专利名称：一种使用人工染色体重组技术培育心血管系统荧光转换斑马鱼的方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，涉及一种细菌人工染色体的重组工程技术，及应用其构建心血管系统带有蓝色荧光并可转换为黄色荧光的转基因斑马鱼模型的方法。
背景技术：
心脏是人体的第一个发育的器官，是所有生命活动的能量供给动力中心。它通过大血管，微血管和血液构建的循环系统脉冲式的压迫血流将氧气和营养供给组织和器官， 同时带走代谢产物。心血管疾病是死亡率最高的疾病，每年大约有30%的死亡与之有关。 内皮细胞是心血管的最内层的细胞，具有多种合成和代谢功能，包括调节血栓及其溶解，血小板黏附，调控血管节律和血流，通过控制白细胞，单核细胞和淋巴细胞调节免疫和炎症反应。内皮细胞的损伤，会导致动脉粥样硬化和心肌梗死等多种致命心血管疾病。血管内皮生长因子(VEGF)受体/从广泛分布在整个心血管内皮系统，对于模式动物斑马鱼心血管系统flk基因进行荧光标记，可以方便的观察研究心血管病理进程。Cre-LoxP重组酶系统在新型基因打靶中获得广泛应用，是条件性基因打靶、诱导性基因打靶、时空特异性基因打靶策略的技术核心。基于fre-h^系统的荧光转换功能可以对相关基因在心血管的表达进行监控，揭示基因与疾病的关系。细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosome, BAC)是一种基于细菌质粒的系统，被广泛应用于基因组测序及图谱绘制，疾病基因的定点克隆，近来开始被用于转基因动物的建立。相对于其他克隆系统而言，BAC系统有着很强的可操作性及应用优势。 BAC携带了完整的基因表达启动子及相应调控元件，对构建高精度转基因斑马鱼系及其他转基因动物有着极其重要的意义。BAC系统可以被看作一个较大的质粒，与所有分子遗传学的常规技术兼容。通过重组工程菌SW105进行BAC重组，方便准确的修饰BAC。这种工程菌提供了Beta和Gmfi种功能，fe 保护导入的线性DNA免遭监cBO)酶切，￡ro提供了 5’到3’核酸外切活性，ifete与被外切后的单链DNA结合，提供保护。本发明融合了人工染色体重组，fre-hf系统等多种技术，通过技术优化，提高了效率，构建了高精度的心血管系统荧光转换斑马鱼，为后基因组时代心血管疾病与基因功能研究及应用提供了有效工具。
发明内容
发明目的
本发明提供一种构建心血管系统带有蓝色荧光并可转换为黄色荧光的转基因斑马鱼模型的方法。技术方案
一种使用人工染色体重组技术培育心血管系统荧光转换斑马鱼的方法，其特征在如下步骤实现
3k、flk BAC 导入工程菌 SW105，其中 flk BAC 为 CH211-231B5 ；
B、采用目的片段5，引物5，-CATACGAGTATCATTCGGGGTTATTTTAACAG ACAAAATTAATTCA GACGCGCAAGTTTGTACAAAAAAGAGGCT-3’ 禾Π
目的片段 3，引物5，-ATAACACAAAAAGCGACACTTACCATGTGAAA TACAACGGCTAGTCTTTCCA GAGTAGTGAGGAG-3，扩增pPCRBIoxYkanFrt中的荧光转换基因元件；
C、荧光转换基因元件的电击导入含flk-BAC感受态细胞，并大量培养；
D、清除插入基因片段所带筛选抗性；
E、引入Tol/IScel转座位点提高整合效率其中插入位点1引物
上游引物5 '-ACCCAATTCACCTGTAGCGCATGGACTAGAGATGAAGCTTGG TACCGAGCTCGGATCCACTAGTACGGC-3’
下游引物5 '-GATCTGCAGCATATCATGCGTGTAATATGAGAGACGAGCTC GGATCCGAACAAACGACCC-3’
Tol/IScel插入位点2引物
上游引物5 '-GGGCATCGGTGAGCTTGACATTGTAGGACTATATTGCTCG AGCGGCCG CCAGTGTGATGG-3’
下游引物5 ‘-CTGTTCCTGCGCCCGAAGAGTCTTGTGGTAAGTTTGTGCAGG CGGCCGCATTCCC-3，；
F、斑马鱼胚胎的注射；
G、潜在的成功转基因鱼筛选。有益效果
1)对于心血管系统广泛表达的血管内皮生长因子(VEGF)受体/从进行荧光标记。2)采用完整的flk基因表达启动子及相应调控元件以调节荧光报告子表达，而非简单的部分短片段的质粒构建。3)主要技术细节包括d BAC的前期处理，引物设计，感受态工程菌的准备，温度诱导重组，d BAC的重组后鉴定及大量提取技术。4)无需分离启动子，相对于受限于启动子构建标记的转基因系的技术，很大程度上提高了转基因系构建的广泛性，为基础医学和应用科学研究提供了自由。5)本专利技术在应用BAC重组工程的同时，融合了近期出现的转座技术，使用 Tb^ 和Zs^/转座子，提高了人工染色体整合到斑马鱼基因组的效率，提高了构建的成功率。6)将重组后的d BAC导入斑马鱼胚胎。包括显微注射方法，剂量步骤，优化的 Fo交配筛选方案。
图1血管系统标记基因/从BAC克隆CH211-231B5结构示意图； 图2插入到BAC中的蓝色变黄色荧光基因序列质粒；
图3插入到BAC中的转座基因序列质粒，包括tol2 RIsceI位点； 图4 cre-lox原理示意图未加ere的基因只表达蓝色荧光，不表达终止信号后片段。 加入ere后可于Iox位点处切割重组，基因因此表达黄色荧光； 图5细菌人工染色体重组原理示意图；图6重组后BAC酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳；
图7构建好的转基因斑马鱼心血管系统呈蓝色荧光，在fre mRNA的作用下转化为黄色荧光；
图8插入到BAC中的蓝色变黄色荧光基因序列质粒，其电泳检测确定PCR结果的电泳图。
具体实施例方式实施例1 培育心血管系统带荧光并可进行荧光颜色转换的斑马鱼转基因系。含flk BAC工程菌的准备 Dflk BAC的来源
/7左基因广泛分布于心血管系统，其BAC克隆为CH211-231B5 (图1)，该信息可直接到 zfin.org 查询。本发明中使用的 flk BAC 购自 CH0RI-211 文库(Children’ s Hospital Oakland Research Institute in Oakland, California, USA. http://bacpac. chori. org), BAC 的大小为 156. 559kb，序列详见 GenBank : BX24796. 6。2、flk BAC 导入工程菌 SW105
a.将含/7左 BAC 克隆的菌株(Children，s Hospital Oakland Research Institute in Oakland, California, USA)在含12. 5 μ g/ml氯霉素抗性的LB培养基平板划线，37°C 培养过夜。b.挑取4个克隆，在含12.5 μ g/ml氯霉素抗性的5ml LB液态培养基37°C培养过夜。c.进行BAC的小量提取，参见下述步骤5。d.使用SpeI 37°C酶切过夜，在0. 7%的琼脂糖凝胶上电泳检测BAC大小是否正确。e. M SW105 ^^ (SW105, ^ g National Cancer Institute at Frederick, USA)在5ml无抗生素的LB培养液中，30°C振摇过夜。次日，1 100稀释于25ml培养液中， 于30°C振摇4-5小时，直到0D600值为0. 6。f.将菌液在冰中冷却2min, 5000g，0°C离心3min。g.去上清，加入Iml冰水，在冰中重悬15min。然后加入9ml冰水，重悬。h. 5000g，0°C离心3min，去上清。重悬于Iml冰水。转移ImL重悬菌液至预冷的 Eppendorf管中。台式小离心机2min 4°C离心14000转，2min离心后，移除900 μ L上清， 重悬沉淀于100 μ L。i.将IOOyL菌液转入电转化皿中，设定参数为25 μ F, 1.75 kV及200 ohms. 电击后马上加入ImL室温SOC至小槽内。转移菌液至新的印pendorf管中，32°C摇床培养 lh。开始预热培养板。Ih复壮之后，室温14000转离心lmin。除去850 μ L上清，重悬于 150yL上清中。将所有150yL涂板。32°C过夜培养。细菌在这一温度下生长缓慢，所以等待较长时间才能看到克隆。j.挑取4个克隆，在含12. 5 μ g/ml氯霉素抗性的5ml LB液态培养基37°C培养过夜。进行BAC的小量提取，参见下述步骤5。使用SpeI 37°C酶切过夜，在0. 7%的琼脂糖凝胶上电泳鉴定BAC是否正确。
5
k.将鉴定正确的菌株保存待用。加入330 μ L60%甘油到ImL菌液中，零下80°C冻存。.用于插入BAC的荧光转换基因元件的准备
1)荧光报告基因质粒模板及引物设计
荧光报告基因包含在质粒pPCRBloxYkanFrt (见Seq NO. 1)中，使用以下引物将该目的片段扩增(质粒模板如图2)。该质粒含有cre-loxp作用位点，工作原理如图4。目的片段 5，引物5，-CATACGAGTATCATTCGGGGTTATTTTAACAG ACAAAATTAATTCAGA CGCGCAAGTTTGTACAAAAAAGAGGCT-3，(见 Seq NO. 3)
目的片段 3，引物5，-ATAACACAAAAAGCGACACTTACCATGTGAAA TACAACGGCTAGTCTTTCCA GAGTAGTGAGGAG-3，(见 Seq NO. 4)
2)目基因片段的扩增与纯化
设置 PCR 反应，使用 Failsafe 试剂盒(FaiISafe PCR System，购自 Epicentre biotechnologies, USA)扩增长片段，模板量为1 ng DNA。电泳检测确定PCR结果正确后 (如图8)，使用QIAquick纯化，每柱低于400毫克琼脂糖，洗脱至40 μ L去离子水。每40 μ L 洗脱样品加入2-3 μ 1 DpnI酶切60 min，去除模板。反应条件如下 160 μ 1 PCR 产物 20 μ 1 IOx buffer 4 10 μ 1 H2O 10 μ 1 DpnI 200 μ 1 总体积
酶切后于1%琼脂糖凝胶电泳分离产物，使用Minelute纯化。PCR产物同样也使用 Minelute柱进行纯化。200 yL样品，加入600 μ 1 QG溶液及200 μ L异丙醇，混勻后上样。 使用PE溶液清洗两次，第一次750 μ L第二次250 μ L，至少5次30秒离心除去所有ΡΕ，每次更换新管；完全干燥后洗脱至12 μ L水中。获得荧光转换基因元件，测定其浓度，正常浓度不低于100 μ g/mL。含/I-BAC感受态细胞的准备
准备好培养平皿，抗性要正确，准备5mL过夜培养的flk BAC菌液(来自步骤1 )，培养温度32°C，加入氯霉素抗性和LB培养基。培养过夜，稀释2mL过夜培养的菌液致25mL，加入氯霉素。600纳米处测定OD值，大约为0.015至0.02。打开冷冻离心机，快速冷却模式。 准备好42°C水浴摇床。准备好IOOmL灭菌水，2个电转化小缸，2个印pendorf管，2个15mL 试管及冰。准备好培养平皿，抗性要正确。25mL培养液达到吸光值约0. 055-0. 066时，转移 12. 5mL培养液到另一个锥形瓶。42°C水浴诱导15min，另外一瓶放入32°C作为未诱导组。 5min后，将两瓶迅速放置冰上，冷却大约lOmin。转移10 mL培养菌液置于预冷的14mL管中，零下4°C 5000转离心3min。离心后移除上清。加入ImL冰冷的无菌水，在冰水中摇动重悬沉淀5至lOmin。零下4°C 5000转离心3min。重复3次后，快速冰上重悬菌液。转移 ImL重悬菌液至预冷的Eppendorf管中。台式小离心机2min4°C离心14000转，2min离心后，移除900 μ L上清，重悬沉淀于100 μ L，获得含有/"M-BAC感受态细胞菌液。.荧光转换基因元件的电击导入
将5μ L荧光转换基因元件加入到重悬的d-BAC细胞菌液中，混勻两次。转移细胞-DNA混合物至预冷的小槽内，确认细胞位于金属板间。使用1.7 kV电传孔器。电击后马上加入ImL室温SOC至小槽内。转移菌液至新的印pendorf管中，32°C摇床培养lh。开始预热培养板。Ih复壮之后，室温14000转离心lmin。除去850 μ L上清，重悬于150 μ L 上清中。将所有150yL涂板。32°C过夜培养。细菌在这一温度下生长缓慢，所以等待较长时间才能看到克隆。对于成功的重组，可以看到有大于1000个克隆在诱导的板上，但是在未诱导的板上没有。从诱导板上挑6个克隆，接种于5mL的LB管中，加入相应抗生素，32°C 摇菌过夜。获得菌液用于接下来的提取及鉴定。反应原理如图5所示； 5. BAC的小量提取及鉴定
从32°C摇过夜的5mL获得菌液中取4mL，4500转离心15min。去上清，加入250 μ LPl 溶液(50 mM Tris ‘ Cl, pH 8. 0; 10 mM EDTA, 100 μ g/ml RNase A)，重悬菌液，转移至印pendorf管中。加入 250 μ LP2 (200 mM NaOH, 1% SDS)，室温静止5min。加入 250 μ LNl (1. 6 M NaCl; 50 mM MOPS, pH 7.0; 15% isopropanol )，小离心机 14000 离心 5min，上清转移至新的印pendorf管中。重复离心，收集上清。加入750 μ L异丙醇，零下20°C静置IOmin 以上。最高速离心lOmin，去上清，70%乙醇清洗，干燥，获得小量的BAC。重悬置40 μ L 酶切反应液中，34 μ L水，4 μ LlOx缓冲液，2 μ L酶。鉴定结果如图6所示。6. BAC大量提取
将上述鉴定正确的菌株，32°C过夜培养。5500转离心20min。在50mLPl中加入200 μ L RNA酶溶液，重悬菌液。加入50mL P2溶液，翻转4_6次，室温静置5min。加入50mLP3溶液 (3.0 M potassium acetate, pH 5. 5)，翻转4-6次，用滤纸漏斗过滤。使用Qia的大提结合柱，结合DNA，60mL清洗液清洗。5次每次3mL65°C预热的洗脱溶液，进行洗脱回收。加入 10. 5mL异丙醇，混勻后置于高压灭菌的corex玻璃离心管中。12，500转4°C高速离心30min 后，使用70%乙醇清洗。让沉淀物干燥，并观察。重悬沉淀到200-400 μ L 7jC中。离心lmin， 转移上清至ImL管中即可获得大量的BAC。加入330μ L60%甘油到ImL菌液中，零下80°C 冻存。清除插入基因片段所带筛选抗性
因为插入的荧光转换基因元件含/^—Α/Ζ^ 反应位点(如图2所示)，并且SW105菌株含有阿拉伯糖诱导的启动子控制/^7/7表达。对于步骤5鉴定好的克隆，培养单克隆于5mL LB培养基中，32°C过夜。第二天取 ImL该SW105菌株稀释至IOmL溶液。32°C 2_3h振动培养至600纳米吸光度为0. 5。加入 1001^10%左旋1^(+)阿拉伯糖(Sigma A-3256)，使诱导/^7/71个小时。然后涂到板上鉴定， 10_4到10_6稀释。平板分含有氯霉素及卡那霉素抗性。正确的敲除应该在氯霉素平板看到克隆，卡那霉素没有克隆。挑菌落小提鉴定，获得清除插入基因片段所带筛选抗性的简洁的 BAC片段。弓丨入Tol/IScel转座位点提高整合效率
Y)龟有Tol/IScel序列(见Seq N0. 2)的质粒模板如图3所示，使用特异性引物将 Tol/IScel转座元件扩增。2)引物设计
插入位点1引物
上游引物5 '-ACCCAATTCACCTGTAGCGCATGGACTAGAGATGAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTACGGC-3’ (见 Seq NO. 5)
下游引物5 '-GATCTGCAGCATATCATGCGTGTAATATGAGAGACGAGCTC GGATCCGAACAAACGACCC-3，(见 Seq NO. 6) Tol/IScel插入位点2引物
上游引物5 '-GGGCATCGGTGAGCTTGACATTGTAGGACTATATTGCTCG AGCGGCCG CCAGTGTGATGG-3，(见 Seq NO. 7)
下游引物5 ‘-CTGTTCCTGCGCCCGAAGAGTCTTGTGGTAAGTTTGTGCAGG CGGCCGCATTCCC-3， (见 Seq NO. 8)
3)设置PCR反应，使用Failsafe试剂盒扩增长片段，模板量为1 ng DNA。电泳检测确定PCR结果正确后，使用QIAquick纯化。4 )将5 μ L Tol/IScel元件PCR产物加入到步骤7所得的/HAC细胞菌液中， 混勻两次。转移细胞-DNA混合物至预冷的小槽内，确认细胞位于金属板间。使用1. 7 kV电传孔器。电击后马上加入ImL室温SOC至小槽内。转移菌液至新的印pendorf管中，32°C 摇床培养lh。开始预热培养板。Ih复壮之后，室温14000转离心lmin。除去850 μ L上清， 重悬于150 μ L上清中。将所有150 μ L涂板。32°C过夜培养。挑6个克隆，接种于5mL的 LB管中，加入相应抗生素，32°C摇菌过夜。获得菌液进行BAC提取及鉴定。引入转座位点提高整合效率的意义在于大幅提高基因重组的成功率，缩短构建周期。斑马鱼胚胎的注射
将野生型AB斑马鱼配置于小交配缸中，中间插有隔板过夜，次日早晨取出隔板，小鱼开始交配产卵。收集鱼卵，使用E3溶液清洗。去除未受精的鱼卵。尽快将鱼卵在注射盘中排列好，设置好注射器。注射溶液配方为=(IOyL)终浓度80纳克/微升引入转座子的 BAC, IxDanio缓冲液，Ix酚红溶液，1微升转座酶，相应量的水。注射1纳升至一细胞期的胚胎细胞中。将注射好的胚胎放于28. 5°C孵箱中，48h后观察荧光。将表达正确的马赛克鱼挑出，第五天时转入小鱼保姆区养大。潜在的成功转基因鱼筛选
当斑马鱼长至2. 5-3个月后，开始筛选。首先使用群内交配，标记好胚胎与对应的亲代鱼。亲代的鱼最好单独养到每个缸里，做好标记。每对鱼看过100个胚胎，如果都呈阴性， 可说明亲代阴性。使用表格做好记录，不断排除阴性鱼。通常BAC有1-2%的几率找到一条转基因鱼。插入Tol/IScel转座子的BAC这一几率有较大提高约8%，而且具有较强的启动子表达，见图6，图7。
权利要求
1. 一种使用人工染色体重组技术培育心血管系统荧光转换斑马鱼的方法，其特征在如下步骤实现k、flk BAC 导入工程菌 SW105，其中 flk BAC 为 CH211-231B5 ；B、采用目的片段5，引物5，-CATACGAGTATCATTCGGGGTTATTTTAACAG ACAAAATTAATTCA GACGCGCAAGTTTGTACAAAAAAGAGGCT-3’ 禾Π目的片段 3，引物5，-ATAACACAAAAAGCGACACTTACCATGTGAAA TACAACGGCTAGTCTTTCCA GAGTAGTGAGGAG-3，扩增pPCRBIoxYkanFrt中的荧光转换基因元件；C、荧光转换基因元件的电击导入含flk-BAC感受态细胞，并大量培养；D、清除插入基因片段所带筛选抗性；E、引入Tol/IScel转座位点提高整合效率其中插入位点1引物上游引物5 '-ACCCAATTCACCTGTAGCGCATGGACTAGAGATGAAGCTTGG TACCGAGCTCGGATCCACTAGTACGGC-3’下游引物5 '-GATCTGCAGCATATCATGCGTGTAATATGAGAGACGAGCTC GGATCCGAACAAACGACCC-3’Tol/IScel插入位点2引物上游引物5 '-GGGCATCGGTGAGCTTGACATTGTAGGACTATATTGCTCG AGCGGCCG CCAGTGTGATGG-3’下游引物5 ‘-CTGTTCCTGCGCCCGAAGAGTCTTGTGGTAAGTTTGTGCAGG CGGCCGCATTCCC-3，；F、斑马鱼胚胎的注射；G、潜在的成功转基因鱼筛选。
全文摘要
本发明公开了一种使用人工染色体构建转基因斑马鱼的技术及其辅助质粒。本专利使用这一技术构建了蓝色荧光转换黄色荧光的心血管系统转基因系。步骤包括1)特异性人工染色体获得及目的基因的构建2)人工染色体重组插入目的基因3)重组的人工染色体导入斑马鱼受精卵4)阳性转基因系筛选。本技术发明是一种具有国际领先水平的细菌人工染色体重组工程技术，极大的提高了转基因构建效率，将为我国生物医学基础研究和药物研究提供有力的工具。
文档编号A01K67/033GK102250951SQ20111014140
公开日2011年11月23日 申请日期2011年5月30日 优先权日2011年5月30日
发明者吉贵祥, 周勇, 顾爱华 申请人:南京医科大学