专利名称：一种毛竹体细胞胚胎发生的方法
技术领域：
本发明涉及林木生物技术和组织培养领域，特别涉及到毛竹体细胞胚胎发生。
背景技术：
二十世纪80年代以来，随着国际上植物生物技术的快速发展，国内外对竹子生物技术研究也逐渐增加，目前国际上和本专利有关的竹子再生体系方面的报道主要有1982年Metha等报道了印度刺竹(Bambusa arundinacea)成熟胚诱导出愈伤组织和再生植株(参考文献I)。、1983 年 Huang 和 Murashige 从刚竹属(Phyllostachy)、箬竹属(Sasa)、簕竹属(Bambusa)的叶片和嫩茎尖诱导出愈伤组织(参考文献2)。1985年Rao等以牡竹(Dendrocalamus. strictus)成熟种子诱导了愈伤组织，进而再生植株(参考文献3)。1986 年 Yeh 和 Chang 用绿竹(B. oldhamii)、吊丝球竹(B. beecheyana)的花序以体细胞胚胎发生方式再生植株(参考文献4、5)。1987年Hassan等报道了刚竹(Ph. viridis)叶片愈伤组织的植株再生(参考文献6)。1989年Huang等报道了用绿竹(B. oldhamii)、罗汉竹(Ph. aurea)和箬竹(S. pygmaea)的嫩茎尖进行愈伤组织诱导，仅由BA和NAA诱导的愈伤组织可器官发生，形成再生植株(参考文献7)。1990年Tsay报道利用麻竹(Sinocalamus Iatiflora)花药诱导出愈伤组织并实现植株再生(参考文献8)。2002年Godbole等用版纳甜龙竹(D. hamiItonii)杆芽诱导出愈伤组织并实现植株再生(参考文献9)。2005年Ogita利用毛金竹(Ph. nigra var. henosis)竹笑诱导出愈伤组织,但愈伤组织容易褐变，没有再生(参考文献10)。2007年Gillis等利用巴苦竹(B. balcooa)小穗诱导出愈伤组织并建立了高效再生体系(参考文献11)。2011年Cheah等利用小佛肚竹(B. ventricosa)杆芽诱导出愈伤组织并实现植株再生(参考文献12)。我国大陆学者在竹子生物技术方面的研究起步较晚。1991年闕国宁等报导了对黄竹(D. membranceus)和印度刺竹(B. arundinacea)的培养(参考文献13-14)，2008年吴涛等报导了对金丝慈竹(B. affinis ‘Viridiflavus’ )的培养(参考文献15)，均属经愈伤组织再生竹株的研究，其外植体均为嫩芽。2009年袁金玲等以孝顺竹(B. multiplex)种胚和小穗为外植体诱导出愈伤组织并实现植株再生，以种胚外植体的再生效率较高(参考文献16)。2010年乔桂荣等以麻竹花药为外植体诱导出愈伤组织并获得再生植株(参考文献17)，同年Zhang et al.以版纳甜龙竹的种胚为外植体诱导出愈伤组织并实现植株再生(参考文献18)。2011裴海燕等以雷竹(Ph. violascens)种胚为外植体，脱分化产生愈伤组织，愈伤组织再生出芽(参考文献19)。就毛竹而言，周宏(2005)、芦娟娟(2006)分别利用毛竹笋芽诱导出愈伤组织，但没有得到再生植株(参考文献20-21)。李楠利用毛竹种子诱导出愈伤组织，但生长较慢、质地疏松，水溃化严重，未能获得再生植株(参考文献22)。岳晋军等研究了不同放置和切割方式对毛竹种胚愈伤组织诱导率和质量的影响，未见实现植株再生(参考文献23)。综上所述，散生竹通过愈伤组织的植株再生体系尚不完善，对毛竹的研究仅处于愈伤组织诱导阶段，均未见获得再生植株。稳定高效的毛竹体细胞胚胎发生体系已经成为制约毛竹生物技术育种的关键技术障碍。本发明提供了毛竹体细胞胚胎发生的方法 ，将为毛竹的细胞工程、基因工程以及分子生物学的研究提供技术平台。主要参考文献I. Mehta UI, Rao VR, Ram HYM. Somatic embryogenesis in bamboo[C]. InProceeding 5th Interenational Cogress of Plant tissue culture&cell Culture，Tokyo, Japan,1982，109-1102.Huang LC， Murashige T. Tissue culture investigations of bamboo
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发明内容
一种毛竹(Phyllostachys heterocycla var. pubescens)体细胞胚胎发生的方法，其特征包括外植体消毒，愈伤组织诱导与增殖，胚状体诱导、萌发与植株再生，以及壮苗、炼苗和移栽过程，具体步骤如下(I)外植体消毒选择健康饱满的种实，先用75% (v/v)的乙醇处理I分钟；再用每升加5-6滴吐温-80的0. 2%次氯酸钠处理15-20分钟；然后用无菌水冲洗数次；最后用无菌纸吸干表面水分后接种；(2)愈伤组织诱导与增殖将消毒后的外植体接种到诱导培养基上，暗培养20-30天使愈伤组织形成，愈伤组织诱导培养基是以MS培养基为基础，添加l_8mg/L的2，4-D、0. l-5mg/L的ZT、10g/L的卡拉胶、500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺、300mg/L的水解酪蛋白；然后将淡黄色致密的愈伤组织分离出来，接种到继代培养基上增殖培养70-90天，增殖培养基是以MS培养基为基础，添加l_8mg/L的2，4-D、10g/L的卡拉胶、500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺、300mg/L的水解酪蛋白；(3)胚状体诱导、萌发与植株再生将增殖培养后的愈伤组织接种到胚状体诱导 培养基上，暗培养20-40天，使胚状体形成，胚状体诱导培养基是以MS培养基为基础，添加
l-8mg/L的ZT、l-3mg/L的BA、l_5mg/L的KT、30g/L的麦芽糖、10g/L的卡拉胶；然后将胚状体接种到分化培养基上，光照培养30-50天，胚状体逐渐萌发形成再生植株；分化培养是以MS培养基为基础，添加500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺、300mg/L的水解酪蛋白、10g/L的卡拉胶；光照时间12小时/日，光照强度800-20001ux ；(4)壮苗、炼苗和移栽将体细胞胚胎再生的小植株接种到壮苗培养基上培养50-60天，开瓶炼苗5-7天，取出小苗清洗根部的培养基，再用0. I %的高锰酸钾溶液清洗根部，然后将小苗栽植到灭菌的介质中，遮阴散射光培养一个月后，幼苗成活；所述的壮苗培养基是以MS培养基为基础，添加l_4mg/L的NAA、0. 2-0. 5mg/L的TDZ、10g/L的卡拉胶。
具体实施例方式下面结合毛竹(Phyllostachysheterocycla var. pubescens)实例对本发明进行详细说明。(I)挑选饱满健康种实,先用75% (v/v)乙醇处理I分钟；再用每升加5-6滴吐温-80的0. 2%的次氯酸钠处理15-20分钟；然后用无菌水冲洗数次；最后用无菌纸吸干表面水分后待接种；(2)将消毒后的外植体接种到愈伤组织诱导培养基上，诱导培养基是以MS培养基为基础，添加4mg/L的2,4-D、0. lmg/L的ZT、10g/L的卡拉胶、500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺、300mg/L的水解酪蛋白，26°C暗培养20-30天，外植体形成米粒大小的愈伤组织；将淡黄色致密的愈伤组织分离出来，接种到继代增殖培养基上，增殖培养基是以MS培养基为基础，添加2mg/L的2,4-D、10g/L的卡拉胶、500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺、300mg/L的水解酪蛋白，暗培养30天即可增殖一倍以上；(3)将继代增殖的胚性愈伤组织接种到胚状体诱导培养基上，胚状体诱导培养基是以MS培养基为基础，添加4mg/L的ZTU. 5mg/L的BA,2. 5mg/L的KT、30g/L的麦芽糖、10g/L的卡拉胶，26°C暗培养20-40天，多数愈伤形成胚状体；然后将胚状体接种到分化培养基上，分化培养是以MS培养基为基础，添加500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺、300mg/L的水解酪蛋白、10g/L的卡拉胶，光照培养30-50天，光照时间12小时/日，光照强度1200-20001uX，胚状体逐渐萌发形成再生植株；(4)壮苗、炼苗和移栽将体细胞胚胎再生的小植株接种到壮苗培养基中，壮苗培养基是以MS培养基为基础，添加4mg/L的NAA、0. 2mg/L的TDZ、10g/L的卡拉胶，培养50-60天，开瓶炼苗5-7天，取出小苗清洗根部的培养基，再用低浓度高锰酸钾溶液清洗根部，然 后将小苗栽植到灭菌的介质(山地黄壤土 蛭石泥炭土 = 1:1:1)中，遮阴散射光培养一个月后，幼苗成活。
权利要求
1.一种毛竹(Phyllostachys heterocycla var. pubescens)体细胞胚胎发生的方法，其特征包括外植体消毒，愈伤组织诱导与增殖，胚状体诱导、萌发与植株再生，以及壮苗、炼苗和移栽过程，具体步骤如下 (1)外植体消毒选择健康饱满的种实，先用75%(v/v)的乙醇处理I分钟；再用每升加5-6滴吐温-80的0. 2%次氯酸钠处理15-20分钟；然后用无菌水冲洗数次；最后用无菌纸吸干表面水分后接种； (2)愈伤组织诱导与增殖将消毒后的外植体接种到诱导培养基上，暗培养20-30天使愈伤组织形成，愈伤组织诱导培养基是以MS培养基为基础，添加l_8mg/L的2，4-D、.0. l-5mg/L的ZT、10g/L的卡拉胶、500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺、300mg/L的水解酪蛋白；然后将淡黄色致密的愈伤组织分离出来，接种到继代培养基上增殖培养70-90天，增殖培养基是以MS培养基为基础，添加l_8mg/L的2，4-D、10g/L的卡拉胶、500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺、300mg/L的水解酪蛋白； (3)胚状体诱导、萌发与植株再生将增殖培养后的愈伤组织接种到胚状体诱导培养基上，暗培养20-40天，使胚状体形成，胚状体诱导培养基是以MS培养基为基础，添加.l-8mg/L的ZT、l-3mg/L的BA、l_5mg/L的KT、30g/L的麦芽糖、10g/L的卡拉胶；然后将胚状体接种到分化培养基上，光照培养30-50天，胚状体逐渐萌发形成再生植株；分化培养是以MS培养基为基础，添加500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺、300mg/L的水解酪蛋白、.10g/L的卡拉胶；光照时间12小时/日，光照强度800-20001ux ； (4)壮苗、炼苗和移栽将体细胞胚胎再生的小植株接种到壮苗培养基上培养50-60天，开瓶炼苗5-7天，取出小苗清洗根部的培养基，再用0. I %的高锰酸钾溶液清洗根部，然后将小苗栽植到灭菌的介质中，遮阴散射光培养一个月后，幼苗成活；所述的壮苗培养基是以MS培养基为基础，添加l_4mg/L的NAA、0. 2-0. 5mg/L的TDZ、10g/L的卡拉胶。
全文摘要
本发明公开了一种毛竹(Phyllostachys heterocycla var.pubescens)体细胞胚胎发生的方法，它是通过对外植体进行适宜消毒后，在诱导培养基上诱导出愈伤组织，愈伤组织经增殖培养后首先在分化培养基上形成胚状体，然后胚状体在萌发培养基上完成萌发并形成再生植株，最后再生植株经壮苗培养、炼苗后移栽成活。本发明解决了毛竹体细胞胚胎发生的技术难题，为实现以毛竹为代表的散生竹类的生物技术育种提供了技术平台。
文档编号A01H4/00GK102657093SQ20121016245
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月17日 优先权日2012年5月17日
发明者岳晋军, 袁金玲, 顾小平 申请人:岳晋军, 袁金玲, 顾小平