专利名称：天然芸苔素内酯类似物的应用的制作方法
天然芸苔素内酯类似物的应用技术领域
本发明属于农用化学技术领域，具体而言，本发明涉及提取自植物的芸苔素内酯类似物及其应用，包括促进植物生长、抗低温和耐高盐等方面的应用。
背景技术：
芸苔素内酯是国际上公认为活性最高的高效、广谱、无毒的植物生长调节剂，生理效益比已经发现的另外五大类植物激素高，而被称为世界第六大类植物激素。芸苔素内酯广泛存在于被子植物、裸子植物和某些低等植物中，从在植物体内的分布来看，存在于根、茎、叶、花粉、雌蕊、果实和种子中，如油菜花粉中含有较丰富的芸苔素内酯。
化学合成的芸苔素内酯，如中国专利申请CN1217337A、CN1217338A等所述的，虽然产品较为均一，但是活性成分单一，长期施用效果通常不如天然芸苔素内酯好，这在中国国内已经广泛使用的28-表高芸苔素内酯上表现得尤为突出。
从植物(如，花粉)或其他天然来源(如，蜂蜡)中提取的芸苔素内酯，其中通常含有多种芸苔素内酯结构类似物，其作为一种绿色的生产资料，其推广使用更容易为国内外用户所推崇，但是由于提取中工艺的限制，容易产生产品质量不稳定的情况；如果进一步提纯，则制备成本上升较大，不利于产业化实施，因而阻碍了人们进一步大量纯化，并阻碍了人们去研究其中各芸苔素内酯类似物是否具有芸苔素内酯的活性。例如，Zhu，W.M.等(Synthetic Communications,32 (9 ),1385-1391)和Suksamararn,Α.等(Tetrahedron,58,6033-6037)合成了一些化合物，但仅仅被当成昆虫的蜕皮激素类似物而只启示其的昆虫激素应用。
本发明人通过长期而艰苦的努力，摸索出了从植物中提取(纯化)芸苔素内酯类似物的稳定流程，精心研究了其中的各种提取溶剂，尽管其中需要一定的提纯过程，但是只需要一次提取过程，最终可以收集到多种分离的高纯度的天然芸苔素内酯类似物，因而摊薄了提纯的成本，有利于产业化推广实施；这些分离的天然芸苔素内酯类似物可以单独施用，也可以配比混和施用，因而产品质量稳定而容易控制。在获得了大量分离的高纯度的天然芸苔素内酯类似物的基础上，本发明人进一步研究，令人意外地发现了，这些天然芸苔素内酯类似物在植物生物活性增加、抗低温和耐高盐等方面均有效用，甚至在一定条件下效果、活性高于现有化学合成的芸苔素内酯类产品。发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供了新的天然芸苔素内酯类似物的提取方法和应用，包括促进植物发育、提高植物发芽率、增加植物抗低温性和/或增加植物耐高盐性的应用。另外，本发明还提供了配比稳定的农用组合物，其中包含天然芸苔素内酯类似物。
具体而言，在第一方面，本发明提供了天然芸苔素内酯类似物的提取方法，其包括，
(I)用80 100% (V/V)乙醇水溶液提取破碎的油菜花粉，固液分离后保留滤液(任选其中滤液进一步浓缩)，获得醇溶性提取液；
(2)将醇溶性提取液与O 60% (V/V)乙醇水溶液混合，然后加入乙酸乙酯萃取，保留乙酸乙酯层并加入酯酶进行不完全反应，然后干燥，获得酯溶性提取物；
(3)酯溶性提取物上样于硅胶色谱柱，用甲醇和乙酸乙酯的混和液洗脱，收集含有天然芸苔素内酯类似物的洗脱液，干燥并溶解于甲醇中，获得硅胶柱纯化液；和
(4)将硅胶柱纯化液上样于C18反相色谱柱，用乙腈和水的混和液洗脱，分别收集含有如式BR6、BR1、BR2、BR3、BR4和/或BR5所示的天然芸苔素内酯类似物的洗脱液。
在本文中，“天然”指的是从所限定的物质是从天然来源(如花粉、蜂蜡等)中提取的。在本发明的具体实施方式
中，所提供的芸苔素内酯类似物是从油菜花粉中。当然，由于已经解析了这些天然芸苔素内酯类似物，因此它们不限于从天然来源(如花粉、蜂蜡等)中提取，也可以是化学合成的。
在本文中，如式BR6、BRl、BR2、BR3、BR4和BR5所示的天然芸苔素内酯类似物的结构式如下:
权利要求
1.天然芸苔素内酯类似物的提取方法，其包括， (1)用80 100%(V/V)乙醇水溶液提取破碎的油菜花粉，固液分离后保留滤液(任选其中滤液进一步浓缩)，获得醇溶性提取液； (2)将醇溶性提取液与O 60%(V/V)乙醇水溶液混合，然后加入乙酸乙酯萃取，保留乙酸乙酯层并加入酯酶和糖化酶进行不完全反应，然后干燥，获得酯溶性提取物； (3)酯溶性提取物上样于硅胶色谱柱，用甲醇和乙酸乙酯的混和液洗脱，收集含有天然芸苔素内酯类似物的洗脱液，干燥并溶解于甲醇中，获得硅胶柱纯化液；和 (4)将硅胶柱纯化液上样于C18反相色谱柱，用乙腈和水的混和液洗脱，分别收集含有如式BR6、BR1、BR2、BR3、BR4和/或BR5所示的天然芸苔素内酯类似物的洗脱液:
2.权利要求1所述的提取方法，其特征在于，在步骤(I)中， 乙醇水溶液的浓度为85 98% (V/V)，优选为90 97% (V/V)，更优选为93 96%(V/V)，最优选为 95% (V/V)； 油菜花粉:乙醇水溶液的重量体积比为50 200克:200 500mL，优选为80 150克:250 450mL，更优选为90 120克:280 350mL，最优选为100克:300mL ； 步骤(I)进一步包括，固液分离后得到的滤渣用80 100% (V/V)乙醇水溶液提取，然后进行固液分离，保留 滤液并与步骤(I)中获得的滤液合并；浓缩是减压干燥浓缩，优选为以65 80°C和.0.08 .0.09Mpa的真空度干燥浓缩，最优选为以75°C和0.085Mpa的真空度干燥浓缩；和/或 醇溶性提取液:步骤(2)中的乙醇水溶液的体积比为0.5 2: I 3，优选为0.8 .1.5: 1.5 2.5，最优选为1: 2。
3.权利要求1所述的提取方法，其特征在于，在步骤(2)中， 乙醇水溶液的浓度为30 55% (V/V)，优选为40 53% (V/V)，更优选为45 52%(V/V)，最优选为 50% (V/V)； 乙醇水溶液:乙酸乙酯的体积比为I 3: 3 8，优选为.1.5 2.5: 4 6，最优选为2: 5； 步骤(2)进一步包括，萃取后得到的非乙酸乙酯层加入乙酸乙酯萃取，保留乙酸乙酯层并与步骤(2)中获得的乙酸乙酯层合并； 酯酶是提取自细菌的酯酶，而且糖化酶是提取自真菌的糖化酶； 不完全反应是在35 42°C反应0.5 2小时，优选是在37 41°C反应0.75 1.5小时，最优选在40°C反应I小时；和/或 干燥是减压干燥，优选为以65 80°C和0.08 0.09Mpa的真空度干燥，最优选为以75°C和0.085Mpa的真空度干燥。
4.权利要求1所述的提取方法，其特征在于，在步骤(3)中， 硅胶色谱柱中的填料是200 300目硅胶，最优选是300目硅胶； 混和液中甲醇:乙酸乙酯的体积比为3 8: 0.5 1.5，优选为4 7: 0.8 1.3，最优选为5: I ;和/或 干燥是减压干燥，优选为以65 80°C和0.08 0.09Mpa的真空度干燥，最优选为以75°C和0.085Mpa的真空度干燥。
5.权利要求1所述的提取方法，其特征在于，在步骤(4)中， 混和液中乙腈:水的体积比为60 90: 10 40，优选为70 80: 20 30，最优选为75: 25 ;和/或 如式BR6、BRl、BR2、BR3、BR4和/或BR5所示的天然芸苔素内酯类似物的纯度大于90 %,优选大于95 %,更优选大于98 %,最优选大于99 %。
6.农用组合物，其是用分离的如式BR6、BR1、BR2、BR3、BR4和/或BR5所示的天然芸苔素内酯类似物同农学上可接受的辅料混合而成的:
7.权利要求6所述的农用组合物，其中天然芸苔素内酯类似物是由权利要求1 5之任一所述的提取方法提取的，更优选天然芸苔素内酯类似物的纯度大于90 %，优选大于95 %，更优选大于98 %，最优选大于99 %。
8.分离的如式BR6、BR1、BR2、BR3、BR4和/或BR5所示的天然芸苔素内酯类似物在促进植物生长和/或增强植物抗逆性中的应用，和/或，在制备促进植物生长和/或增强植物抗逆性的农用组合物中的应用:
9.权利要求8所述的应用，其中， 植物生长选自植物发育和植物发芽；和/或 植物抗逆性选自植物抗低温性和植物抗高盐性。
10.权利要求8所述的应用，其中植物选自双子叶植物和单子叶植物，优选选自水稻、小麦、玉米、大豆和棉花，更优选选自水稻、玉米和大豆。
全文摘要
本发明提供了提取自植物的芸苔素内酯类似物的提取及其应用，包括促进植物生长、抗低温和耐高盐等方面的应用。另外，本发明还提供了包含该芸苔素内酯类似物的农用组合物。
文档编号A01N45/00GK103214546SQ20121002628
公开日2013年7月24日 申请日期2012年1月18日 优先权日2012年1月18日
发明者何其明 申请人:成都新朝阳作物科学有限公司