专利名称：一种快速构建水稻渗入系发掘优良基因的方法
技术领域：
本发明属植物基因工程技术领域，具体涉及水稻基因组大片段转化构建渗入系的方法。
背景技术：
渗入系(Introgressing line)是通过系统回交和自交使供体染色体片段渗入到受体亲本中而获得的材料或植株，或者利用植物基因工程技术将供体植物基因组大片段导入受体亲本而获得的材料或植株。传统的渗入系的构建方法通过多代回交和自交的方法，同时借助于分子标记图谱和分子标记辅助选择的手段分析供体染色体片段，该分子标记图谱和分子标记辅助选择的手段还局限在对该方法构建的渗入系群体的检测分析上。该方法存在不仅工作量大，而且有后代选择效率低、杂交转育后往往出现疯狂分离、不育或死亡的现象，并且育种周期长等缺陷和不足。植物基因工程技术构建渗入系是通过构建的基因组文库，将基因组文库的克隆导入受体植物，该方法可以克服供体植物与受体植物之间的生殖障碍，但由于所构建的基因组文库通常含有数万个单克隆，如，云南药用野生稻BIBAC文库包含53760个克隆，在将这些单克隆导入受体亲本时也相应要做上万次导入，存在工作量庞大的缺陷和不足。因此， 研究提供一种能克服以上缺陷和不足的渗入系的构建方法，是育种工作急需解决的技术问题。野生稻(Oryza rufipogon )是水稻的原始祖先，世界上目前共有20多种野生稻种，其中中国有3种，即药用野生稻、普通野生稻和疣粒野生稻。中国野生稻在云南省分布最广，生太类型多。野生稻具有栽培稻所没有的丰富的、优良的特异性状，如高蛋白、分蘖力强、高抗褐飞虱和白叶枯病等优良性状，云南野生稻由于独立起源和进化，又具有其它药用野生稻不具有的结实率高等重要的特异优良性状，这些野生稻是水稻育种的宝贵资源， 也是水稻基因工程研究和水稻育种获得突破的重要物质基础，常将这些野生稻作为供体植物构建渗入系。
发明内容
本发明方法要解决的技术问题是克服现有技术利用基因组文库构建渗入系存在工作量庞大的缺陷和不足，而提供一种快速构建水稻渗入系的方法。为解决上述技术问题，本发明所述的一种快速构建水稻渗入系发掘优良基因的方法，包括如下步骤
(1)构建BIBAC基因文库混合池 ①一级混合池的构建
待BIBAC基因文库的文库保存板中的单克隆菌液完全融化后，将每一块文库保存板中每一列中的16个孔内的单克隆菌液合并成一个一级混合池，将一级混合池标记为(X)-y，X为文库保存板的编号，X=l，2，3，……自然数，y为每一块文库保存板中列的编号，y=l， 2,3,……自然数，该一级混合池命名为(X) _y号一级混合池；
②二级混合池的构建
将每一块文库保存板所对应的一级混合池合并成一个二级混合池，将二级混合池标记为X，X=l，2，3，……自然数，该二级混合池命名为X号二级混合池；X与文库保存板的编号相同；
③三级混合池的构建
按二级混合池编号顺序从1号二级混合池开始，每10个二级混合池合并成为一个三级混合池，将三级混合池记为η，η =1，2，3，……自然数，该三级混合池命名为η号三级混合池；
(2)用常规转基因方法分别将各三级混合池中的混合克隆导入受体植物，获得渗入系。步骤( 所述的常规转基因方法为为农杆菌介导转基因方法、基因枪、花粉管通道方法中的任一种。所述的BIBAC基因文库为野生稻BIBAC基因文库。所述的野生稻为药用野生稻。所述的受体植物为栽培稻。与现有技术相比，本发明方法的有益效果是
1、本发明方法将BIBAC基因文库构建成基因文库混合池，将常规的药用野生稻基因文库包含的5万以上的单克隆构建成了只有10多个的三级混合池，只需将10多个三级混合池转化受体亲本，即10多次转化手续，即可构建全基因组导入的渗入系，而将常规的药用野生稻基因文库全基因导组入受体亲本，需5万次以上的转化实验才能构建渗入系，因此， 本发明方法克服了现有技术超大的工作量的缺陷，节省了几万次转化手续，大幅度地减轻了科研人员的工作量，达到了简便、快速的目的。2、本发明方法因每个三级混合池含有了较多的大片段，又可简便、快速地将各三级混合池导入渗入系，可使该渗入系达到全基因组的插入。3、本发明方法通过三级混合池，依次可追溯到二级混合池、一级混合池，文库保存板的某一列中的某一个孔的单克隆，因此能简便、快速和准确地查找到供体植物的优良基因定位，有利于供体优良基因的发掘利用。
图1为双元细菌人工染色体BIBAC2质粒载体物理图。图2为一级混合池和二级混合池的构建示意图，图中(X) -1 (X) -24，表示第X 块文库保存板中的M个一级混合池，X表示M个一级混合池合并成的一个二级混合池。图3为三级混合池的构建示意图，图中1 10表示1号二级混合池至10号二级混合池共10个二级混合池合并构建1个三级混合池，1表示1号三级混合池。图4为携带三级混合池BIBAC2质粒的农杆菌LBA4404转化克隆中nptW基因的 PCR检测，M，DL2000 marker ；1为阳性对照(BIBAC2载体为摸板)；2，为阴性对照；3-24为 7号三级混合池质粒BIBAC2电击转到农杆菌的克隆。
图5为农杆菌克隆中BIBAC2质粒携带药用野生稻基因片段的PCR检测情况，M， DL2000 marker ； 1-2 阴性对照(空BIBAC2载体)；3-23 携带药用野生稻片段的农杆菌克隆。图6为渗入系中如 基因片段的PCR检测，M:DL2000 marker ； 1_2 阳性对照 (BIBAC2载体为模板)；3，4 阴性对照(日本晴，中花11) ；5-14 日本晴渗入系；15-23 中花 11渗入系。图7为渗入系中/7/7 ΙΙ基因片段的PCR检测，M :DL2000 marker ；1-2 阳性对照 (BIBAC2载体为模板)3，4:阴性对照(日本晴，中花11) ；5-11 日本晴渗入系；12-16 中花 11渗入系。
图8是实施例2步骤(2)中4)转化子的分子检测的两个PCR反应的PCR扩增程序图。 图9是实施例3步骤2中2、渗入系的如 基因和/？辦//基因检测的PCR扩增程序图。
具体实施例方式
实验材料
1、云南药用野生稻为供体材料，由云南省农业科学院生物技术及种质资源研究所提供。供体材料也可用其它水稻材料。云南药用野生稻(汉Officiz7Wi1S Wall, ex Watt.) 是产于云南省，因独立起源和进化，具有其它药用野生稻不具有的结实率高等重要的特意优良性状，因此，特别值得开发和利用，受到本领域的重视。2、受体植物两种栽培稻品种日本晴、中花11，可从商业渠道购买到。其中，日本晴的全基因组序列的测定工作已经完成，这样该药用野生稻基因转入到这两个栽培稻中时，有利于药用野生稻的基因克隆与定位；中花11是农杆菌转基因常用的受体材料，外源基因比较容易转入其基因组。3、实施例中所有试剂均能从商业渠道购买到。实验所需的主要仪器设备 电击转化仪(Bio-Rad GENE PULSER)
台式高速冷冻离心机(Eppendorf Centrifuge 5417R/5810R)
高速冷冻离心机(BECKMAN J2-M1)
超速离心机(BECKMAN Optima L-100XP)
电泳仪(Bio-RAD Model 3000X1)
脉冲场电泳仪(Bio-RAD CHEF MAPPER)
凝胶成像系统(GENE Company Limited)
移液器(Eppendorf)
PCR 仪(Bio-RAD PTC-200)
pH 计(BECKMAN 360PH/Temp/Mv Meter)
超纯水系统(MILLIPORE ACADEMIC-Q)
高压灭菌锅(SANYO Labo Autoclave))
-20 °C 低温冰箱(Shuang Lu BCD-230)
-80°C超低温冰箱(SANYO OLTRA LOW)
制冰机(COMMERCIAL ICE SYSTEM)
恒温摇床(中国太仓市试验设备厂THZ-C)恒温摇床(中国科学院武汉科学仪器厂HQ452) 超净台(苏州安泰空气技术有限公司)。实施例1云南药用野生稻BIBAC基因文库的构建
云南药用野生稻BIBAC基因文库的构建是按照常规的BIBAC基因文库的构建方法构建的。还可参照“云南药用野生稻BIBAC文库的构建及分析”(作者侯思名等，湖南农业大学学报(自然科学版)第37卷第1期2011年2月，17-21)构建。用现有的常规方法构建的云南药用野生稻BIBAC基因文库的克隆载体是双元细菌人工染色体BIBAC2，大小为23. 5kb,具有单克隆酶切位点BamHI，如图1所示，对卡那霉素(Km)具有抗性，具有feci 基因，当载体有外源片段插入，可以在含5%的蔗糖和卡那霉素(50mg/L)的LB培养基中生长；该云南药用野生稻BIBAC基因文库包括53760个克隆， 平均插入片段76 kb,保存在140块文库保存板中，每块文库保存板有M列，每列有16个孔，即每块文库保存板有384个孔用以贮存克隆菌液，用X表示文库保存板的编号，X=l，2， 3，……140自然数；从第1块文库保存板开始，依次，命名为第1块文库保存板，第2块文库保存板，第3块文库保存板，第4块文库保存板，第5块文库保存板，……到第140块文库保存板，其基因文库库容相当于云南药用野生稻基因组的5. 86倍。实施例2本发明的快速构建水稻渗入系发掘优良基因的方法
用实施例1所构建的云南药用野生稻基因组文库按以下步骤构建水稻渗入系 (1)构建基因文库混合池 1) 一级混合池的构建
①待云南药用野生稻BIBAC基因文库的文库保存板中的单克隆菌液完全融化后，将每一块文库保存板中，每一列中16个孔的单克隆菌液合并成一个一级混合池，每一块文库保存板有M列，共合并成M —个一级混合池，具体操作是用最大量程为10 μ 1的移液枪分别吸取文库保存板的1列中的16个孔中单克隆菌液10 μ 1，合加在一个已装有1.5ml培养基的离心管中，所述的培养基与构建的云南药用野生稻BIBAC基因文库所采用的培养基及培养条件均相同，具体是所述的培养基是1.0%胰蛋白胨，0.5%酵母膏，1.0% NaCl, 360mmol/LK2HP04, 132mmol/LKH2PO4, 17mmol/L, Na citrate 4mmol/L MgSO4 · 7H20，68 mmol /L (NH4)2S04，每次在吸取1个孔中的单克隆菌液之前先用移液枪将沉淀在板底的菌体重悬后再吸取菌液，每个单克隆菌液用一个无菌移液枪头；将所建成的一级混合池放入 37°C恒温摇床中培养6 他(培养条件)；所述的百分数为质量分数；
②将收集了的每一列的混合菌液离心管标记为(X)_y，X为文库保存板的编号，X=l， 2,3,……140自然数;y为每一块文库保存板中列的编号，y=l，2，3，4，5，6，7，8，9，10，ll， 12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24 ；即每一块文库保存板有24个一级混合池(如图2)，一级混合池命名为(X)-y号一级混合池；因云南药用野生稻BIBAC基因文库有140 块文库保存板，所以构成3360个一级混合池(140XM=3360)；
以下以第1块文库保存板，第2块文库保存板，第3块文库保存板，第140块文库保存板为例，更具体地说明该文库保存板中每一列16个孔的单克隆菌液合并在一个离心管中， 该离心管的标记即一级混合池的标记 第1块文库保存板
第1块文库保存板第1列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管记为(1)_1，命名为-1号一级混合池，以下类推；(1)-2第块文库保存板第2列中16个孔的单克隆菌液合并的离心售;标记为(1)-2，第块文库保存板第3列中16个孔的单克隆菌液合并的离心售;标记为(1)-3，第块文库保存板第4列中16个孔的单克隆菌液合并的离心售;标记为(1)-4，第块文库保存板第5列中16个孔的单克隆菌液合并的离心售;标记为(1)-5，第块文库保存板第6列中16个孔的单克隆菌液合并的离心售;标记为(1)-6，第块文库保存板第7列中16个孔的单克隆菌液合并的离心售;标记为(1)-7，第块文库保存板第8列中16个孔的单克隆菌液合并的离心售;标记为(1)-8，第块文库保存板第9列中16个孔的单克隆菌液合并的离心售;标记为(1)-9，第块文库保存板第10列中16个孔的单克隆菌液合并的离心<隆标记为(1)-10,第块文库保存板第11列中16个孔的单克隆菌液合并的离心<隆标记为(1)-11,第块文库保存板第12列中16个孔的单克隆菌液合并的离心<隆标记为(1)-12，第块文库保存板第13列中16个孔的单克隆菌液合并的离心<隆标记为(1)-13，第块文库保存板第14列中16个孔的单克隆菌液合并的离心<隆标记为(1)-14，第块文库保存板第15列中16个孔的单克隆菌液合并的离心<隆标记为(1)-15，第块文库保存板第16列中16个孔的单克隆菌液合并的离心<隆标记为(1)-16，第块文库保存板第17列中16个孔的单克隆菌液合并的离心<隆标记为(1)-17，第块文库保存板第18列中16个孔的单克隆菌液合并的离心<隆标记为(1)-18，第块文库保存板第19列中16个孔的单克隆菌液合并的离心<隆标记为(1)-19，第块文库保存板第20列中16个孔的单克隆菌液合并的离心<隆标记为(1)-20，第块文库保存板第21列中16个孔的单克隆菌液合并的离心<隆标记为(1)-21，第块文库保存板第22列中16个孔的单克隆菌液合并的离心<隆标记为(1)-22，第块文库保存板第23列中16个孔的单克隆菌液合并的离心<隆标记为(1)-23，第块文库保存板第24列中16个孔的单克隆菌液合并的离心<隆标记为(1)-24 ；分别命名为(I)-I号一级混合池，(1)-2号一级混合池，(1)-3号一级混合池，(1)-级混合池，(1)-5号一-级混合池，(1)-6号一级混合池，(1)-7号一级混合池，(1)-8
一级混合池，(1) -9号一级混合池，(1) -10号一级混合池，(1) -11号一级混合池，(1) -12 号一级混合池，(1) -13号一级混合池，(1) -14号一级混合池，(1) -15号一级混合池， (1)-6号一级混合池，(1) -17号一级混合池，(1) -18号一级混合池，(1) -19号一级混合池，(1) -20号一级混合池，(1)-21号一级混合池，(1) -22号一级混合池，(1)-23号一级混合池，(1) 号一级混合池，以下类推； 第2块文库保存板
第2块文库保存板第1列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管记为(2)-1， 第2块文库保存板第2列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(2) -2， 第2块文库保存板第3列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(2) -3， 第2块文库保存板第4列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(2) -4， 第2块文库保存板第5列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(2) -5， 第2块文库保存板第6列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(2) -6， 第2块文库保存板第7列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(2) -7，第2块文库保存板第8列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(2) -8， 第2块文库保存板第9列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(2) -9，
第2块文库保存板第10列中16个孔的单克隆菌液合并的离f标记为(2)-10,第2块文库保存板第11列中16个孔的单克隆菌液合并的离f标记为(2)-11,第2块文库保存板第12列中16个孔的单克隆菌液合并的离f标记为(2)-12，第2块文库保存板第13列中16个孔的单克隆菌液合并的离f标记为(2)-13，第2块文库保存板第14列中16个孔的单克隆菌液合并的离f标记为(2)-14，第2块文库保存板第15列中16个孔的单克隆菌液合并的离f标记为(2)-15，第2块文库保存板第16列中16个孔的单克隆菌液合并的离f标记为(2)-16，第2块文库保存板第17列中16个孔的单克隆菌液合并的离f标记为(2)-17，第2块文库保存板第18列中16个孔的单克隆菌液合并的离f标记为(2)-18，第2块文库保存板第19列中16个孔的单克隆菌液合并的离f标记为(2)-19，第2块文库保存板第20列中16个孔的单克隆菌液合并的离f标记为(2)-20，第2块文库保存板第21列中16个孔的单克隆菌液合并的离f标记为(2)-21，第2块文库保存板第22列中16个孔的单克隆菌液合并的离f标记为(2)-22，第2块文库保存板第23列中16个孔的单克隆菌液合并的离f标记为(2)-23，第2块文库保存板第24列中16个孔的单克隆菌液合并的离f标记为(2)—24
第3块文库保存板
第3块文库保存板第1列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管记为(3)-1， 第3块文库保存板第2列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(3) -2 第3块文库保存板第3列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(3) -3 第3块文库保存板第4列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(3) -4 第3块文库保存板第5列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(3) -5 第3块文库保存板第6列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(3) -6 第3块文库保存板第7列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(3) -7 第3块文库保存板第8列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(3) -8 第3块文库保存板第9列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(3) -9
第3块文库保存板第10列中16个孔的单克隆菌液合并的离.心 f标记为(3)-10第3块文库保存板第11列中16个孔的单克隆菌液合并的离.心 f标记为(3)-11第3块文库保存板第12列中16个孔的单克隆菌液合并的离.心 f标记为(3)-12第3块文库保存板第13列中16个孔的单克隆菌液合并的离.心 f标记为(3)-13第3块文库保存板第14列中16个孔的单克隆菌液合并的离.心 f标记为(3)-14第3块文库保存板第15列中16个孔的单克隆菌液合并的离.心 f标记为(3)-15第3块文库保存板第16列中16个孔的单克隆菌液合并的离.心 f标记为(3)-16第3块文库保存板第17列中16个孔的单克隆菌液合并的离.心 f标记为(3)-17第3块文库保存板第18列中16个孔的单克隆菌液合并的离.心 f标记为(3)-18第3块文库保存板第19列中16个孔的单克隆菌液合并的离.心 f标记为(3)-19第3块文库保存板第20列中16个孔的单克隆菌液合并的离.心 f标记为(3)-20第3块文库保存板第21列中16个孔的单克隆菌液合并的离.心 f标记为(3)-21第3块文库保存板第22列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(3) -22， 第3块文库保存板第23列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(3) -23， 第3块文库保存板第M列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(3)-24 ； 依此类推，到第140块文库保存板时，合并单克隆菌液的离心管标记是 第140块文库保存板第1列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管记为(140)-1， 第140块文库保存板第2列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(140)-2 第140块文库保存板第3列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(140)-3 第140块文库保存板第4列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(140)-4 第140块文库保存板第5列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(140)-5 第140块文库保存板第6列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(140)-6 第140块文库保存板第7列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(140)-7 第140块文库保存板第8列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(140)-8 第140块文库保存板第9列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(140)-9
第140块文库保存板第10列中16个孔的单克隆菌液合并的离.心 f标记为(Η Ο--10第140块文库保存板第11列中16个孔的单克隆菌液合并的离.心 标记为 (140)--11第140块文库保存板第12列中16个孔的单克隆菌液合并的离.心 f标记为(Η Ο--12第140块文库保存板第13列中16个孔的单克隆菌液合并的离.心 标记为 (140)--13第140块文库保存板第14列中16个孔的单克隆菌液合并的离.心 f标记为(Η Ο--14第140块文库保存板第15列中16个孔的单克隆菌液合并的离.心 标记为 (140)--15第140块文库保存板第16列中16个孔的单克隆菌液合并的离.心 f标记为(Η Ο--16第140块文库保存板第17列中16个孔的单克隆菌液合并的离.心 标记为 (140)--17第140块文库保存板第18列中16个孔的单克隆菌液合并的离.心 f标记为(Η Ο--18第140块文库保存板第19列中16个孔的单克隆菌液合并的离.心 标记为 (140)--19第140块文库保存板第20列中16个孔的单克隆菌液合并的离.心 f标记为(Η Ο--20第140块文库保存板第21列中16个孔的单克隆菌液合并的离.心 标记为 (140)--21第140块文库保存板第22列中16个孔的单克隆菌液合并的离.心 f标记为(Η Ο--22第140块文库保存板第23列中16个孔的单克隆菌液合并的离.心 标记为 (140)--23第140块文库保存板第M列中16个孔的单克隆菌液合并的离心售f标记为(140)-24
2) 二级混合池的构建
对步骤(1)的一级混合池再进行组合，将每一块文库保存板所对应的M个一级混合池合并成一个二级混合池(图2)，具体操作是从第1文库保存板开始，依次，将每一文库保存板所对应的M个一级混合池中的混合菌液分别用最大量程为200 μ 1移液枪吸取50 μ 1 混合菌液，合加在一个空的1. 5ml离心管中，将离心管标记为X，X为文库保存板的编号， X=I,2,3,……自然数，该混合池命名为X号二级混合池；每次吸取一个一级混合池的混合菌液之前，先用该移液枪充分混勻，并且每次更换无菌移液枪头；将构建成的二级混合池放入37°C恒温摇床中培养6 他；因每一块文库保存板所对应的M个一级混合池合并成一个二级混合池，云南药用野生稻BIBAC基因文库有140块文库保存板，所以构成140个二级混合池，即二级混合池的数为X，X=云南药用野生稻BIBAC基因文库的文库保存板数； 以下以第1块文库保存板，第2块文库保存板，第3块文库保存板，第140块文库保存板为例，更具体地说明各文库保存板所对应的M个一级混合池合并成一个二级混合池及其标记
第1块文库保存板所对应的M个一级混合池分别是(I)-I号一级混合池，(1)-2号一级混合池，(1)-3号一级混合池，(1)-4号一级混合池，(1)-5号一级混合池，(1)-6号一级混合池，(1)-7号一级混合池，(1)-8号一级混合池，(1)-9号一级混合池，(I)-IO号一级混合池，(I)-Il号一级混合池，(1)-12号一级混合池，(1)-13号一级混合池，(1)-14号一级混合池，(1)-15号一级混合池，(1)-16号一级混合池，(1)-17号一级混合池，(1)-18号一级混合池，(1)-19号一级混合池，(1)-20号一级混合池，(1)-21号一级混合池，(1)-22 号一级混合池，(1) -23号一级混合池，(1) -24号一级混合池；将这M个一级混合池按上述方法合并后的二级混合池标记是1，X=I ；命名为1号二级混合池
第2块文库保存板所对应的M个一级混合池分别是(2)-1号一级混合池，(2)-2号一级混合池，(2)-3号一级混合池，(2)-4号一级混合池，(2)-5号一级混合池，(2)-6号一级混合池，(2)-7号一级混合池，(2)-8号一级混合池，(2)-9号一级混合池，(2)-10号一级混合池，(2)-11号一级混合池，(2)-12号一级混合池，(2)-13号一级混合池，(2)-14号一级混合池，(2)-15号一级混合池，(2)-16号一级混合池，(2)-17号一级混合池，(2)-18号一级混合池，(2)-19号一级混合池，(2)-20号一级混合池，(2)-21号一级混合池，(2)-22 号一级混合池，(2) -23号一级混合池，(2) -24号一级混合池；将这M个一级混合池按上述方法合并后的二级混合池的标记是2，X=2 ；命名为2号二级混合池；
第3块文库保存板所对应的M个一级混合池分别是(3) -1号一级混合池，(3) -3号一级混合池，(3) -4号一级混合池，(3) -5号一级混合池，(3) -6号一级混合池，(3) -7号一级混合池，(3)-8号一级混合池，(3)-9号一级混合池，(3)-10号一级混合池，(3)-11 号一级混合池，(3) -12号一级混合池，(3) -13号一级混合池，(3) -14号一级混合池， (3) -15号一级混合池，(3) -16号一级混合池，(3) -17号一级混合池，(3) -18号一级混合池，(3) -19号一级混合池，(3) -20号一级混合池，(3) -21号一级混合池，(3) -22号一级混合池，(3) -23号一级混合池，(3) -24号一级混合池；将这M个一级混合池按上述方法合并后的二级混合池的标记是3，X=3 ；命名为3号二级混合池；
依此类推，到第140块文库保存板时，第140块文库保存板所对应的M个一级混合池分别是(140) -1号一级混合池，(140) -2号一级混合池，(140) -3号一级混合池，(140) -4 号一级混合池，(140) -5号一级混合池，(140) -6号一级混合池，(140) -7号一级混合池， (140) -8号一级混合池，(140) -9号一级混合池，(140) -10号一级混合池，(140) -11号一级混合池，(140) -12号一级混合池，(140) -13号一级混合池，(140) -14号一级混合池， (140)-15号一级混合池，(140)-16号一级混合池，(140)-17号一级混合池，(140)-18号一级混合池，(140) -19号一级混合池，(140) -20号一级混合池，(140) -21号一级混合池， (140) -22号一级混合池，(140) -23号一级混合池，(140) -24号一级混合池；将这M个一级混合池按上述方法合并后的二级混合池的标记是140，X=140 ；命名为140号二级混合池；
3)三级混合池的构建
按步骤(2)的二级混合池编号顺序从1号二级混合池开始，每10个二级混合池合并成为一个三级混合池(图3)，将每10个二级混合池中混合菌液分别用最大量程为200 μ 1移液枪吸取100 μ 1混合菌液，合加在一个空的1. 5mL离心管中，将离心管标记为1，即n=l，该混合池命名为1号三级混合池，共构成X/10个三级混合池，X与文库保存板的编号相同，云南药用野生稻BIBAC基因文库有140块文库保存板，即X=140，X/10=140/10=14，所以构成 14个三级混合池；
以下从1号二级混合池开始，将1号二级混合池至10号二级混合池的10个二级混合池合并成一个三级混合池，依次，至140号二级混合池的合并及标记如下
将1号二级混合池，2号二级混合池，3号二级混合池，4号二级混合池，5号二级混合池，6号二级混合池，7号二级混合池，8号二级混合池，9号二级混合池和10号二级混合池共10个二级混合池按上述方法合并成一个三级混合池，其离心管标记为1，n=l，该混合池命名为1号三级混合池；
将11号二级混合池，12号二级混合池，13号二级混合池，14号二级混合池，15号二级混合池，16号二级混合池，17号二级混合池，18号二级混合池，19号二级混合池和20号二级混合池共10个二级混合池按上述方法合并成一个三级混合池，其离心管标记为2，n=2, 该混合池命名为2号三级混合池；
将21号二级混合池，22号二级混合池，23号二级混合池，M号二级混合池，25号二级混合池J6号二级混合池，27号二级混合池，观号二级混合池，四号二级混合池和30号二级混合池共10个二级混合池按上述方法合并成一个三级混合池，其离心管标记为3，n=3, 该混合池命名为3号三级混合池；
将31号二级混合池，32号二级混合池，33号二级混合池，34号二级混合池，35号二级混合池，36号二级混合池，37号二级混合池，38号二级混合池，39号二级混合池和40号二级混合池共10个二级混合池按上述方法合并成一个三级混合池，其离心管标记为4，n=4, 该混合池命名为4号三级混合池；
将41号二级混合池，42号二级混合池，43号二级混合池，44号二级混合池，45号二级混合池，46号二级混合池，47号二级混合池，48号二级混合池，49号二级混合池和50号二级混合池共10个二级混合池按上述方法合并成一个三级混合池，其离心管标记为5，n=5, 该混合池命名为5号三级混合池；
将51号二级混合池，52号二级混合池，53号二级混合池，54号二级混合池，55号二级混合池，56号二级混合池，57号二级混合池，58号二级混合池，59号二级混合池和60号二级混合池共10个二级混合池按上述方法合并成一个三级混合池，其离心管标记为6，n=6, 该混合池命名为6号三级混合池；
将61号二级混合池，62号二级混合池，63号二级混合池，64号二级混合池，65号二级混合池，66号二级混合池，67号二级混合池，68号二级混合池，69号二级混合池和70号二级混合池共10个二级混合池按上述方法合并成一个三级混合池，其离心管标记为7，n=7, 该混合池命名为7号三级混合池；
将71号二级混合池，72号二级混合池，73号二级混合池，74号二级混合池，75号二级混合池，76号二级混合池，77号二级混合池，78号二级混合池，79号二级混合池和80号二级混合池共10个二级混合池按上述方法合并成一个三级混合池，其离心管标记为8，n=8, 该混合池命名为8号三级混合池；
将81号二级混合池，82号二级混合池，83号二级混合池，84号二级混合池，85号二级混合池，86号二级混合池，87号二级混合池，88号二级混合池，89号二级混合池和90号二级混合池共10个二级混合池按上述方法合并成一个三级混合池，其离心管标记为9，n=9, 该混合池命名为9号三级混合池；
将91号二级混合池，92号二级混合池，93号二级混合池，94号二级混合池，95号二级混合池，96号二级混合池，97号二级混合池，98号二级混合池，99号二级混合池和100号二级混合池共10个二级混合池按上述方法合并成一个三级混合池，其离心管标记为10， n=10，该混合池命名为10号三级混合池；
将101号二级混合池，102号二级混合池，103号二级混合池，104号二级混合池，105号二级混合池，106号二级混合池，107号二级混合池，108号二级混合池，109号二级混合池和 110号二级混合池共10个二级混合池按上述方法合并成一个三级混合池，其离心管标记为 11，n=ll，该混合池命名为11号三级混合池；
将111号二级混合池，112号二级混合池，113号二级混合池，114号二级混合池，115号二级混合池，116号二级混合池，117号二级混合池，118号二级混合池，119号二级混合池和 120号二级混合池共10个二级混合池按上述方法合并成一个三级混合池，其离心管标记为 12，n=12，该混合池命名为12号三级混合池；
将121号二级混合池，122号二级混合池，123号二级混合池，124号二级混合池，125 号二级混合池，126号二级混合池，127号二级混合池，128号二级混合池，129号二级混合池和130号二级混合池共10个二级混合池按上述方法合并成一个三级混合池，其离心管标记为13，n=13，该混合池命名为13号三级混合池；
将131号二级混合池，132号二级混合池，133号二级混合池，134号二级混合池，135号二级混合池，136号二级混合池，137号二级混合池，138号二级混合池，139号二级混合池和 140号二级混合池共10个二级混合池按上述方法合并成一个三级混合池，其离心管标记为 14，n=14，该混合池命名为14号三级混合池；
(2)用常规的转基因方法分别将各三级混合池中的混合克隆导入受体植物，获得渗入
系
1)三级混合池质粒的提取
参照《分子克隆实验指南》(第三版)(2005，科学出版社)的SDS碱裂解法提取各三级混合池质粒，具体提取过程如下
①吸取300 μ 1 -70°C保存的三级混合池菌液到30 ml LB液体培养基(50 mg/L km, 5%蔗糖)中，在37°C恒温摇床，225rpm培养过夜；
②将培养的单个三级混合池菌液倒入6支1.5ml离心管中收集菌体，每管分三次收集菌液，每管共收集1.5X3=4. 5mL菌液；
③向每个离心管中加入150μ ISolution I，剧烈振荡；
④向每个离心管中加入225μ 1 Solution III，温和颠倒5次，冰上放置15min ；
⑤4°C，12000rpm，15min，将上清液转移到另一新的离心管中；
⑥(为减少体积，使离心管不溢出)向离心管中加2/3体积的异丙醇，混勻， 放在一20°C，Ih ;4°C，12000rpm, 15 min,收集沉淀；
⑦用300μ 1无菌水溶解沉淀，再加等体积(300 μ 1 ) LiCl溶液(LiCl使RNA 沉淀)，室温放置10 min, 10000 rpm ；⑧加等体积酚氯仿(1:1)振荡混勻，12000 rpm, 10 min ；
⑨取上清，加等体积氯仿(抽提)，4°C，12000rpm, 10 min ；
⑩取上清，加2倍体积的无水乙醇，一20°C放置Ih；
4°C, 12000 rpm，15min，保留沉淀，移去上清； 加质量分数为70%的乙醇1 ml，洗沉淀，4°C，12000 rpm, 12000 rpm
重复步骤 ；
0待乙醇挥发完全后，加入IXTE 20μ1，(加1-2 μ 1 RNase)，将6支离心管的DNA合
并在一个离心管中，一20°C保存；
2)农杆菌LBA4404感受态细胞的制备
①挑取农杆菌LBA4404单菌落接种于20ml YEB液体培养基中，28°C，180 rpm,振荡培养过夜；
② 将菌液按1 100转移至200 ml YEB (加抗生素STR和RFP，)培养液中扩大培养，28°C，180rpm，振荡培养至0D600=0. 5—1.0 ；
③在无菌条件下将菌液转入200ml 20°C预冷的无菌离心管中，冰上放置 30min，4°C，5000rpm，离心 lOmin，倒尽上清；
④用100ml冰浴的无菌双蒸水重悬，4°C，5000rpm，离心lOmin，倒尽上清；
⑤重复步骤④2 3次；
⑥用50ml冰浴的10%无菌甘油悬浮菌体，4°C，5000rpm，离心lOmin，
倒尽上清；
⑦重复⑥1次，离心，倒掉上清，将离心管倒置，以回流的少量(约2-3ml) 10%甘油重悬菌体，于冰上每支1. 5 ml无菌离心管分装200 μ 1，一80°C保存；
3)三级混合池质粒电击法转化农杆菌LBA4404感受态细胞
①取出步骤(2)中2)农杆菌LBA4404感受态细胞的制备⑦获得的农杆菌LBA4404感受态细胞试管于冰上冻融，共14支试管，每个试管按1,2,3,4,5,6, 7,8,9, 10，11，12，13，14 依次编号，并每个试管的编号标记所对应的三级混合池的标记；如1号试管对应的三级混合池是1号三级混合池，标记为1 ；2号试管对应的三级混合池是2号三级混合池，标记为 2，3号试管对应的三级混合池是3号三级混合池，标记为3 ；以此类推，14号试管对应的三级混合池是14号三级混合池，标记为14 ；
②分别吸取2μ1步骤(2)中1)三级混合池质粒的提取所提取的三级混合池质粒，分别加入到上述已编号的试管中，用移液枪枪头轻轻搅拌均勻，并迅速转移至无菌的-20°C预冷的电击杯中，电极间距为0. Icm,吸干电击杯表面的水；将电击杯放入ΒΙΟ-PULSE电转化仪的电极之间，在1. Skv高压下电击；
③取出电击杯，在每支试管中分别加入ImlYEB培养液，用移液枪混勻，分别吸出每支试管中的菌液分别转入1.5ml无菌离心管中，28°C，180 r/min振荡培养池；④分别将步骤3)中③经培养的每支试管中的50 μ 1菌液涂在含有50 mg/L Km的YEB 固体平板上J8°C，倒置培养1. 5 2d，观察转化子；用没有加三级混合池质粒的农杆菌 LBA4404感受态细胞在同样条件下电击，以做阴性对照；
4)转化子的分子检测
将步骤(2)中3)④获得的转化子取出，用无菌牙签在YEB固体培养基上(添加50 mg/L Km，100 mg/L Sm)划线，每次每个平板上划20个左右的克隆，并标上相应三级混合池的编号，在下暗培养3d;用无菌勺子轻轻刮取每个农杆菌克隆长出的菌苔，按相等的量分别接入盛有200 ml YEB液体培养基(添加50 mg/L Km，100 mg/L Sm)的三角瓶(500 ml) 中摇菌，28°C，180r/min避光培养12h(0D600=l. 0左右)，由此制备成转化子的检测样品，并用未转化质粒的农杆菌LBA4404做阴性对照；
对获得的每个农杆菌克隆以基因引物进行PCR法检测，所述的新霉素基因 (/7/7 II)特异引物的碱基序列是
5' -TCGGCTATGACTGGGCACAACAGA-3‘ 5’ -AAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCG-3 ‘
扩增反应结束后，取5ul反应液，用1.0%的琼脂糖电泳分离，电泳结束后，紫外灯下观察结果并照相，经检测，7号三级混合池有阳性克隆，如图4所示；
对获得的每个农杆菌克隆以fecB基因5’端引物和/7辦11基因5’端引物进行PCR法检测，
nptll基因5’端引物序列 5’ -TGTCTGTTGTGCCCAGTCATAG-3’ ， McB基因5’端引物 5， -TACCTGTTCACTGACTCCC3，，
扩增反应结束后，取5ul反应液，用1.0%的琼脂糖电泳分离，电泳结束后，紫外灯下观察结果并照相，如图5所示，表明农杆菌克隆中BIBAC2质粒携带了药用野生稻基因片段；
上述两个的PCR反应体系如下①10XPCR Buffer: 2. 5 μ 1②dNTP混合液(2. 5 mmol/L):2y 1, (3) Mgcl2 (25mmol/L) :1. 5 μ 1,④ 10mmol/L 引物(正、反)各 1. 25 μ 1，⑤ Taq 酶(5υ/μ 1) :0. 3uL ⑥ DNA:2y 1，⑦ ddH2o: 15. 2 μ 1，总体积为 25 μ 1。最后在反应体系上覆盖一层液体石蜡油；上述两个的PCR反应的PCR扩增程序见图8 ；
5)阳性转化克隆的保存
根据步骤4)转化子的分子检测的结果所得到的阳性克隆，分别用无菌牙签挑到装有ImlYEB液体培养基(添加50 mg/L Km, 100 mg/L Sm, 12%甘油)的1. 5ml离心管中(每管挑一个克隆)，8°C，180r/min进行振荡培养，离心管上标上对应三级混合池的编号，待培养到0D600=0. 5左右时，放到一80°C保存备用；
6)以日本晴、中花11栽培稻品种为受体植物采用农杆菌介导转基因方法将步骤(2)中 5)所保存的阳性转化克隆分别导入所述的栽培稻获得渗入系。 实施例3渗入系中转基因DNA分子鉴定 1、水稻总DNA的提取
分别取两种渗入系幼嫩叶片0. 2-1. 0g，用CTAB法抽提基因组DNA，所述的渗入系是7号三级混合池转化获得的日本晴抗性苗和花U抗性苗； 2、渗入系的如 基因和基因检测
分别用潮霉素基因(如 )引物和新霉素基因(/^ ΙΙ)引物分别对步骤1提取的渗入系基因组DNA和对照植株基因组DNA进行PCR检测； 所述的潮霉素基因(Mpt)特异引物的碱基序列是 5’ -GATGTAGGAGGGCGTGGATATGTC-3’， 5' -CTTCTACACAGCCATCGGTCCAGA-3‘ 所述的新霉素基因(《/7 ΙΙ)特异引物的碱基序列是 5' -TCGGCTATGACTGGGCACAACAGA-3‘ 5’ -AAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCG-3 ‘
PCR反应体系如下① 10XPCR Buffer: 2. 5 μ 1 ② dNTP 混合液(2. 5 mmol/L):2y 1, ③ Mgclj25mmol/L) :1· 5μ 1，④ 10mmol/L 引物(正、反)各 1· 25 μ 1，⑤ Taq 酶(5U/ μ 1) :0. 3μ 1,⑥DNA:2yl，⑦ddH2o: 15. 2 μ 1，总体积为25 μ 1。最后在反应体系上覆盖一层液体石蜡油；
PCR反应扩增程序见图9 ；
扩增反应结束后，取5 μ 1反应液，用1. 0 %的琼脂糖电泳分离，电泳结束后，紫外灯下观察结果并照相(如图6、图7所示)。扩增产物分别为85^ρ的如 片段和72^ρ的nptW片段。从图6，图7可以看出，用如 ，/7辦11基因引物对获得的渗入系进行基因组PCR 扩增，分别显示出852bp和722bp大小的目的条带。片段大小与阳性对照的条带一致，证明 hpt,nptll基因已整合到日本晴、中花11植株的基因组中。综合图5-图7所示，即可证明已得到了携带云南药用野生稻大片段基因的渗入系材料。实验涉及的主5试■及培养基的配置
FreeEmffer _存儲存観)！ IL
药!!名称配方中的量SS方终浓度
TrvptoncIUg1.0%
Yeast Extract5gO 5%
NaCJ10g〗0%
K2HPO46 27g36nM
ICH2PO4丨 SOg]3.2raM
sodium citr ate(X 50 g17 mM
MgSCvTH2OO-ICig0.4mM
(NKikSOi0.90g6 SmM
*上面的药S充分8 后，定容〗L,倒出44ml,加入44 ml甘油。1211K 20mmM aifiife
細来廿《
Tris-HClfl.0M,pH8.0) IL
药品名称 配方中的量配方终浓度
Tris-base 121.Ig1.0M HCl 42ml 加ddH20至1L,调节pH为8.0, 121'C灭菌20mm,室温保存。 Ti0Ei(pH8.0) IL
药品名称 S己方中的量Sfi方终浓度
Tris-HClCl. OM,PH5.0) IOmlIOmM
EDTA(0.5M,PH5.0) 2mlImM 加ddH20至1L, J.2.fC灭菌20mm,室温保存。
权利要求
1.一种快速构建水稻渗入系发掘优良基因的方法，包括如下步骤 Cl)构建BIBAC基因文库混合池①一级混合池的构建待BIBAC基因文库的文库保存板中的单克隆菌液完全融化后，将每一块文库保存板中每一列中的16个孔内的单克隆菌液合并成一个一级混合池，将一级混合池标记为(X)-y， X为文库保存板的编号，X=l，2，3，……自然数，y为每一块文库保存板中列的编号，y=l， 2,3,……自然数，该一级混合池命名为(X) _y号一级混合池；②二级混合池的构建将每一块文库保存板所对应的一级混合池合并成一个二级混合池，将二级混合池标记为X，X=l，2，3，……自然数，该二级混合池命名为X号二级混合池；X与文库保存板的编号相同；③三级混合池的构建按二级混合池编号顺序从1号二级混合池开始，每10个二级混合池合并成为一个三级混合池，将三级混合池记为η，η =1,2,3,……自然数，该三级混合池命名为η号三级混合池；(2)用常规转基因方法分别将各三级混合池中的混合克隆导入受体植物，获得渗入系。
2.根据权利要求1所述的一种快速构建水稻渗入系发掘优良基因的方法，其特征在于步骤(2)中所述的常规转基因方法为农杆菌介导转基因方法、基因枪、花粉管通道方法中的任一种。
3.根据权利要求2所述的一种快速构建水稻渗入系发掘优良基因的方法，其特征在于所述的BIBAC基因文库为野生稻BIBAC基因文库。
4.根据权利要求3所述的一种快速构建水稻渗入系发掘优良基因的方法，其特征在于所述的野生稻为药用野生稻。
5.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的一种快速构建水稻渗入系发掘优良基因的方法，其特征在于所述的受体植物为栽培稻。
全文摘要
本发明公开了一种快速构建水稻渗入系发掘优良基因的方法，该方法包括的一级混合池的构建是将每一块文库保存板中每一列中的16个孔内的单克隆菌液合并成一个一级混合池；二级混合池的构建是将每一块文库保存板所对应的一级混合池合并成一个二级混合池；三级混合池的构建是按二级混合池编号顺序从1号二级混合池开始，每10个二级混合池合并成为一个三级混合池；然后用常规转基因方法将各三级混合池中的混合克隆导入受体植物，获得渗入系。该方法节省了几万次转化手续，大幅度地减轻了科研人员的工作量，达到了简便、快速，可使该渗入系达到全基因组的插入，还能简便、快速和准确地查找到供体植物的优良基因定位，有利于供体优良基因的发掘利用。
文档编号A01H5/00GK102344928SQ20111025687
公开日2012年2月8日 申请日期2011年9月2日 优先权日2011年9月2日
发明者付坚, 余腾琼, 刘艳平, 张敦宇, 曾黎琼, 李娥贤, 李定琴, 李维蛟, 殷富有, 王玲仙, 程在全, 罗红梅, 钟巧芳, 黄兴奇 申请人:云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所