专利名称：一种生物饲料添加剂的生产方法
技术领域：
本发明属于饲料添加剂领域，特别涉及含有多种活菌制剂的高效生物饲料添加剂产品及其生产方法和应用。
背景技术：
目前我国奶牛存栏数约1000多万头，奶产量900多万吨，奶牛养殖业的迅速发展也促进和推动了我国饲料及添加剂行业的发展；但我国奶牛饲料仍停留在三大料(即玉米、麸皮、饼柏)的简单混合上，造成配方中蛋白质饲料单一、氨基酸搭配不当，奶的产量和质量与欧美国家相比都有很大差距。研究开发高效生物活性饲料添加剂，对于提高我国奶牛生产的水平，改善牛奶的质量，减少奶牛胃肠疾病和乳房炎的发病率，降低粪尿的不良气味和粪尿氮的排除量，减少环境污染和充分提高饲料资源的有效利用(即提高廉价粗饲料的利用率，提高饲料中营养物质的利用率等)具有重要的实际应用价值。目前市场上流行的活菌制剂基本上都是单一菌，而且主要应用在单胃动物饲料中，用于反刍动物(如奶牛)的产品目前只有美国和法国的2-3家的单一菌种制剂在我国宣传和做养殖推广实验，而国内还没有生产类似产品的企业。酵母、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌都是可以应用于饲料添加剂行业的益生菌，益生菌代谢产生的各种酶制剂及其有益代谢成分在促进 消化、稳定肠道菌群环境、提高饲料利用率方面具有较好的效果；泡盛曲霉可以代谢产生包括葡聚糖酶在内的多种酶制剂，其培养物作为饲料添加剂可以有效提高饲料的消化吸收效果。研制开发具有科学配比，且效果明显的的含有多种有益微生物且酶活力强的复合饲料添加剂对于促进养殖业，特别是奶牛养殖业具有非常重要的意义。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供一种高效生物活性饲料添加剂产品生产方法。本发明产品的具体生产方法步骤如下I.微生物菌剂的培养制备分别扩培并干燥得到黑曲霉孢子、地衣芽孢杆菌、酵母和鼠李糖乳杆菌。(I)黑曲霉孢子制备斜面孢子悬浮液液接种到麦芽汁固态培养基上，30°C培养2天半至长满孢子，低温流化床干燥，粉碎干燥物。(2)地衣芽孢杆菌的制备斜面菌株经活化后，接入液体种子培养基，在37°C、180rpm的摇床培养一定时间后接种至发酵罐中，在37°C、通风比I : I (v/v),400rpm培养2天至对数后期。发酵结束后，加入助滤剂轻质碳酸钙，经板框过滤，流化床干燥。(3)酵母的制备斜面菌种接入三角瓶，培养至对数期后转接入发酵罐中，控制温度为28°C，通风比为I : I. 5 (v/v)，培养20小时左右至对数期。发酵结束后，加入助滤剂轻质碳酸钙，经板框过滤，流化床干燥。(4)鼠李糖乳杆菌的制备斜面菌种接入三角瓶，培养至对数期后转接入发酵罐中，控制温度为45°C，通风比为I : 0.1 (v/v)，培养18小时左右至对数期。发酵完毕经板框过滤分离获得湿菌体，加入组成为10%脱脂奶、5%海藻糖、5%甘油的保护剂，通过冷冻干燥获得菌剂，水分含量低于10%。2、菌剂复配将上述各种菌按照比例进行复配，菌剂复配比例如下黑曲霉25-50份、地衣芽孢杆菌10-25份、酵母15-25份、鼠李糖乳杆菌25-40份。本发明采用的菌种如下酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CGMCC No. 4429菌种同专利申请名称为一株耐高渗酵母菌的应用中保藏菌种，专利申请号201110105966，
公开日为2011.09. 14。鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CGMCC No. 4430菌株特点如下在显微镜下观察，该菌株为杆状，宽度小于I U m，2到3个杆菌易于连成连接在一起；在固体培养基上，该菌菌落为乳白色，表面光滑，湿润，粘稠，边缘较整齐。与原始菌相比，该诱变菌株在形态上明显小于出发菌株。出发菌株鼠李糖乳杆菌CGMCCNo. I. 2134购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明鼠李糖乳杆菌采用下述流程进行选育原始出发菌种一试管活化一高温驯化一硫酸二乙酯(DES)诱变一高糖平板筛选一亚硝基胍(NTG)诱变筛选一高温菌筛选一摇瓶复筛一传代稳定性试验一5L发酵罐试验。将目的菌株CGMCCNo. 4430做5L乳酸发酵罐实验，结果表明与出发菌株相比，CGMCC No. 4430葡萄糖耐受浓度可以达到270g/L，与原始菌相比提高了 95% ;发酵结束后，乳酸含量为60g/L，与原始菌 相比提高了 158%。鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CGMCC No. 4430保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2010年12月8日。地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC No. 3. 5269、地衣芽抱杆菌(Bacilluslicheniformis)CGMCC No. I. 813购于中国普通微生物菌种保藏管理中心。本发明中采用微生物平板计数方法检测活菌数。本发明中菌剂复配的较优比例为黑曲霉25-40份、地衣芽孢杆菌10-20份、酵母15-20份、鼠李糖乳杆菌25-35份。生物饲料添加剂组成为黑曲霉孢子浓度I. 0 9. OX IO8个/克、地衣芽孢杆菌为I. 0 9. OX IO8个/克、酵母I. 0 8. 5X IO8个/克、鼠李糖乳杆菌I. 3 8. 5X108个/克。发明产品采用科学研究的菌剂复配比例技术有效确保产品中各种微生物菌剂的合理组成和比例，使得产品中微生物产生的酶在奶牛饲喂中可以有效促进饲料的消化吸收；复配技术使得产品在奶牛饲料的消化吸收率大幅提高，单位用量饲料的产出比例比对照有了显著提高，奶牛的产量和质量得以提高和保障。发明产品的性能稳定，使用安全，与其它饲料添加剂均无配合禁忌。本发明产品在质量稳定可控，无环境污染，而且可以提高免疫力能够提高养殖效益。产品完全符合绿色饲料添加剂的要求。有明显提高日增重和饲料转化率效果。本发明产品中鼠李糖乳杆菌和酵母对动物胃肠道的消化有辅助作用，酵母在瘤胃中为瘤胃微生物的生长繁殖提供了有益的氨基酸、B族维生素和其它微量元素，增加瘤胃微生物蛋白质的合成量。鼠李糖乳杆菌在奶牛的小肠释放，可以消耗动物肠道内的氧气，使肠道内有害的致病菌如好氧菌(主要是大肠杆菌、沙门氏菌等)受到抑制，还能抑制氨和胺的合成，益增强免疫力，达到改善奶牛胃肠道微生物生态平衡，有利于健康和提高生产性能的目的；地衣芽孢杆菌在肠道代谢产生的酶类和黑曲霉发酵培养物中含有的有效剂量的纤维素酶、葡聚糖酶、木质素分解酶和淀粉酶有利于奶牛等反刍动物饲料中纤维类饲料的消化吸收，改善反刍动物肠道的微生态平衡，提高饲料利用率，提高奶牛产奶量，提高牛奶的品质，提高奶牛肌体免疫力，减少肠道疾病，净化饲养环境。该饲料添加剂可应用于奶牛养殖业，可以显著提高牛奶产量和质量。本发明产品能够提高奶牛肌体免疫力，减少隐性乳房炎、肠道疾病的发病率。目前，我国奶牛群中隐性乳房炎发病率是比较高的，奶牛一旦患有乳房炎就必须注射抗生素治疗，注射了抗生素的奶牛7天之内所产出的牛奶都不能出售(牛奶中会残留抗生素对人体有危害)。使用本发明产品可以降低奶牛隐性乳房炎发病率，饲喂试验表明本发明产品降低乳房炎发病率70% (与对照组比较)，明显减少奶牛乳房炎的发生，减少抗生素的使用和含抗生素奶的产出，间接提高了养殖者的效益。本发明产品对提高我国奶牛生产的水平，充分提高饲料资源的有效利用(即提高廉价粗饲料的利用率，提高饲料中营养物质的利用率等)等方面都具有很高的价值。本发明也适合其他反刍动物如肉牛、羊的饲喂。
具体实施例方式下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。实施例I :高效活性饲料添加剂产品生产方法产品组成如下黑曲霉孢子浓度1.0 3. OX IO8个/克、地衣芽孢杆菌为1.0 3. OX IO8个/克、酵母I. 0 3. 5X IO8个/克、鼠李糖乳杆菌I. 3 4. 5X IO8个/克。产品生产方法主要包括微生物菌剂的生产和复配工艺。微生物菌剂的生产黑曲霉孢子的制备方法I)斜面培养方法试管，12rC,20min灭菌后，摆斜面，冷却，接种。30°C培养到黑色孢子铺满斜面。2) K式培养瓶孢子取10° Brix麦芽汁加入2%琼脂，装入500mL K式培养瓶，121°C，20min灭菌后，铺斜面冷却。接入孢子悬浮液lmL，保证悬浮液接种于整个培养基表面；侧放入恒温箱，30 V培养到黑色孢子铺满斜面。3)固态放大培养将K式瓶孢子制成孢子悬浮液，孢子浓度大于I. OX IO8个/mL。取200kg固态培养基(麸皮140kg、10° Brix麦芽汁60L)，充分混匀后放入浅盘，在121°C下灭菌I小时。待放凉后，接入孢子悬浮液。培养温度控制在30°C，湿度80-90%，每隔10小时翻料一次，培养时间3天；待培养料长满孢子即可结束培养干燥粉碎发酵结束后，将浅盘放在流化床干燥，干燥温度控制在60°C，待物料水分含量将低于10%以下时，用粉碎机将固体培养料进行粉碎，物料粉碎孔径在100目以上。地衣芽孢杆菌的制备方法培养基组成(g/L):葡萄糖60，酵母提取物20，磷酸氢二钾0. 5，七水硫酸镁0. 5，pH6. 8o(I) 一级种子培养500mL摇瓶装液量为IOOmL,灭菌后接入一环地衣芽孢杆菌，在摇床上，180转/分，培养温度37°C，培养时间24小时至对数期；(2) 二级种子培养将一级种子按照10% (v/v)的接种量接入30L的种子罐中，装液量21L，培养温度37°C，搅拌速度200转/分，通风量(V/V)l 0. 5，罐压0. 05Mpa，培养时间24小时至对数期。(3)发酵罐培养将种子罐中的种子以1 0% (v/v)接种量接入300L发酵罐，装液量210L，培养温度37°C，搅拌速度200转/分，通风量(V/V) I 0. 5，罐压0. 05Mpa,培养时间24小时，培养结束菌浓度在5. OX IO9个/ml。(4)离心分离采用板框过滤分离获得菌体。(7)真空冷冻干燥添加保护剂后采用喷雾干燥工艺处理获得干粉菌剂；保护剂组成为脱脂奶10%、乳糖5%、甘油5%。
酵母菌的制备方法从斜面转接酵母菌到液体摇瓶，液体摇瓶经三级扩培后转接入发酵罐进行扩大培养，培养完毕低温浓缩、与载体混合，流化床干燥工艺获得活性酵母菌剂。酵母细胞的培养采用斜面菌种逐级扩培获得酵母细胞；(I) 一级种子培养将酵母斜面菌种接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床120转/分，培养温度30°C，培养时间18小时；(2) 二级种子培养将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；(3)三级种子培养将二级种子以10%接种量接入5000晕升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度30°C，培养时间18小时；(4) 一级种子罐培养将三级种子以5%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度30°C，搅拌速度100转/分，通风量(V/V)l 0.5，罐压
0.05Mpa，培养时间16小时；(5)发酵罐培养将一级种子罐菌种以5%接种量接入总容积为3吨二级种子罐，发酵培养基装量2吨，培养条件培养温度30°C，搅拌速度100转/分，前期通风量(V/V) I 0. 5，罐压0. 05Mpa,前期培养时间12小时；后期罐压0. 05Mpa,搅拌速度50转/分，培养时间8小时，培养末期的酵母浓度达到3. OX IO9个/ml。(6)浓缩发酵液经低温负压真空浓缩到原体积的45%，得到酵母菌浓缩液。(7)添加载体向酵母菌浓缩液中添加混合好的载体，混合均匀；浓缩液与载体的重量比为0. 5-0. 7 1，载体组成为=CaCO3 40份，糊精20份，玉米蛋白粉20份。(8)干燥流化床干燥，干燥温度50°C。培养基采用10%麦芽汁培养基或采用添加硫酸铵等无机盐的糖蜜培养基，具体培养生产工艺参见肖冬光《酿酒活性干酵母的生产与应用技术》。鼠李糖乳杆菌菌剂的制备斜面菌种接入三角瓶，培养至对数期后转接入发酵罐中，控制温度为45°C，通风比为I : 0.1 (v/v)，培养18小时左右至对数期。发酵完毕经板框过滤分离获得湿菌体，加入组成为10%脱脂奶、5%海藻糖、5%甘油的保护剂，通过冷冻干燥获得菌剂，水分含量低于10%。菌剂复配将上述各种菌剂按照如下比例进行复配，黑曲霉30份、地衣芽孢杆菌15份、酵母18份、鼠李糖乳杆菌28份，复配菌剂包装。
产品效果实验试验牛的选择与试验设计试验于2010年9月7日-10月7日在宁夏金积奶牛场进行，本试验采取随机配对原则，将40头牛随机的分为试验组和对照组，每组20头牛，在日粮中按每头每日添加产品40g，饲喂60天，结果表明实验组日增重972. 7g，对照组日增重746. Sg，差异极显著(P<0.01)。饲喂5天后，其粪便干物质和饲喂前相比，减少30 %。使用高效生物活性饲料添加剂I个月后，发现牛奶产量比较稳定，(不喂的组下降幅度较大，因为试验牛已过了泌乳高峰期)，乳脂率也增加了，效果很好。从奶牛外表来看， 喂高效生物活性饲料添加剂的奶牛的毛亮，食欲好，乳房炎发病率降低。
权利要求
1.一种生物活性饲料添加剂的生产方法，包括下述步骤 (1)微生物菌剂的培养制备 a.黑曲霉孢子制备菌种培养，固态发酵培养，低温流化床干燥，粉碎干燥物； b.地衣芽孢杆菌菌剂制备从斜面转接培养地衣芽孢杆菌，逐级扩培到发酵罐，发酵结束加入助滤剂轻质碳酸钙，板框过滤，流化床干燥获得菌剂； c.酵母菌剂制备斜面菌种经多级扩培获得发酵液，发酵结束加入助滤剂轻质碳酸钙，板框过滤，流化床干燥获得菌剂； d.鼠李糖乳杆菌菌剂制备斜面逐级培养鼠李糖乳杆菌获得发酵液，板框过滤分离获得湿菌体，加入组成为10%脱脂奶、5%海藻糖、5%甘油的保护剂，冷冻干燥获得菌剂； (2)菌剂复配将上述各种菌剂复配，比例为黑曲霉25-50份、地衣芽孢杆菌10-25份、酵母15-25份、鼠李糖乳杆菌25-40份。
2.根据权利要求I所述的生物活性饲料添加剂的生产方法，其特征在于菌剂复配比例为黑曲霉25-40份、地衣芽孢杆菌10-20份、酵母15-20份、鼠李糖乳杆菌25-35份。
3.根据权利要求2所述的生物活性饲料添加剂的生产方法，其特征在于菌剂复配比例为黑曲霉30份、地衣芽孢杆菌15份、酵母18份、鼠李糖乳杆菌28份。
全文摘要
本发明公开了一种生物饲料添加剂生产方法，属于饲料添加剂领域，解决了含有多种活菌制剂的高效生物饲料添加剂产品及其生产方法和应用的技术问题。涉及生物饲料添加剂组成为黑曲霉孢子浓度1.0～9.0×108个/克、地衣芽孢杆菌为1.0～9.0×108个/克、酵母1.0～8.5×108个/克、鼠李糖乳杆菌1.3～8.5×108个/克。本饲料含有多种有益微生物且酶活力强，经实验验证本饲料对于奶牛产奶量及牛奶成分均有显著提高作用。
文档编号A23K1/16GK102813080SQ201110419569
公开日2012年12月12日 申请日期2011年12月15日 优先权日2011年12月15日
发明者李政, 张健飞, 王玉, 李绩 申请人:天津工业大学