专利名称：一种巨大芽孢杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于农业 微生物领域，涉及一种巨大芽孢杆菌及其应用。
背景技术：
潮土是河流沉积物受地下水运动和耕作活动影响而形成的土壤，因有夜潮现象而得名。在中国，多分布于黄河中、下游的冲积平原及其以南江苏、安徽的平原地区和长江流域中、下游的河、湖平原和三角洲地区。潮土分布区地势平坦，土层深厚，水热资源较丰富，造种性广，是我国主要的旱作土壤，盛产粮棉。但潮土分布面积最大的黄淮海平原，旱涝灾害时有发生，尚有盐碱危害，加之土壤养分低或缺乏，大部分属中、低产土壤，作物产量低而不稳。必须加强潮土的合理利用与改良。在土壤中许多微生物能够溶解难溶态磷，促进植物对磷的吸收，增加作物产量和改善作物品质，将解磷微生物作为生物肥料，不但可以提高土壤中磷的利用效率，节肥增产，而且可改善土壤结构，提高土壤有机质含量。植物促生菌(Plant Growth PromotingBacteria,简称PGPB)被界定为在一定条件下有利于植物生长的自由生活在土壤、根际、根表、叶际的细菌。这些细菌能够固氮、溶磷、溶铁，并产生植物激素，如生长素、赤霉素、细胞分裂素和乙烯。此外，它们还能提高植物的抗逆性，包括干旱、高盐、重金属毒害和农药。但现在大部分植物促生菌还为被驯化成可有效应用于促进植物生长并具有较好固氮溶磷效果的菌种，未必适应潮土的土壤环境。因此从潮土中分离得到植物促生菌，和作物形成共生体系，利用生物修复改善潮土，成为当前研究的热点。
发明内容
本发明的目的是提供一种巨大芽孢杆菌。本发明的另一个目的是提供该巨大芽孢杆菌的应用。本发明的目的可通过如下技术方案实现一种植物促生菌JX15，于2011年12月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，分类名为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium),保藏号CGMCCNo.5622。JXl5(CGMCC No. 5622)，呈革兰氏阳性、产芽孢的不规则杆状。菌落较小为白色、隆起，边缘整齐，表面光滑湿润，不透明(图I)。严格好氧，化能异养。最适生长温度为30°C。接触酶阳性，M. R和VP试验阴性，淀粉水解阳性，明胶水解阳性，硝酸盐还原阳性，柠檬酸盐利用阳性。分泌IAA能力强，达到27. 55ug* mL—1，固氮酶活性达19. 8nmol C2H4A ml，具有较好的固氮能力，以难溶性磷酸盐为磷源进行生长，并将其转化为可溶性磷酸盐。本发明所述的植物促生菌培养时使用的主要氮源包括但不限于蛋白胨、酵母粉、硝酸钾、硝酸铵、硫酸铵、尿素、丙氨酸；使用的主要碳源包括但不限于蔗糖、木糖、甘露醇、麦芽糖、乳糖、果糖、葡萄糖；使用的无机组分包括但不限于氯化钾、氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸三钙、二水氯化钙、七水合硫酸镁、七水和硫酸亚铁。本发明的植物促生菌发酵可在28 32°C，pH5 9的环境下进行。所述的植物促生菌JX15 (CGMCC No. 5622)在促进植物生长中的应用。所述的植物优选花生。所述的植物促生菌JX15在花生栽培上的应用。所述植物促生菌能高产吲哚乙酸并能利用难溶性磷酸盐为磷源进行生长。本发明所述的植物促生菌分泌吲哚乙酸(IAA)的能力强，达27. 55ug. mL'叼I哚乙酸是植物激素的一种，能够促进根的发育。产吲哚乙酸的菌种，往往附着在植物根系或叶表面，利用植物代谢产生分泌物的同时产生IAA和少量GA3等植物激素来影响植物的生理过程和形态变化。表现为直接促进根的伸长，从而增大了与土壤中营养物质的接触的机会；可提高植物体内源IAA的含量；诱导植物防卫基因的表达，提高植物体抗病，抗旱等抗 逆性。作为本发明的优化方案，所述根际促生菌JX15的发酵在pH7 8下进行，该环境下产IAA量最高。作为本发明的进一步优化，所述植物促生菌JX15采用的碳源为甘露醇，采用的氮源为酵母粉或蛋白胨或两者的组合。利用上述碳源和氮源制得的培养基，培育出的植物促生菌JX15产IAA的量最高。本发明所述的植物促生菌JX15以难溶性磷酸盐为磷源进行生长，并将其转化为可溶性磷酸盐。在实验室摇瓶条件下，JX15对磷酸三钙的转化量达41. 86mg L'相对于采用接种灭活菌作为空白对照的结果，JX15对磷酸三钙的转化量比空白对照高出36. 45mg L'固氮酶活性达19. 8nmol C2H4A ml,具有较好的固氮能力。有益效果本发明提供的植物促生菌JX15 (CGMCC No. 5622)高产吲哚乙酸，可有效固氮并将难溶性磷酸盐转化为可溶性磷酸盐，提高肥料的利用率，促进植物根系发育和对肥料的吸收，增加土壤矿质氮与有效磷含量；该菌株针对花生具有良好的促生长效果，高产的吲哚乙酸促进花生的生长发育，土壤矿质氮与有效磷含量的提高也使得花生对氮肥和磷肥的利用率更高。
图I是本发明菌株JX15的菌落图；图2表示不同装液量对菌株JX15产IAA的影响；图3表示不同初始pH对JX15菌株产IAA的影响；图4表示不同碳源对菌株JX15产IAA的影响；图5表示不同氮源对JX15菌株产IAA的影响；图6表示菌株JX15对难溶性磷的利用情况图7表示种植花生30天后接种JX15菌株对花生鲜重的影响；图8表示种植花生30天后接种JX15菌株对花生株高的影响；图9表示种植花生30天后接种JX15菌株对花生植株全N含量的影响；图10表示种植花生30天后接种JX15菌株对花生全P含量的影响；图11表示种植花生30天后接种JX15菌株对花生根总长的影响；图12表示种植花生30天后接种JX15菌株对花生根表面积的影响；图13表示种植花生30天后接种JX15菌株对花生根平均直径的影响；
图14表示种植花生30天后接种JX15菌株对花生根尖数的影响；图15表示种植花生30天后接种JX15菌株对土壤IAA含量的影响；图16表示种植花生30天后接种JX15菌株对土壤矿质N含量的影响；图17表示种植花生30天后接种JX15菌株对土壤有效P含量的影响；生物材料保藏信息植物促生菌JX15，分类名为巨大芽孢杆菌(Bacillus megat erium)，于2011年12月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号CGMCC No. 5622。
具体实施例方式下面结合附图对本发明作更进一步的说明。实施例I首先准备以下三种培养基。LB培养基蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，pH7. 0-7. 2，121°C灭菌，20min。LB液体培养基不加琼脂，其它条件同上。无机磷细菌培养基(PK0培养基)磷酸三钙5g，葡萄糖10g，硫酸铵0. 5g，氯化钠
0.3g，七水合硫酸镁0. 3g，氯化钾0. 3g，硫酸锰0. 03g,七水合硫酸亚铁0. 03g, pH7. 0琼脂20g，蒸馏水 1000ml, pH7. 0 7. 2。121°C灭菌，20min。无机盐培养基硫酸铵2. Og ;磷酸二氢钠0. 5g ;磷酸氢二钾0. 5g ;七水硫酸镁
0.2g ;二水氯化钙 0. lg，蒸馏水 IOOOmL, pH7. 0，121°C灭菌，20min。将从南京板桥采取的潮土挑根过筛后称取IOg置于盛有IOOml灭菌水的250ml的三角瓶中，在摇床中，30°C, 150r mirT1振荡20min,静置IOmin,得到土壤悬浮液。该土壤悬浮液中含有若干种促生菌，采用稀释法稀释后涂于LB培养基，将平板倒置，于30°C，恒温箱中培养24h后，挑取不同类型典型单个菌落，经平板纯化后，4°C保存在LB斜面待用。下面再通过定性测定和定量测定筛选出可分泌吲哚乙酸的植物促生细菌。定性测定将分离纯化后的细菌接种于采用含有L-色氨酸(100mg/L)的LB液体培养基，30°C，180r mirT1摇床培养Id。取50 y L菌悬液滴于白色陶瓷板上，同时加50 y LSalkowski 比色液(50mL35%HC104+lmL0. 5M FeCl3X 将加入 50 y L50mg/L 吲哚乙酸的比色液作为阳性对照。白色陶瓷板于室温避光放置30min后观察，颜色变红者表示能够分泌吲哚乙酸。定量测定对初筛获得的分泌IAA的细菌进行定量测定，培养条件同上。首先用分光光度法测定菌悬液的OD6tltl值，然后将菌悬液以IOOOOr mirT1离心IOmin取上清液加入等体积Salkowski比色液，避光静置30min，测定其OD53tl值。计算菌浓度OD6tltl值为I时，单位体积发酵液中吲哚乙酸的含量。标准曲线的绘制采用分析纯的吲哚乙酸梯度稀释制备。把通过定性、定量筛选测定得到的产IAA菌进行溶磷情况的筛选测定，将供试菌株接种于盛有30mL无机磷细菌液体培养基的150mL三角瓶，30°C，180r mirT1培养4d后，将培养液装入离心管4°C下IOOOOr mirT1离心，15min。取上清液用钥蓝比色法测定有效磷含量。并采用乙炔还原法测定其固氮酶活性。
通过以上测定筛选出一株高产吲哚乙酸，固氮并且溶磷能力强的菌株，命名为JX15。该菌株在实验室摇瓶条件下，所述植物促生菌对磷酸三钙的转化量达41. 86mg L'相对于采用接种灭活菌作为空白对照的结果，所述植物促生菌对磷酸三钙的转化量比空白对照高出36. 45mg .I/1 (图6)。将上述方法筛选分离出的菌株，经上海英俊生物工程有限公司测序，根据16SrDNA白勺测序结果，在http://www. ncbi. nlm. nih. gov在线查询分析,利用Blast软件在GenBank中与其它的16S rDNA序列进行同源性比较，选择相近的序列与JX15的序列用MEGAversion3软件构建JX15的16SrDNA系统进化树。根据该菌株的生理生化特征，鉴定为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium),同源性为98%。将该菌株于2011年12月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No. 5622。实施例2 好氧性试验把灭过菌的LB培养基倒入3个已灭菌的试管中，大约在2/3处，在无菌操作台上，用接种针挑取斜面培养的JX15(CGMCC No. 5622)，穿刺接种到上述培养基中(必须穿刺到管底)。30°C培养，分别在3天至7天观察结果。在琼脂柱表面上生长者为好氧菌，如沿穿刺线生长者为厌氧菌或兼性厌氧菌。试验结果显示，JX15 (CGMCC No. 5622)菌落沿琼脂柱表面生长，穿刺线内无菌落生长，为严格好氧。过氧化氢酶的测定在干净载玻片上滴I滴3%H202，取18 24h的LB斜面培养物I环，在H2O2中涂抹，若有气泡产生则为阳性，否则为阴性。试验结果显示JX15 (CGMCC No. 5622)为接触酶阳性。甲基红试验(M. R试验)a.培养基及试剂蛋白胨5g,葡萄糖5g,氯化钠5g,蒸懼水IOOOmL,调节pH7. 0 7. 2，分装试管，每管装4 5mL，121°C灭菌20min。试剂甲基红0. lg，95%酒精300mL，蒸懼水200mL。b.菌种培养及结果观察接种菌株JX15 (CGMCC No. 5622)于上述培养液中，30°C培养广2天。在培养液中加入几滴甲基红试剂，如培养液呈现红色，为甲基红阳性，黄色为阴性(甲基红变色范围4. 4红色飞.0黄色)。试验结果显示JX15 (CGMCC No. 5622)为 M. R 阴性。乙酞甲基甲醇试验(VP试验)a.培养基培养基同甲基红试验。b.菌种培养及结果观察接种与培养同甲基红试验。做VP试验时，取JX15(CGMCCNo. 5622)培养液(约2mL)和等量的40%Na0H相混合，加少量肌酸，充分振荡2 5min后，如培养液出现红色，即为VP阳性。试验结果显示JX15 (CGMCC No. 5622)为VP阴性。淀粉水解试验a.培养基及试剂在肉汤蛋白胨琼脂中添加0.2%的可溶性淀粉，分装三角瓶，121°C灭菌20min备用。路哥氏碘液碘片lg，碘化钾2g，先用少量(3飞mL)蒸馏水溶解碘化钾，现加入碘片，待碘完全溶解后，加水稀释至300mL。b.菌种培养及结果观察取JX15 (CGMCC No. 5622)菌种点接于平板上，30°C培养3天，形成菌落后，在平板上滴加路哥氏碘液，以铺满菌落周围为度，平板呈蓝色，而菌落周围如有无色透明圈出现，说明淀粉已被水解。透明圈的大小一般说明水解淀粉能力的大小。试验结果显示JX15 (CGMCC No. 5622)为淀粉水解阳性。明胶水解试验a.培养基及试剂蛋白胨5g，明胶120g，蒸馏水1000mL。调节pH7. 2^7. 4，分装试管，培养基高度约为4 5cm，121 °C灭菌20min。b.菌种培养及结果观察用穿刺法接种在试管中央。在30°C温箱中培养一个月，观察明胶是否液化。试验结果显示JX15 (CGMCCNo. 5622)为明胶水解阳性。
硝酸盐还原试验a.培养基及试剂蛋白胨10g，KNO3Ig,蒸馏水lOOOmL，pH7. 0 7. 4。格里斯氏(Gries)试剂A液对氨基苯磺酸0. 5g，稀醋酸(10%左右)150mL ；B液蔡胺0. Ig,蒸馏水20mL，稀醋酸(10%左右)150mL。二苯胺试剂二苯胺0. 5g溶于IOOmL浓硫酸中，用2OmL蒸馏水稀释。b.菌种培养及结果观察将JX15 (CGMCC No. 5622)接种于硝酸盐液体培养基中，30°C培养1、3、5天。在白色瓷盘小孔中倒入少许培养液，然后在其中分别滴I滴试剂A和B液，当培养液变为粉红色、玫瑰红色、橙色或棕色等时，表示有亚硝酸盐存在，为硝酸盐还原阳性，否则为阴性。试验结果显示JX15 (CGMCC No. 5622)为硝酸盐还原阳性。柠檬酸盐的利用a.培养基及试剂柠檬酸钠 2g，NaC15g, MgSO4 7H200. 2g，(NH4)2 HPO4Ig, 1% 澳百里香酚蓝水溶液10mL，琼脂20g，蒸馏水lOOOmL，pH6. 8-7. 0，121°C灭菌20min。b.菌种培养及结果观察取JX15 (CGMCC No. 5622)将培养12h左右的菌种接种于斜面上，30°C培养3-7天，培养基呈碱性(蓝色)者为阳性反应，不变者则为阴性。柠檬酸盐利用的试验结果显示JX15 (CGMCC No. 5622)为阳性。实施例3为了进一步验证实施例I得到的植物促生菌JX15 (CGMCC No. 5622)产吲哚乙酸的能力和最适条件，下面针对不同pH、装液量、不同碳源、不同氮源探索对吲哚乙酸产量的影响。将含有L-色氨酸(100mg/L) LB 液体培养基按 25ml，50ml，75ml，100ml，150ml 装于250mL的三角瓶中，按1% (v/v)接种量接种处于对数生长期的JX15 (CGMCC No. 5622)后，置于30°C，180r mirT1摇床培养24h，按定量测定的方法测定产IAA的量。结果如图2所示，由于菌株JX15 (CGMCC No. 5622)是好养代谢，通气量影响菌株产IAA的效率，50mL装液量时，菌株产IAA量最多，之后随着装液量增大，产量越少。将含有L-色氨酸(100mg/L)的LB培养基分别调节到不同的pH (4、5、6、7、8、
9、10)，取50mL装于250mL的三角瓶中，按1% (v/v)接种量接种处于对数生长期的JX15(CGMCCNo. 5622)后，置于30°C，180r .mirT1摇床培养24h，按定量测定的方法测定产IAA的量，结果如图3所示，表明JX15 (CGMCC No. 5622)在pH为4和10时不产IAA，在强酸强碱环境中，菌体无法进行生长代谢，在微碱环境中产IAA多于酸性环境，该菌种高产IAA的最适pH为疒8。在含有L-色氨酸(100mg/L)无机盐培养基中分别加入l%(w/v)的碳源，碳源有葡萄糖、木糖、蔗糖、果糖、甘露醇、乳糖、麦芽糖等，取50ml装于250ml的三角瓶中，按1% (v/v)接种量接种处于对数生长期的JX15 (CGMCC No. 5622)后，置于30°C，180r ^mirT1摇床培养24h，按定量测定的方法测定产IAA的量。结果如图4所示，该菌株在供给甘露醇时，产IAA的能力最强，其次是乳糖，木糖的利用率最低，几乎不产IAA。在含有L-色氨酸(100mg/L)无机盐培养基(不包括硫酸铵)中分别加入0. l%(w/v)的氮源，氮源包括硝酸铵、硫酸铵、硝酸钾、蛋白胨、酵母粉、尿素、丙氨酸等，取50ml装于250ml的三角瓶中按1% (v/v)接种量接种处于对数生长期的JX15 (CGMCC No. 5622)后，置于30°C，180r mirT1摇床培养24h，按定量测定的方法测定产IAA的量。结果如图5所示，说明取酵母粉为氮源时，产IAA的量最多。实施例4 准备以下培养基Ashby 无氮培养基甘露醇 10g, KH2PO4O. 29，MgSO4 7H200. 29，NaCIO. 29，CaSO4 2H200. 29，CaC035g, PH7. 2。将纯化后的JX15 (CGMCC No. 5622)菌株接种到Ashby无氮固体培养基中，28° C下培养4d，可看到有明显菌落，初步判断JX15有一定的固氮能力，下面对其固氮酶活性进行了测定，具体步骤如下将JX15 (CGMCC No. 5622)接入无氮液体培养基中，培养24h后用离心法收集菌细胞，再在收集到的菌细胞中加入45mL无菌水和5mL无氮液体培养基，形成50mL固氮菌悬浮液(每毫升约IO7个菌细胞)作为待接种菌液。固氮酶活性采用乙炔还原法测定，具体操作如下将JX15 (CGMCC No. 5622)，接种在装有2ml无氮液体培养基的青霉素小瓶中，32°C下培养18 24h ;将棉塞换为反口胶塞密封，用密封性好的注射器先从培养有菌的青霉素小瓶抽取0. 5ml空气，再注入0. 5mlC2H2,用胶布密封针眼；继续培养24h后，取100 u I气样在气相色谱仪上测定C2H4峰值，标准气C2H4 浓度为 130mg/L。采用美国HP公司生产的HP6890型气相色谱仪，其工作条件设置为氢火焰离子化检测器，温度250° C，H2流量30ml/min，压力20kPa ;色谱柱为毛细管，柱长15. Om,内径320iim，炉温30° C;载气N2,流量30ml/min，压力20kPa ;空气流量250ml/min ;前进样口温度250° C，压力20kPa。乙炔还原活性(ARA)，计算方法为
权利要求
1.植物促生菌JX15，分类命名为巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)，于2011年12月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No. 5622。
2.权利要求I所述的植物促生菌JX15在促进植物生长中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的植物为花生。
4.权利要求I所述的植物促生菌JX15在花生栽培上的应用。
全文摘要
本发明公开了一种巨大芽孢杆菌及其应用，属于微生物领域，该植物促生菌(Bacillus megaterium JX15)，于2011年12月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，分类名为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，保藏号CGMCC No.5622。该菌株能高产吲哚乙酸并能固氮且利用难溶性磷酸盐为磷源进行生长，提高肥料的利用率，促进植物根系发育和对肥料的吸收，增加土壤矿质氮以及有效磷含量；本发明针对花生具有良好的促生长效果，高产的吲哚乙酸促进花生的生长发育，土壤矿质氮与有效磷含量的提高也使得花生对氮肥与磷肥的利用率更高。
文档编号A01G7/00GK102747018SQ20121024586
公开日2012年10月24日 申请日期2012年7月16日 优先权日2012年7月16日
发明者刘满强, 姜瑛, 徐文思, 徐莉, 李引, 李辉信, 焦加国, 胡锋, 陈剑东, 陈小云 申请人:南京农业大学