专利名称：可防治棉花黄萎病的大丽轮枝菌弱毒菌株Vd171及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物病理学，具体涉及可防治棉花黄萎病大丽轮枝菌弱毒菌株Vdl71 及其应用。
背景技术：
棉花黄萎病是由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)引起的一种土传維管束病害，广泛分布于世界各产棉区。20世纪90年代以来，该病在我国各主产棉区爆发成灾，年发生面积300万公顷左右，年经济损失约12亿人民币，成为发展棉花生产的重要限制因子之一。由于轮作倒茬难，缺乏抗病品种，缺乏具有较好防治效果的农药，致使目前生产上对黄萎病的防治几乎是空白。
由于与寄主互作的协同进化、生态环境、病菌的异核现象等原因，棉花黄萎病菌易于变异，常常出现生理分化，产生新的生理型，包括致病力的分化，出现致病力迥异的生理型。1977年全国棉花枯、黄萎病综合防治研究协作组组织开展“棉花黄萎病菌生理型鉴定联合试验”，将我国棉花黄萎病菌划分为强、弱、中三个生理型，90年代以后，关于致病力分化和落叶型菌株在各地出现的报道又相继出现。病原菌变异頻繁，导致致病机理复杂、抗病育种滞后、品种抗性丧失快，成为该病防治难度大，爆发成灾的主要原因。然而，我们可以尝试利用大丽轮枝菌的弱毒菌株来研制“植物疫苗”，诱导棉花对黄萎病产生免疫反应，以达到防治黄萎病的目的。
“植物疫苗”是指能诱导植物产生抗性，从而抵抗病原菌入侵，抑制病原微生物生长，使植物免遭病害或减轻病害的ー类生物或非生物的物质，主要有弱毒、无毒株系疫苗， 活菌疫苗，蛋白类疫苗，寡糖疫苗，小分子及其他代谢产物疫苗，转基因植物疫苗。植物疫苗容易被土壤微生物迅速降解、无残留，诱导植物产生的抗性成分是植物代谢的正常物质，对人畜安全，而且植物疫苗诱导的植物抗病谱广、抗病持续时间长、长期多次诱导不会使病原菌产生抗药性，兼有促进植物生长和提高品质功能，是对环境友好、无污染、发展前景广阔的新ー类生物农药，已逐渐成为农作物病害防治的研究热点。
“植物疫苗”可模仿病毒、细菌、真菌入侵植物细胞，诱导植物产生抗体物质从而产生广谱抗性，抑制病原物生长。目前已用于粮、果、蔬、饲等80多种作物的600多种病害的防治。生产上应用较多的是小分子代谢物氨基寡糖素，是由3-5个单糖组成的的低聚糖素。 其主要原料来源是蟹壳、虾壳，经过发酵分解、苹取、提纯等エ艺而制得。国内在棉花上登记的用于防治棉花黄萎病此类制剂是北海国发海洋生物农药有限公司生产的0. 5%氨基寡糖素水剂，2001年和2002年，在中国农业科学院棉花研究所承担国家农药登记试验中(任务来源于农业部农药鉴定所)，对棉花黄萎病的防治效果为29. 96% 40. 64%，在2003年的大面积试验中防治效果为19.23%。另ー种应用较为广泛的是“植物激活蛋白”，是利用生物技术从微生物中分离提取的ー种新型结构蛋白，可通过与植物表面受体蛋白的互作，诱导植物的信号传导，引起植物体内一系列代谢反应，诱导和激活植物自身防卫系统和生长系统，从而产生对病虫害的抗性，促进植物生长，提高作物产量。国内由同听绿源(北京)生物科技股份有限公司生产的3%的植物激活蛋白可湿性粉剂，在烟草、葡萄、柑橘、水稻、 大白菜、油菜、茄科作物等获得登记认证。2008 2009年，我们经田间试验，对棉花黄萎病的防治效果为34. 9% 38. 5%。目前国内外还没有利用大丽轮枝菌弱毒菌株来研制植物疫苗，防治棉花黄萎病的报道。
本发明经多年的研究，从大量大丽轮枝菌菌株中筛选获得一株弱毒菌株，经温室苗期试验对棉花黄萎病的防治效果达85.0%，对棉花黄萎病的防治具有巨大的潜能。发明内容
因此，本发明的发明人为解决现有的用于防治棉花黄萎病的植物疫苗，存在的剂型単一，防治效果较差的问题提出并完成本发明。
本发明的目的是提供一种可防治棉花黄萎病大丽轮枝菌弱毒菌株Vdl71。
本发明的再一目的是提供ー种棉花黄萎病疫苗。
本发明的再一目的是提供一种防治棉花黄萎病的方法。
本发明的发明人于2007年 2010年，从我国新疆、河南、河北、山东等12个省84个县(市)采集387个棉花黄萎病病株样品，分离获得308个棉花黄萎病野生菌株，通过筛选、鉴定、温室的生物測定，获得ー株在棉花上致病力极弱的大丽轮枝菌菌株 Vdl71 (Verticillium dahliae)，其保藏编号为=CGMCC No. 5903。该菌株可作为疫苗，诱导棉花对棉花黄萎病产生免疫作用，对棉花黄萎病的防治效果达85.0%，且能促进棉花的生长发育，对人畜无毒害作用，对环境无污染。
棉花黄萎病菌大丽轮枝菌在普通的PDA培养基上，存在菌丝型、菌核型、中间型等不同类型，其培养性状也容易受培养条件的影响，传统的以形态学为基础的分类鉴定有时候会受到限制。分子生物学的发展给微生物的分类鉴定提供了新的有效措施，该发明以传统的形态学鉴定为基础，结合分子生物学的手段，对筛选到的菌株进行鉴定，最后获得目的菌株。
用于植物病害防治的植物疫苗，应该易于被植株吸收、对环境友好、无污染等特点。棉花黄萎病是ー种維管束真菌病害，病原菌从棉株的根尖侵染，通过維管束向上运输、 扩展蔓延，危害棉花。本发明获得的疫苗菌株和引起棉花黄萎病的致病菌同属于大丽轮枝菌，具有相同的生态习性、侵染棉花的方式及在棉花中的扩展途径。因此，利用该菌株作为疫苗控制棉花黄萎病，能顺利侵染棉花并在棉花植株内定殖。
本发明获得的疫苗菌株Vdl71，通过蘸根接种分生孢子悬浮液，易于在植株根表定埴，成功侵染棉花，并在植株体内扩展，诱导植株产生免疫反应，抵抗黄萎病危害。
利用大丽轮枝菌弱毒菌株Vdl71作为疫苗来控制棉花黄萎病在以下三方面产生有益效果。
I. Vdl71能够在人工培养基上培养，容易获得和培养，用于病害防治的疫苗菌株必须能够在人工培养基上培养，以利于エ厂化生产和推广应用。VD171是ー株来自棉花的大丽轮枝菌弱毒菌株，在PDA、查氏及棉籽培养基上生长良好，有利于大量繁殖和推广应用。
2. Vdl71对棉花黄萎病控制效果好，先接种Vdl71，4天后接种大丽轮枝菌，对棉花黄萎病的防治效果达到97.2%，对黄萎病有显著的控制作用，与生产上应用较多的枯草芽抱杆囷相比，防治效果提闻50左右。
3. Vdl71为环境友好型疫苗菌株，VD171分离自棉花，土壌中自然存在，对棉花致病カ极弱，对人畜、昆虫和作物安全，对环境无污染。
图I为Vdl71在PDA上生长情況，A :菌落形态，B :分生孢子；
图2为Vdl71经大丽轮枝菌特异引物的扩增結果，A P1/P2引物扩增結果，B VDS1/VDS2引物扩增结果；泳道I为Vd991，泳道2为Vdl71，泳道3为Gnlll (Gibellulopsis nigrescensノ。
图3Vdl71对棉花黄萎病的控制作用，1-1，冀棉11播种后18天接种Vdl71，4天后接种大丽轮枝菌强毒カ菌株Vd991 ;1-2，鲁棉研21播种后18天接种Vdl71，4天后接种大丽轮枝菌强毒カ菌株Vd991 ;2-1，冀棉11播种后22天接种大丽轮枝菌强毒カ菌株Vd991 ； 2-2，鲁棉研21播种后22天接种大丽轮枝菌强毒カ菌株Vd991 ；
大丽轮枝菌Vdl71 (Virticillium dahliae),于2012年3月15日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏编号是CGMCC No. 5903。
具体实施方式
实施例I菌株的分离
(一)样品采集
2007年 2009年，于我国新疆、河南、河北、山东等12个省84个县(市)采集387 个棉花黄萎病病株样品，分离获得308个棉花黄萎病野生菌株。
( ニ)菌株的分离
先将采集到的样品(棉花茎杆)用清水洗浄，去皮，置于直径为9cm的灭菌的培养皿中，用75%的酒精消毒lmin。再用5. 0%的次氯酸钠进行消毒60s，用灭菌水洗3次，每次时间不少于3min。然后用灭菌的吸水纸沾干表面的水分，用消毒的剪刀剪成0. 4cm长的小段，置于9cm的培养皿中，25°C培养。对疑似大丽轮枝菌的菌落，及时转移至直径为6cm 的培养皿中培养，然后观察其菌落大小、颜色、表面特征、质地。
(三)Vdl7I的特征
I.形态特征
在PDA平板上，Vdl71的菌落为白色，边缘整齐，表面致密，有同心轮文，不产生黑色微菌核。显微镜下观察，菌丝宽约为I. 94±0. 39 iim，产生轮枝状分生孢子，每轮2-3个分枝，分生孢子为卵圆形，大小为4. 33±0. 55X2. 20±0.48(长X宽)(图I)。
2.生理特征
Vdl71在5_35°C条件下均能生长，最适生长温度是30°C。在5、10、15、20、25、30、 35°C条件下的菌落直径分别为0. 0,3. 0,6. 8,32. 8,47. 2，52. 5和27. 5mm。30°C下，菌落直径最大。
3.分子特征
采用大丽轮枝菌核糖体ITS区段特异引物(Pl，5 ' -CATCAGTCTCTCT GTTTATACCAACG-3 ’ /P2，5 ’ -CGATGCGAGCTGTAAC TACTACGCAA-3 ’ )和(VDS15' -CACATTCAGTTCAGGAGACGGA-3' /VDS25' -CCTTCTACTGGAGTATTTCGG-3')进行 PCR 扩增，结果表明，均获得特异的目的条带。
依据Vdl71形态特征、生理特征和分子鉴定结果，将Vdl71归属为Verticillium dahliae。
(四)培养基及培养条件
I. PDA 培养基
马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂15-20克，水I升，自然pH。称取削皮的200g马铃薯，切成小块置于锅中加水煮烂(煮沸20-30分钟)，用纱布过滤后，滤液中加入葡萄糖和琼脂继续加热搅匀，稍冷却后再补水至1L，分装到锥形瓶，加塞包扎后120°C灭菌20分钟。
2.查彼(Czapek)液体培养基
KNO3, 2. OOg ；K2HPO4,1. OOg ；KCI,0. 50g ；MgS04. 7H20，0. 50g ；FeS04. 7H20，0. Olg ；蔗糖，30. OOg ;加水至1L，分装到锥形瓶，加塞包扎后120°C灭菌20分钟。
3.棉籽培养基
将带短绒的棉籽煮5分钟，浸泡6小时使棉籽吸足水分，捞出淋干水分，放入克氏瓶中，120°C灭菌30分钟。
280C，黑暗培养15d。液体培养需要置摇床150rpm，震荡培养。
实施例2VD171对棉花黄萎病的控制作用
I.试验方法
以耐病品种鲁棉研21和感病品种異棉11为供试品种，米用輕石沙土定量廳囷液法。将灭菌后的蛭石和沙子按6 : 4混合,做直径6cm的无底纸钵,放置45cmX 35cm的塑料盘内，每钵播种棉花种子8粒，出苗后留苗5株，每品种15个钵，每5个钵为ー个重复，3 次重复。棉花播种后，将塑料盘置温室中，待棉苗长一片真叶，根据试验设置接种孢子悬浮液IOml，孢子浓度为I X IO7个孢子/ml。接种方法为，将IOml孢子悬浮液倒入直径IOcm的培养皿中，将纸钵从塑料盘中取出放置在培养皿中40s，待孢子悬浮液被吸干后，将纸钵放回塑料盘中。棉苗置18°C_28°C的温室中，按5级分级标准进行病害的分级调查。计算病株率、病情指数和防治效果。
2.试验结果
2009和2010年在温室的试验结果表明，先接种Vdl71，4天后再接种强致病力的大丽轮枝菌菌株Vd991，在冀棉11和鲁棉研21上的平均病指分别为8. 9和8. 4，极显著低于直接接种大丽轮枝菌强致病カ菌株Vd991 (70. 9和48. 0);在冀棉11上两年的防治效果分别为90. 3%和84. 5%，在鲁棉研21上两年的防治效果分别为78. 9%和86. 3%，平均防治效果达85. 0%。只接种Vdl71处理的棉苗，在冀棉11上的平均病株率和平均病指为9. 6 和2. 8，在鲁棉研21上没有表现病害症状，表明该菌株对棉花的致病カ极弱。接种疫苗菌株Vdl71的棉苗，株高也较直接接种Vd991及清水对照显著高。表明Vdl71不仅对棉花黄萎病有很好的防治效果，且有促进棉花生长发育的作用(图4，表1-1、表1-2)。
表1-1 Vdl71对棉花黄萎病的控制作用
权利要求
1.大丽轮枝菌弱毒菌株Vdl71，其保藏编号为CGMCCNo. 5903。
2.权利要求I所述大丽轮枝菌弱毒菌株Vdl71的应用。
3.权利要求I所述大丽轮枝菌弱毒菌株Vdl71在防治棉花黄萎病中的应用。
4.权利要求I所述大丽轮枝菌弱毒菌株Vdl71的培养方法，其特征在于，在PDA培养基、查彼液体培养基或棉籽培养基28°C黑暗培养15天。
5.一种棉花黄萎病疫苗，其特征在于，包括权利要求I所述大丽轮枝菌弱毒菌株Vdl71。
6.一种防治棉花黄萎病的方法，其特征在于，包括为棉花接种权利要求I所述大丽轮枝菌弱毒菌株Vdl71的步骤。
全文摘要
本发明涉及植物病理学，具体地涉及大丽轮枝菌弱毒菌株Vd171及其在棉花黄萎病防治中的应用。本发明从棉花黄萎病菌弱毒菌株入手，通过分离、筛选、鉴定、温室的生物测定，获得对棉花黄萎病具有显著控制作用的菌株Vd171(Verticillium dahliae)，其保藏编号为CGMCC No.5903。Vd171能够在人工培养基上培养，容易获得和培养，以利于工厂化生产和推广应用。对黄萎病控制效果好，先接种Vd171，4天后接种大丽轮枝菌强毒菌株Vd991，对棉花黄萎病的防治效果达到85.0％，对黄萎病有显著的控制作用，与生产上应用较多的枯草芽孢杆菌相比，防治效果提高50％左右，对人畜、昆虫和作物安全，环境友好。
文档编号A01P3/00GK102634461SQ201210099459
公开日2012年8月15日 申请日期2012年4月6日 优先权日2012年4月6日
发明者冯自力, 师勇强, 朱荷琴, 李志芳, 赵丽红 申请人:中国农业科学院棉花研究所