专利名称：棉花Ghexp基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种棉花膨胀素Ghexp基因，本发明基因对拟南芥植株的叶片腺毛具有明显的促进作用，且转基因植株叶片气孔密度增加。
背景技术：
植物腺毛是一种存在于植物体表的一种特化的突起结构，其形态多样，功能各异。(I)有的腺毛可以分泌次生代谢物质，如青蒿素、棉酚等。次生代谢产物有的具有药用价值，有的可对害虫有忌避和毒杀作用。植物次生代谢产物含量高低与其贮藏器官(比如腺体、腺毛等)的有无及多少关系十分密切。腺毛是青蒿素转移和积累的主要贮藏器官，通常以腺毛指数作为青蒿素含量的表征。唇形科的很多香料植物含有挥发性油，其挥发性油的产生与分泌则与腺毛的分布、类型及其结构等有着直接的联系。有研究表明，腺毛的分布密度越大、处于分泌时期的数量越多，其分泌能力就越强。(2)有的腺毛不分泌物质，但可以阻碍草
食动物的侵害，如拟南芥。腺毛可作为次生代谢产物贮存的器官，也可保护植物免受昆虫、病原体的侵害，防止机械损伤及其后激变，有利于植物适应不良环境。如能从分子水平上提高腺毛的含量，则可增加次生代谢产物的含量，提高药用成分，并对增加植物的抗逆性有极大的帮助。植物的气孔是植物体与外界进行气体交换的重要通道，其开张度与气孔导度直接影响植物的光合作用和蒸腾作用，气孔调节是水分胁迫下植物抵御干旱和适应环境的机制之一。气孔的分布特征、密度和面积等受到环境水分状况的影响。小而密的气孔同时也具有较高的灵活性，因此有利于植物保持体内水分和保证有效的呼吸作用，是植物适应旱生环境的表现。如能从分子水平上调节气孔的数量，则可增加植物的抗旱性，提高适应不良环境的能力。
发明内容
本发明的目的在于获得一种从突变体湘棉18中克隆的Ghexp基因，及其在培育转基因植物中的应用。从而使植物的腺毛发达，或者气孔密度增加适应不良环境的能力提高。一种棉花Ghexp基因包含一个开放阅读框，其核苷酸序列为SEQ ID NOl0该基因已注册于GenBank，登陆号为JN255197。一种重组质粒p3301_Ghexp的序列中含有SEQ ID N01。上述重组质粒p3301_Ghexp在培育Ghexp基因过表达的转基因植物中的应用。一种培育Ghexp基因过表达的转基因植物的方法，包括如下步骤
I)种植需要腺毛发达或气孔密度增加的植物。2)制备含重组质粒p3301_Ghexp的单克隆阳性农杆菌GV3101菌液 a)构建权利要求2所述的重组质粒p3301-Ghexp ；b)制备农杆菌GV3101细胞感受态；
c)将步骤a)中的重组质粒和步骤b中的农杆菌GV3101细胞感受态按体积比1:20混匀，YEB培养基，28 °C摇培3 4h，得到单克隆阳性农杆菌GV3101菌液。3)将步骤I)处于花期中植物的花序浸入步骤2)获得的菌液中，浸染3 5min ；暗处培养24 h后恢复光照，培养植株至成熟，得到Ttl代种子；种植Ttl代种子，挑选潮霉素抗性植株，培养成熟得到T1代种子；种植T1代种子，挑选潮霉素抗性植株，培养成熟得到T2代种子；种植T2代种子，挑选抗性比为3:1的单插入独立株系，获得纯合T3代种子，及转基因植物。步骤I)中所述植物为次生代谢产物存于腺毛中的药用植物。本发明还提供了含有上述基因的转基因拟南芥纯系植株组成型过量表达该基因的转基因纯系植株。该植株比野生型根毛长，体表腺毛更多，叶片气孔密度增加。 本发明的有益效果是本发明克隆了一个促进腺毛生长的Ghexp基因，该基因可增加拟南芥植物体表腺毛数目及长度，并提高叶片气孔密度。将该基因进行转基因，对能产生次生代谢产物的植株可增加次生代谢产物的含量，提高药用成分，并对提高植物的抗逆性有极大的帮助。
图I是Ghexp基因的PCR扩增结果 图2是Ghexp基因在不同时期的表达量变化示意 图3是Ghexp基因在T2代转基因拟南芥中的PCR鉴定结果 图4是野生型拟南芥与转基因拟南芥根长比较 图5是本发明T3代转基因拟南芥茎腺毛 图6是本发明野生型拟南芥茎腺毛 图7是本发明T3代转基因拟南芥叶腺毛 图8是本发明野生型拟南芥叶腺毛 图9是本发明T3代转基因拟南芥叶片腺毛电镜 图10是本发明野生型拟南芥叶片腺毛电镜 图11是本发明T3代转基因拟南芥叶片气孔电镜 图12是本发明野生型拟南芥叶片气孔电镜图。
具体实施例方式实施例I Ghexp基因全长cDNA序列的克降和序列测定
根据黄瓜基因序列(NCBI No. AC007292. I)，利用Premier 5. O软件设计基因特异性引物，引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。上游引物5' -AAGCTTGAACGGTGCGGACGT-3 ;，下游引物5 ; -GAATTCCTGATATAGATAGTCA-3 ;。Ghexp基因克隆湘棉18种子萌发至2-3cm，提取总RNA。以总RNA为模板，反转录合成cDNA第一链。具体反应体系和反应条件参照TaKaRa公司的RNA PCR试剂盒的使用说明。以cDNA单链为模板，反应条件95°C，5 min，I次循环；(92°C 30s, 53°C 30s, 72°C2min)30次循环，最后72°C延伸lOmin。经质量浓度I %琼脂糖电泳后，见图I。回收目的片段并连接PMD18-T载体，转化E. coliDH5 α，提取质粒，经限制性内切酶酶切鉴定正确后送交上海生物工程技术服务有限公司测序。测序结果见SEQ ID Nol0利用上述引物PCR扩增得到包含有Ghexp基因的基因片段，用该基因编码一个217个氨基酸残基组成的蛋白质,包含一个Rare lipoprotein A (稀有脂质A)和Pollenallergen (花粉变应原蛋白)的结合域。实施例2 Ghexp基因的表达量分析
I、材料分别取湘棉18腺毛形成前和腺毛形成后的胚轴，胚根，子叶作为提取材料。2、Trizol 法提取总 RNA I)将上述材料分别放入液氮预冷的研钵中，在液氮中充分研磨成粉末。2)待液氮挥发干，立即转移到2mL的离心管中，每IOOmg材料约加入ImL的Invitrogen公司的TRizol提取液，剧烈振荡混匀样品，使样品充分裂解，室温放置5分钟。3)加入O. 2mL氯仿(chloroform),剧烈振荡混勻15秒，室温放置10分钟。4)4。。，12000rpm 离心 15 分钟。5)用移液器吸出上层水相，加入到I. 5mL的新离心管中，再在该离心管中加入500 μ L的异丙醇，水相与异丙醇的体积比为1: 1，将两者充分混匀，在_20°C下，沉淀30min。6)在4°C , 12000rpm的转速下离心IOmin,弃去上清液。7)用ImL的75%乙醇洗涤RNA沉淀，在4°C，8000rpm的转速下离心lOmin，收集沉淀。8)重复用75%乙醇洗涤一次RNA沉淀。9)去上清，RNA沉淀于无菌操作台上晾干约10-15分钟，RNA略显透明，加入30 50 μ L的RNase-free水充分溶解(可放于-80°C长期保存)。10)用紫外分光光度法及l%Agr0Se凝胶电泳检测RNA浓度及质量。a)用紫外分光光度计检测RNA的产量，在260nm处的吸光度，根据在260nm和280nm处的吸光值，检测RNA的纯度。b)用l%Agrose凝胶电泳检侧RNA的质量及大小，吸取上述I μ L RNA加入3 μ L的RNase-free /K，加I μ L上样缓冲液65°C变性5分钟，电泳后用EB染色，另取3 μ L的2kbDNAMarker作为对照。3、反转录反应cDNA的合成
根据内参18srRNA的扩增情况确定PCR的循环数，调整cDNA模板的加入量，进行定量PCR，结果见附图2，表明Ghexp基因在胚轴表达最多，其次是胚根，表达量最小的是子叶。棉花腺体形成前的Ghexp基因的表达比腺体形成后少。表明腺体的形成与Ghexp基因有密切的联系。ISsrRNA 的引物为
上游引物5 ; -TCGTAGTTGGACTTAGGGTGGG-3 ;，
下游引物5 ' -CAAATGCTTTCGCAGTTGTTCG-3 ;。实施例3转基因功能验证一拟南芥转化、筛选及表型分析
I、拟南芥的种植
将野生型拟南芥种子用5%次氯酸钠溶液(包括5%次氯酸钠和0. 01% Triton-XlOO)消毒10分钟，然后用无菌水漂洗3 4次，点播于1/2 MS平板，于4°C春化2_3天，然后移植到营养钵中(营养土与娃石按等比例混合)，在25°C培养,16/8 h光周期,光强35 μ mo I · πΓ2 · s_1;待植株开花后,进行转基因操作。2、拟南芥转化
I)重组质粒p3301-Ghexp的构建
将经PCR扩增后的Ghexp基因片段和经双酶切胶回收的p3301质粒DNA，在16°C下连接过夜，转化E. coli DH5ci，在含卡那霉素的琼脂平板上筛选阳性菌落，从平板上挑取单克隆酶切验证，正确的即为重组质粒p3301-Ghexp。2)农杆菌GV3101细胞感受态制备
将-80°C保存的农杆菌GV3101菌液解冻，划线接菌于YEB固体培养基。挑取农杆菌GV3101单克隆，接种于5mL YEB液体培养基中，28°C、200r/mim培养过夜；取2mL培养基于 50M1 YEB液体培养基中继续培养，直至0D600为O. 5左右；4°C、5000r/min、离心5min，弃去上清液；用IOmL冷的20mmol/L CaCl2悬浮菌液,冰浴30min ;4°C、5000r/min,离心5min,弃去上清液；用ImL冷的CaCl2 (20mmol/L)悬浮，分装成100 μ L /管，每管中加入IOOuL预冷的40%甘油，液氮中速冻后至-80°C保存。得到农杆菌GV3101细胞感受态。3)表达载体向农杆菌感受态细胞的转化
将10 4 1^重组质粒？3301-61^^ DNA加入200 4 1^农杆菌6￥3101细胞感受态中，混匀。冰浴30min，液氮冷冻3 5min，37°C水浴5min。加入I mL YEB培养基，28 °C摇培3 4h。lOOOOrpm，室温离心30s，弃上清，加入200 mL YEB培养基重悬菌体，涂于YEB培养基，28 °C培养2天。提取农杆菌质粒DNA进行PCR验证。得到含重组质粒p3301_Ghexp的单克隆阳性农杆菌GV3101菌液。4)转 Ghexp 基因
具体转化过程是挑取活化的含重组质粒p3301-Ghexp的单克隆阳性农杆菌GV3101菌株至5mL新鲜YEB液体培养基中，28°C摇培24h，得菌液。取上述菌液0. ImL接至50mL新鲜YEB液体培养基，28 °C 220rpm培养2 4h，使OD值达到0. 8左右。把50 mL菌液倒入盘中，将拟南芥倒扣并使所有花序浸入悬浮菌液中，浸染3 5min。轻轻甩掉浸液，用保鲜袋包裹以保湿，做好标记。将托盘置暗处培养24 h，然后取出营养钵并直立放置，恢复光照，继续培养植株至成熟。获得Ttl代种子。T0代种子用5%次氯酸钠溶液(包括5%次氯酸钠和0. 01%Triton-X100)消毒后，点播在MS选择培养板(30mg/L潮霉素)上，于4°C下春化2 3天，10天左右，挑选潮霉素抗性植株(长出真叶I 2对，根伸长至培养基中)并移栽到营养钵中，培养直至种子成熟得到T1代种子，采用同样的方法种植T1代种子，挑选潮霉素抗性植株，培养直至种子成熟得到T2代种子，采用同样的方法种植T2代种子，得到T2代植株，并在T2代植物中挑选抗性比为3:1的单插入独立株系，并获得纯合T3代株系进行转基因拟南芥的分子检测和表型鉴定。4、转基因拟南芥的PCR鉴定
提取T2代转基因拟南芥基因组DNA，以其为模板，用特异引物PCR扩增，其中 上游引物5 ; -TAACTTTGCCCTCCTAACTATGCT-3 ;，
下游引物5 ' -TTTGCCAATTTGCAGGTGCCACGTT-3 ;PCR反应程序为94°C预变性5min，94°C变性45sec，58°C复性45sec，72°C延伸lmin，循环35次，72°C延伸7min，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后检测。扩增片段长度为408bp鉴定结果见图3，表明拟南芥植株中存在Ghexp基因。5、转基因拟南芥的表型鉴定
拟南芥的种植将野生型拟南芥种子和T3代转基因拟南芥种子分别用5%次氯酸钠溶液(包括5%次氯酸钠和O. 01% Triton-XlOO)消毒10分钟，然后用无菌水漂洗3 4次，点播于1/2 MS平板，于4°C春化2 3天，在锥形瓶中培养至20天。在25°C培养，16/8 h光周期，光强35μηιο1 ·πΓ2 s—1;另分别取一部分春化后移植到营养钵中(营养土与娃石按等比例混合)，在25°C培养，16/8 h光周期，光强35 μ mo I · πΓ2 · s'表型观察取在锥形瓶中的植株进行比较，结果表明转基因的拟南芥植株的根长明显，野生型对照植株的根长较短(附图4)。取在营养钵中的植株第一轮叶的叶片进行比较，发现转基因拟南芥叶片上腺毛数目增加，表皮细胞较野生型而言更多，细胞结构数目增 多(附图5，6，9，10)，第一轮叶的叶片以上的茎进行比较，发现转基因的拟南芥腺毛数量有所增加(附图7，8)。且说明本发明的Ghexp基因对拟南芥主根及腺毛具有促进生长的功能。通过转Ghexp基因，植物的腺毛增加，也即次生代谢产物的器官数目增加，可直接促进次生代谢产物含量的提高，对开发和利用植物资源具有重大意义。上述转基因植物的方法还可用于次生代谢产物存于腺毛中的药用植物。从而提高腺毛的数量，则有望增加次生代谢产物的含量，提高药用成分。如青蒿等。在转基因Ghexp植株中，发现表皮上气孔增多，野生型相对较少，见图11，12，a表示保卫细胞形成的气孔。转基因植株中气孔密度大，但气孔相对野生型而言较小。叶片气孔密度上升，可提高干旱环境的适应性。以上所举实施例，对本发明的目的、技术方案和优点进行了进一步的详细说明，所应理解的是，以上所举实施例仅为本发明的优选实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内对本发明所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。文献
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权利要求
1.一种棉花Ghexp基因，其特征是该基因的核苷酸序列为SEQ ID NOl0
2.—种重组质粒p3301-Ghexp，其特征是它的序列中含有SEQ ID NOl0
3.权利要求2所述重组质粒p3301-GheXp在培育Ghexp基因过表达的转基因植物中的应用。
4.一种培育Ghexp基因过表达的转基因植物的方法，包括如下步骤 1)种植需要腺毛发达或气孔密度增加的植物； 2)制备含重组质粒p3301-GheXp的单克隆阳性农杆菌GV3101菌液 a)构建权利要求2所述的重组质粒p3301-Ghexp； b)制备农杆菌GV3101细胞感受态； c)将步骤a)中的重组质粒和步骤b中的农杆菌GV3101细胞感受态按体积比1:20混匀，YEB培养基，28 °C摇培3 4h，得到单克隆阳性农杆菌GV3101菌液； 3)将步骤I)处于花期中植物的花序浸入步骤2)获得的菌液中，浸染3 5min;暗处培养24 h后恢复光照，培养植株至成熟，得到Ttl代种子；种植Ttl代种子，挑选潮霉素抗性植株，培养成熟得到T1代种子；种植T1代种子，挑选潮霉素抗性植株，培养成熟得到T2代种子；种植T2代种子，挑选抗性比为3:1的单插入独立株系，获得纯合T3代种子，及转基因植物。
5.根据权利要求2所述培育转基因植物的方法，其特征是步骤I)中所述植物为次生代谢产物存于腺毛中的药用植物。
全文摘要
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及棉花膨胀素基因Ghexp及其在转基因植物培育中的应用。棉花膨胀素基因Ghexp核苷酸序列为SEQIDNo1。本发明的有益效果在于，克隆了棉花膨胀素基因Ghexp，并通过根癌脓杆菌介导的方法将该基因转入拟南芥，与野生型拟南芥植株相比，本发明的Ghexp基因的转基因可明显促进拟南芥植株的叶片、茎干的腺毛增多及增长，同时增加叶片的气孔密度。根据本发明，可利用基因工程方法培育转Ghexp基因植物，增加有关植株表皮毛数目，增加叶片的气孔密度，从而增加植株的次生代谢产物含量或阻碍草食动物的侵害，还可以提高植株对不良环境的适应性。
文档编号A01H5/00GK102925452SQ201210099099
公开日2013年2月13日 申请日期2012年4月6日 优先权日2012年4月6日
发明者谢永芳, 梁亦龙, 曾垂省, 蔡应繁, 向浏欣 申请人:重庆邮电大学