有调吡脲(CPPU)、6_苄氨基嘌呤(6-BA)、激动素(KT)和玉米素(ZT)，常用的植物生长素有萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸(IBA)和2，4_ 二氯苯氧乙酸Q，4_D)。不同种类的植物生长调节剂作用机理不同，植物细胞分裂素的分裂能力、植物生长素促进细胞伸长的能力有强弱，为了获得较高的增殖系数，需要筛选适宜种类和浓度的植物生长调节剂。碳源是植物组织培养不可缺少的物质，它不仅能够给外植体提供能量，而且也能维持一定的渗透压，糖类的浓度大小不仅影响增殖速率，而且还影响增殖芽的质量。常用的碳源有果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、山梨醇等，其中蔗糖最常用，蔗糖能支持绝大多数植物离体培养物的旺盛生长，一直被作为植物组织培养的标准碳源而广泛应用。近来，许多研究表明蔗糖并不一定是最佳碳源，不同植物对不同糖类的反应不完全相同，有必要探索替代碳源，以提高增殖效率和节约生产成本。调吡脲(CPPU)白色晶体，难溶于水，溶于乙醇、甲醇、丙酮等有机溶液，常温下贮存稳定，低毒。调吡脲是一种具有细胞分裂素活性的苯脲类植物生长调节剂，其生物活性却较6-苄氨基嘌呤(6-BA)高10 100倍，能加速细胞有丝分裂、促进植物生长，广泛用于农、 林业。萘乙酸(NAA)又称a_萘乙酸，纯品为白色无味晶体，易溶于丙酮、乙醚、苯、乙醇和氯仿等有机溶剂，低毒，配制时可先用少量酒精溶解，再加水稀释。萘乙酸是广谱型植物生长调节剂，能促进细胞伸长，促进植物生根。吲哚丁酸(IBA)又名3-吲哚丁酸，纯品为白色至淡黄色结晶固体。主要用途促进植物主根生长，提高发芽率，成活率。
发明内容
为克服现有白蜡属树组织培养增殖速率低，增殖转接周期长，琼脂、蔗糖消耗量大，培养基成本高，不利于大规模工厂化生产的需要，本发明的目的是提供一种适宜美国白蜡成熟种胚诱导无菌苗茎段组织培养快速增殖培养基及其应用，使白蜡属树组织培养增殖速率快，增殖转接周期缩短，琼脂消耗量小，培养基成本降低，以利于大规模工厂化生产的需要。以美国白蜡成熟种胚诱导的无菌苗单芽茎段为材料，接种于增殖培养基中。美国白蜡组织培养快速增殖培养基组成为其是以MS或WPM培养基为基本培养基，于基本培养基中添加生长催进物，于基本培养基中添加各物至终浓度为调吡脲0. 05 0. 5mg · L—1、萘乙酸或吲哚丁酸0. 1 0. 5mg · Γ1、白沙糖20 40g · Γ1，调节培养基ρΗ值至5. 8 5. 9。所述增殖培养基是以MS或WPM培养基为基本培养基调配的处于固态和液态之间的一种二相固化培养基，即于基本培养基中还添加有终浓度为3. 0 4. Og · Γ1琼脂粉。所述的调吡脲浓度为0. 1 0. 3mg · 所述的萘乙酸或吲哚丁酸浓度为0. 1 0. 3mg · ΙΛ所述的白沙糖浓度为25 35g · L—1。
其中MS培养基添加调吡脲0. 15mg · L—1、萘乙酸或吲哚丁酸0. 2mg · L—1和白沙糖 30g · L-1效果最佳。所述增殖培养基可用作为美国白蜡种胚诱导无菌苗茎段快速增殖的增殖培养基。美国白蜡组织培养快速繁殖过程为以美国白蜡成熟饱满种子为外植体，剥除种壳，清水冲洗2 池后，依次在超净工作台(即无菌工作台)上用体积浓度68-72%酒精浸润30-50s，无菌水冲洗2 3次，质量浓度0. 09 0. 11%升汞(HgCl2)消毒6 lOmin，无菌水冲洗3 4次，切取种胚，接种于MS或WPM培养基中，当苗高3 4cm高时，切取无菌苗单芽茎段，接种于权利要求1所述的增殖培养基中。本发明具有如下优点1、节约生产成本。二相固化培养基所用的琼脂量约是固体培养基的一半，白沙糖价格是国产蔗糖的16%左右。琼脂和蔗糖约占培养基成本的95%，因此，利用发明的二相固化培养基进行美国白蜡组织培养快速繁殖可大大节约培养基生产成本。2、增殖系数高。以往白蜡属树组织培养增殖系数在3左右，利用发明的培养基增殖系数在6 7，增殖速率提高了 2倍。3、转接周期短。二相固化培养基与培养物接触更为紧密，有利于培养苗营养的吸收，且能够有效的支撑住培养物，固体培养基增殖美国白蜡最佳周期在5 6周，利用发明的二相固化培养基增殖美国白蜡最佳周期为4周左右，转接周期比固体培养减少25%以上，因此，增殖速度快。4、增殖后的芽体粗壮，增殖出的苗生长旺盛，4周后的平均芽长可达2. 1cm，茎叶生长整齐健壮。
具体实施例方式以美国白蜡成熟种胚为外植体，比较不同种类培养基和植物生长调节剂，及植物调节剂浓度和白沙糖浓度对美国白蜡种胚诱导无菌苗单芽茎段增殖的影响，筛选出最佳的增殖培养基配方。MS培养基的标准配方 WPM培养基的标准配方
权利要求
1.一种美国白蜡组织培养快速繁殖增殖培养基，其特征在于其是以MS或WPM培养基为基本培养基，于基本培养基中添加生长催进物，于基本培养基中添加各物至终浓度为调吡脲0. 05 0. 5mg化入萘乙酸或吲哚丁酸0. 1 0. 5mg .L-1、 白沙糖20 40g · L—1，调节培养基pH值至5. 8 5. 9。
2.根据权利要求1所述的增殖培养基，其特征在于所述增殖培养基是以MS或WPM培养基为基本培养基调配的处于固态和液态之间的一种二相固化培养基，即于基本培养基中还添加有终浓度为3. 0 4. Og · Γ1琼脂粉。
3.根据权利要求1所述的增殖培养基，其特征在于所述的调吡脲浓度为0.1 0. 3mg · 所述的萘乙酸或吲哚丁酸浓度为0. 1 0. 3mg · L-1。
4.根据权利要求1所述的增殖培养基，其特征在于所述的调吡脲浓度为0. 15mg · 所述的萘乙酸或吲哚丁酸浓度为0. 2mg · Γ1。
5.根据权利要求1所述的增殖培养基，其特征在于所述的白沙糖浓度为30g · L—1。
6.根据权利要求4或5所述的增殖培养基，其特征在于其中MS培养基为基础培养基。
7.—种权利要求1所述增殖培养基的应用，其特征在于所述增殖培养基可用作为美国白蜡种胚诱导无菌苗茎段快速增殖的增殖培养基。
8.根据权利要求7所述的增殖培养基的应用，其特征在于美国白蜡组织培养快速繁殖过程为以美国白蜡成熟饱满种子为外植体，剥除种壳，清水冲洗2 池后，依次在超净工作台上用体积浓度68-72%酒精浸润30 50s，无菌水冲洗2 3次，质量浓度0. 09 0. 11%升汞(HgCl2)消毒6 lOmin，无菌水冲洗3 4次， 切取种胚，接种于MS或WPM培养基中，当苗高3 4cm时，切取无菌苗单芽茎段，接种于权利要求1所述的增殖培养基中。
全文摘要
本发明涉及林木组织培养，具体地说是一种美国白蜡组织培养快速繁殖增殖培养基及其应用，其是以MS或WPM培养基为基本培养基，于基本培养基中添加生长催进物，于基本培养基中添加各物至终浓度为调吡脲(CPPU)0.05～0.5mg·L-1、萘乙酸(NAA)或吲哚丁酸(IBA)0.1～0.5mg·L-1、20～40g·L-1白沙糖，调节培养基pH值至5.8～5.9。本发明二相固化MS或WPM培养基添加植物生长调节剂调吡脲和萘乙酸或吲哚丁酸对美国白蜡种胚诱导无菌苗茎段增殖效果显著。本发明提供了这种培养基在美国白蜡组织培养快速繁殖中的应用，为今后美国白蜡的工厂化生产提供了可行方案。
文档编号A01H4/00GK102197785SQ20101013128
公开日2011年9月28日 申请日期2010年3月24日 优先权日2010年3月24日
发明者叶景丰, 潘文利, 范俊岗, 陈罡, 韩友志, 顾宇书, 马冬菁, 高军, 魏忠平 申请人:辽宁省林业科学研究院