专利名称：一种植物源杀菌剂在植物病害防治中的应用方法
技术领域：
本发明涉及一种植物天然化合物在植物病害防治中的应用方法，具体是3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯在植物细菌性病害和卵菌病害防治中的应用方法。属于植物病害的生物防治领域。
背景技术：
有机合成化学农药的问世，对控制农作物有害生物，保证农业增产增收发挥着重要的作用。但是，在大面积使用化学农药产生巨大社会效益和经济效益的同时，也带来了残留(Residue)、抗性(Resistance)和病虫害再娼撅(Resurgence)等3“R”问题。为了提高人类的生存环境和食品质量，世界各国都在进行减少化学农药使用量的研究，农药的发展方向从高毒、高残留、长持久性的合成化学农药转向安全、低残留、无公害、高生物活性、高选择性的生物农药。植物源农药顺应了这一发展趋势，成为新农药研究与开发的热点。 据统计，全世界有近50万种植物，目前在化学性质方面进行研究的约仅占10%。已报道具有抑菌活性的植物有208科915属1600多种，其产生的次生代谢物质超过40万种，有效成分主要有生物碱、留体类、萜类、黄酮类、醌类、苯丙素类、单宁、甙类等。这些成分对研究现代农药具有巨大的启发价值和影响作用。由于植物资源丰富，其代谢产物种类繁多，被认为是化学合成杀菌剂替代品最好的开发资源。目前，国内外对于植物源杀菌剂的开发应用主要有两个途径(1)直接利用抑菌植物，即提取抑菌植物活性部位的有效成分，然后按照农药的标准，直接将提取物加工成可利用的制剂来控制病害。这种利用方式的主要优点是能够发挥提取物中各种成分的协同作用，投资少，见效快。(2)间接利用抑菌植物，即研究植物中抑菌活性物质的结构、作用机制及结构与活性间的关系，优化先导化合物结构，修饰模拟合成新型高效的生物合理性农药。由于植物内有效成分含量一般很低，直接加工利用需要大量的植物材料，不仅原材料的供应困难，在工厂化加工中也存在原料运输、储存、废渣处理和生产操作上的体积庞大臃肿等问题。从国际上的发展趋势看，有抑菌活性的植物天然产物作为合成的先导化合物要比直接作为商品更有前途。近些年，我国植物源农药的商品化进程发展较快，目前全国生产植物源农药的厂家有100多家。从2003年到2010年，中国农业信息网中登记注册的植物源农药种类超过40种，品种超过140种，其中有植物源杀菌剂品种近40种。但是，登记防治对象为植物卵菌病害的只有乙蒜素、苦参碱和小檗碱等3种，登记防治对象为植物细菌性病害的只有乙蒜素I种。针对这类病害，尚需要大力加强抑菌植物及其抑菌活性成分研究开发的力度。木腊树[Toxicodendronsylvestre(Sieb. et Zucc. )0. Kuntze]是漆树科(Anacardiaceae)漆树属(Toxicodendron)植物,生于海拔 140-800 (-2300)米的林中，中国长江以南各省区、朝鲜和日本有分布。木蜡树属于我国民间传统药用植物，其根、叶、树皮、果实等有活血止痛、祛瘀消肿、治疗疥疮等功效，也有将其根捣碎水煎后加水或煤油用于防治水稻害虫的记载，然而国内外对木蜡树化学成分抑制病原菌的研究至今仍是空白，尚未见有关于3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯防治植物细菌性病害和卵菌病害的报道。本发明是在对木蜡树叶片抑菌活性成分分离纯化的基础上，利用其抑菌化合物开发植物源杀菌剂，国内外尚属首例。
发明内容
发明目的针对目前植物细菌性病害和卵菌病害防治中，有效的生物农药种类缺乏、防治效果不够稳定的现状，提供了利用木蜡树叶片中的抑菌物质-3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯对植物病害进行防治的方法，同时充分开发利用木蜡树这一植物资源。技术方案本发明中，木蜡树叶片的抑菌物质一 3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯通过以下方法获得(1)将木蜡树叶片阴干后烘干粉碎，用甲醇回流提取；(2)甲醇提取物用乙醚萃取，浓缩得到乙醚提取物，植物残渣晒干备用；(3)采用常规硅胶柱层析法，以不同有机溶剂配比的洗脱体系对植物提取物的成分进行反复分离，最后经重结晶法纯化获得抑
菌化合物。本发明中，植物源杀菌剂防治番茄青枯病可以通过2种途径实现第一种途径将植物残渣完全挥发完溶剂，与土壤以I : 3的比例混匀后配制成植物残渣土播种番茄。第二种途径用甲醇、乳化剂和水将3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯配制成5%的水乳剂，在作物移栽后，将水乳剂与水以I : 100或I : 50的体积比混合后灌根。有益效果本发明所提供的木蜡树叶片开发的植物源杀菌剂与现有技术相比，具有以下优点和有益效果(I)以常见植物木蜡树为原料，原料来源广，生产成本低，生产工艺简单，适合规模生产。(2)3，4，5_三羟基苯甲酸甲酯对多种植物病原细菌和植物病原卵菌抑菌效果强，本发明为新农药的创制和仿生农药的研制开发提供了新的资源。(3)提取抑菌活性物质后的木蜡树残渣有减轻病害和肥效的作用，这使木蜡树这一植物资源得到了充分开发利用。
具体实施例方式实施例I :木蜡树叶片抑菌物质的提取将收集的木蜡树叶片阴干后于50°C下烘24 48h，用40目筛的粉碎机粉碎，以甲醇回流提取3次，每次回流3h。合并提取液用旋转蒸发仪在50°C水浴中减压浓缩，获得木蜡树叶片的甲醇提取物，另将过滤后的植物残渣晒干备用。将甲醇提取物用乙醚萃取后浓缩萃取液，得到乙醚提取物。实施例2 :木蜡树叶片乙醚提取物中3，4，5_三羟基苯甲酸甲酯的分离纯化木蜡树叶片乙醚提取物以试剂型硅胶(100-200目)拌样，采用硅胶(100-200目)柱层析，以石油醚(60-90°C)/丙酮(5 : I和I : I)为洗脱剂梯度洗脱，将石油醚/丙酮(I D的组分合并，以硅胶(100-200目)拌样，采用硅胶(100-200目)柱层析，以氯仿/甲醇(10 I)为洗脱剂洗脱，将所得组分再以硅胶(100-200目)拌样，采用硅胶(200-300目)柱层析，以氯仿/甲醇(20 : I)为洗脱剂洗脱，最后将所得组分以硅胶(200-300目)拌样，采用硅胶(200-300目)柱层析，以石油醚(60-90°C )/乙酸乙酯(10 : I和2 : I)为洗脱剂梯度洗脱，将石油醚/乙酸乙酯(2 : I)的组分以乙醚为溶剂进行重结晶，获得白色结晶-3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯。实施例3 :3，4，5_三羟基苯甲酸甲酯对茄青枯拉尔氏菌的毒力供试细菌菌种爺青枯拉尔氏菌(Ralstonia solanacearum)由广西大学植物病理学研究室提供，属于小种I生化型III，于灭菌水中20°C下保存。供试菌先在NA固体培养基(Nutrient agar,配方:酵母粉3g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、琼脂17g、水IOOOmL, pH 7. 0
7.2)上划线活化培养24 48h，然后转入NA培养液中进行悬浮培养(28°C，120rpm) 24h。以平板稀释法测定3，4，5_三羟基苯甲酸甲酯对茄青枯拉尔氏菌的毒力。用10%二甲基亚砜溶解3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯，将不同浓度的药液加入NA培养基中，制备系列浓度的含药液平板。将细菌悬浮液稀释成103CFU/mL，取IOOy L涂于平板上，以含相同浓度的二甲基亚砜平板作对照，置于28°C的培养箱中培养。以培养48h完全没有菌落生长的浓度作为该化合物的最低抑菌浓度(MIC)，以培养96h仍然没有菌落生长的浓度作为该化合物的最低杀菌浓度(MBC)，按照下式计算抑菌率。以农用硫酸链霉素为对照药剂。 抑菌率(<% ) = 100X (对照平板的菌落数-药液平板的菌落数)/对照平板的菌落数。采用Microsoft Excel 2003和DPS v8. 01数据处理系统进行数据统计分析。药剂浓度取对数(X值)，抑菌率换算成生物统计几率值(y值)，计算抑制中浓度(IC5tl)。 试验结果见表I。3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯以及农用硫酸链霉素对茄青枯拉尔氏菌的MIC相同，均是20 u g/mL ；MBC也相同，均为30 u g/mL, IC50分别为8. 31和9. 62 y g/mL,两者差异不显著。这表明，3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯和农用硫酸链霉素对茄青枯拉尔氏菌生长的抑制作用基本一致。表13，4，5_三羟基苯甲酸甲酯对茄青枯拉尔氏菌的毒力
杀菌齐UMIC (y g/mL)MBC (y g/mL)IC50 (y g/mL)
3,4,5-三羟基苯甲酸甲酯20.0030.008.31a
农用硫酸链霉素20. 0030. 009. 62a(注表格各列中小写字母代表数据在5%水平上的差异显著性)实施例4 :3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯的抑菌谱采取抑菌圈法测定3，4，5_三羟基苯甲酸甲酯对细菌的抑菌活性。3，4，5_三羟基苯甲酸甲酯用10%的二甲基亚砜配制成浓度为5mg/mL的药液。将WA(Water agar,琼脂含量为3% )15mL倒入培养皿中，凝固后，再加入45°C含有107CFU/mL供试细菌的NA培养基25mL，用灭菌的5_打孔器打孔，孔深不穿过水琼脂层，每孔加入供试植物提取物药液50yL，同时以浓度10%二甲基亚砜作溶剂对照，置于28°C的培养箱中恒温培养48h。每个处理3次重复，十字交叉法测量抑菌圈的直径，取平均值。试验结果见表2。3，4，5_三羟基苯甲酸甲酯对8种植物病原细菌和2种常见细菌均表现出抑制作用，其中对茄青枯拉尔氏菌和稻生黄单胞杆菌稻细条斑致病变种的抑制作用最强，与其它细菌的抑菌活性相比，达到了显著差异水平；对丁香假单胞菌黄瓜致病变种、金黄色葡萄球菌、油菜黄单胞杆菌、杧果致病变种、柑橘黄单胞菌柑橘致病变种和辣椒斑点黄单胞杆菌也有较强的抑菌活性；对木薯黄单胞菌、胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜软腐致病变种和大肠杆菌的抑制作用相对较弱。对枯草芽孢杆菌的生长没有抑制作用。3，4，5_三羟基苯甲酸甲酯对4种卵菌的活性测定采用菌丝生长速率法。具体操作步骤是将供试卵菌在OMA (Oatmeal agar :燕麦30g、琼脂17g、水IOOOmL)平板上活化培养，待菌落长满大半培养皿时备用。用二甲基亚砜配溶解3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯，与OMA培养基混匀，倒入直径为9cm的培养皿，制成厚薄均匀的含药带毒平板培养基，二甲基亚砜的最终浓度为0. 1%，3，4，5_三羟基苯甲酸甲酯的终浓度为0. 5mg/mL，以含0. 1%二甲基亚砜的培养基作为对照。用直径为5mm的打孔器切取供试菌菌落边缘菌饼，反向接入含药带毒平板中央，置于28°C的恒温培养箱中培养，当对照菌落刚好长满培养皿时，用十字交叉法测量菌落直径(_)，以下列公式计算3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯对植物病原卵菌的抑菌率。每处理均3次重复。抑菌率(<% ) = IOOX (对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-5) 试验结果见表3。0. 5mg/mL的3,4,5-三轻基苯甲酸甲酯对4种卵菌菌丝的生长均表现出较强的抑制作用，抑菌率均大于70%，其中对瓜果腐霉的抑菌率最高，达到96. 47%。表23，4，5-三羟基苯甲酸甲酯对11种细菌的抑菌活性
权利要求
1.一种植物源杀菌剂，其特征是该杀菌剂为3，4，5_三羟基苯甲酸甲酯，分子式为C8H8O5,结构式如下
2.根据权利要求I所述的植物源杀菌剂，其特征是3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯通过木蜡树叶片有机溶剂提取物中分离纯化获得，或通过人工合成获得。
3.根据权利要求2所述的植物源杀菌剂，其特征是提取木蜡树叶片抑菌活性成分的最佳有机溶剂是乙醚。
4.根据权利要求I或2或3所述的植物源杀菌剂在植物病害防治中的应用，其特征是所述的植物病害是指拉尔氏菌属病原细菌，或黄单胞菌属病原细菌，或假单胞菌属病原细菌，或腐霉属病原卵菌，或疫霉属病原卵菌引起的植物细菌性病害或卵菌病害。
5.根据权利要求4所述的植物源杀菌剂在植物病害防治中的应用，其特征是将木蜡树植物提取残渣与土壤混匀后栽培植物，实现对植物病害的防治。
6.根据权利要求4所述的植物源杀菌剂在植物病害防治中的应用，其特征是将3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯水乳剂用水稀释50 100倍灌根，实现对植物病害的防治。
全文摘要
本发明涉及一种植物天然化合物在植物病害防治中的应用方法，具体是木蜡树叶片中的3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯在植物细菌性病害和卵菌病害防治中的应用方法。3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯可以人工合成，也可以从多种植物中分离纯化。本发明中，用乙醚提取木蜡树叶片干粉中的抑菌物质，采用硅胶柱层析法分离纯化3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯，生产成本低，生产工艺简单。3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯的抑菌谱广泛，可以采用施用木蜡树植物残渣或3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯药剂的方式防治植物病害。本发明为新农药的创制和仿生农药的研制开发提供了新的资源，并使木蜡树这一植物资源得到了充分开发利用。
文档编号A01P1/00GK102783486SQ20111012612
公开日2012年11月21日 申请日期2011年5月17日 优先权日2011年5月17日
发明者林纬, 秦健, 袁高庆, 黎起秦 申请人:广西大学