大豆转录因子GmMYB174a及其编码基因与应用的制作方法

大豆转录因子GmMYB174a及其编码基因与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种大豆转录因子GmMYB174a及其编码基因与应用。本发明提供了一种蛋白，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明的实验证明，本发明发现了一个GmMYB174a基因，其在大豆中的表达受到高盐、干旱、低温及植物激素ABA处理的诱导。本发明对培育耐非生物胁迫（耐盐）的作物、林草等新品种具有重要价值，可用于农牧业和生态环境治理所需的耐逆性植物品种的培育和鉴定，对在干旱/高盐土壤中农作物产量的提高有重要意义。
【专利说明】大豆转录因子GmMYBI 74a及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种大豆转录因子GmMYB174a及其编码基因
与应用。
【背景技术】
[0002]环境中物理化学因素的变化，例如干旱、盐碱、低温等对植物的生长发育有重要影响，严重时会造成农作物大规模减产，培育耐逆性作物是种植业的主要目标之一。目前，基因工程育种已经成为增强作物耐逆性的重要方法之一。高等植物细胞有多种途径应答环境中的各种逆境胁迫，其中转录因子起着调控耐逆相关效应基因表达的作用。植物中已经发现了多类转录因子与植物耐逆性相关，例如:EREBP/AP2中的DREB类，bZIP, MYB, WRKY等
坐寸ο
[0003]MYB类转录因子家族是指含有MYB结构域的一类转录因子。MYB结构域是一段约51~53个氨基酸的肽段，包含一系列高度保守的氨基酸残基和间隔序列。
[0004]自从1987年克隆了玉米与色素合成有关的ZmMYBCl基因后，又从很多植物中分离到功能各异的MYB因。植物的MYB蛋白大都只含有两个MYB结构域，它们是一个大转录因子家族，参与许多生物学 过程，例如，次生代谢的调节，控制细胞分化，应答激素刺激和外界环境胁迫以及抵抗病原菌的侵害。植物中还发现了含一个MYB结构域的MYB蛋白以及含3个MYB结构域的MYB蛋白。它们可能分别在维持染色体结构的完整性、调苄基因转录和参与细胞周期的控制和调节细胞的分化上起重要作用。
[0005]MYB是植物中最大的转录因子家族之一，研究表明，MYB参与非生物胁迫的应答。在非生物胁迫调控信号途径中，MYB基因存在受ABA诱导和不受ABA诱导或甚至受抑制表达，表明MYB转录因子对非生物胁迫应答时可能参与ABA调控途径，也可参与非ABA调控途径。拟南芥MYB家族成员Atmyb2受干旱胁迫快速诱导，并且也受高盐和外源ABA诱导表达。过量表达能增强转基因植株的干旱耐性；拟南芥MYB成员H0S10的突变植株hoslO-1对冷害的适应能力急剧减弱，并对脱水和NaCl处理高度敏感；在脱水胁迫条件下，ABA的含量增加。这表明H0S10对冷害适应是必需的，并通过控制ABA生物合成来影响植株的脱水胁迫的耐性。而下列基因是不受ABA诱导，拟南芥HPPBF-1是受盐诱导表达的单一 MYB类型的MYB转录因子基因；水稻0smyb4受低温诱导，在拟南芥中过量表达能够增加转基因植株的冷害和冻害抗性。对拟南芥1500个盐效应基因进行分类，发现受NaCl诱导的MYB基因仅四个。

【发明内容】

[0006]本发明的一个目的是提供一种大豆转录因子GmMYB174a及其编码基因。
[0007]本发明提供种蛋白，名称为GmMYB174a,来源于大豆属大豆(Glycine max (L.)Merrill)，是如下(a)或(b): (a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列I所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列I衍生的蛋白质。
[0008]上述序列表中的序列I由361个氨基酸残基组成。
[0009]上述(a)或(b)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白的编码基因可通过将序列表中序列I所示的DNA序列缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表2所示的标签的编码序列得到。
[0010]上述蛋白的氨基酸序列中一个或几个氨基酸残基的取代、替换和/或添加，有的是由于自然发生的变异引起的，有的是由人工诱变处理引起的。
[0011]编码是上述蛋白的基因也是本发明保护的范围。
[0012]上述基因是如下(I)或(2)或(3)的DNA分子:
[0013](I)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0014](2)在严格条件下与(I)限定的DNA序列杂交且编码植物耐逆性相关蛋白的DNA分子;
[0015](3)与(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码植物耐逆性相关蛋白的DNA分子。
[0016]上述序列表序列2由1086个核苷酸组成，且编码区为自5’末端第1-1086位核苷酸。
[0017]上述严格条件可为如下:50°C，在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4和ImMEDTA的混合溶液中杂交，在50°C，2XSSC，0.1%SDS中漂洗；还可为:50°C，在7% SDS,0.5MNaPO4和ImM EDTA的混合溶液中杂交，在50°C，I X SSC, 0.1%SDS中漂洗；还可为:50°C，在7% SDS,0.5M NaPO4 和 ImM EDTA 的混合溶液中杂交，在 50°C，0.5XSSC,0.1%SDS 中漂洗；还可为:50°C，在7% SDS、0.5M NaPO4和ImM EDTA的混合溶液中杂交，在50°C，0.1 X SSC，
0.1%SDS中漂洗；还可为:50°C，在7% SDS,0.5M NaPO4和ImM EDTA的混合溶液中杂交，在65。。，0.1XSSC,0.1%SDS中漂洗；也可为:在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65° C下杂交，然后用 2 X SSC, 0.1%SDS 和 I X SSC, 0.1%SDS 各洗膜一次。
[0018]含有上述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
[0019]上述重组载体为将上述蛋白的编码基因插入表达载体中，得到表达上述蛋白的重组载体；上述重组载体可以pPROK-1I为出发载体，在pPROKII的多克隆位点Xba I和Kpn I间插入自序列表中序列I的自5’末端的第1-1086位脱氧核苷酸得到的重组质粒pPR0KI1-GmMYB174a。
[0020]上述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。
[0021]使用GmMYB174a构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子(如花椰菜花叶病毒(CAMV) 35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin))，或组织特异表达启动子(如种子特异表达的启动子)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用。此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
[0022]为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。
[0023]扩增上述基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。
[0024]上述引物对中的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列3，所述引物对中的另一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列4。
[0025]上述蛋白、上述基因或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在培育耐逆性植物中的应用也是本发明保护的范围。
[0026]上述应用中,所述耐逆性为耐旱性和/或耐盐性；
[0027]上述应用具体为将所述基因通过所述重组载体导入所述目的植物中，得到转基因毛状根，所述转基因毛状根的增长率大于与转空载体毛状根；其中，转空载体毛状根为将PROK II转入目的植物得到的转空载体毛状根。
[0028]所述植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物优选为豆科植物，如大豆、百脉根、苜蓿、花生、绿豆、芸豆、菜豆等；或其它双子叶植物，如油菜、黄瓜、番茄、白菜、烟草、茄子等；所述单子叶植物优选为水稻、小麦、玉米、草坪草等；也可以为树，如杨树、合欢、槐树、水黄皮等。
[0029]上述转化的细胞、组织或植物理解为不仅包含转化过程的最终产物，也包含其转基因子代。
[0030]本发明中所述的“多核苷酸”、“多核苷酸分子”、“多核苷酸序列”、“编码序列”、“开放阅读框(ORF) ”等包括单链或双链的DNA和RNA分子，可包含一个或多个原核序列，cDNA序列，包含外显子和内含子的基因组DNA序列，化学合成的DNA和RNA序列，以及有义和相应的反义链。
[0031]本发明基因可通过如下方式导入宿主中:将本发明基因插入表达盒中，再将表达盒通过植物表达载体、非致病自我复制的病毒或农杆菌导入宿主。携带本发明基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织。
[0032]转入本发明基因的植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。
[0033]本发明基因可通过如下方式导入宿主中:将本发明基因插入表达盒中，再将表达盒通过植物表达载体、非致病自我复制的病毒或农杆菌导入宿主。携带本发明基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织。[0034]本发明的基因可以在序列2的基础上进行以下修饰，再导入宿主中，以达到更好的表达效果:
[0035]I)为了在转基因植物中表达本发明核苷酸序列，本发明核苷酸序列可根据实际需要进行修饰和优化。如可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述核苷酸序列编码的氨基酸的同时改变其密码子以符合植物偏爱性。而且，优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35%，优选为多于45%，更优选为多于50%，最优选多于约60%。
[0036]2)为了翻译的有效起始，可以修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列。例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰。
[0037]3)将本发明基因与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达。所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子。启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种。例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定。尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达。
[0038]优选的组成型启动子包括CaMV 35S和19S启动子。所述启动子还可为来源于在大多数细胞类型中表达的几种肌动蛋白基因中的启动子。另一个优选的组成型启动子为泛素启动子。上述启动子还可为在根、木髓、叶或花粉中引导表达的启动子，即组织特异性启动子。棉花核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子(美国专利US 6，040，504)、水稻蔗糖合酶启动子(美国专利US 5，604，121)、夜香树黄化叶卷曲病毒启动子(W0 01/73087)。
[0039]化学诱导型启动子可为Rab29A启动子(美国专利US 5，614，395)。
[0040]4)将本发明基因与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率。例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9。任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接。
[0041]5)可向本发明基因中引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV, MCMV和AMV)。
[0042]在实际操作中，也可以将本发明基因进行细胞靶向定位。可利用本领域现有的技术实现。例如，将来源于靶向细胞器的靶基因序列与本发明基因序列融合，再导入植物细胞中，就可定位了。
[0043]上述重组载体中的出发载体可根据所使用的转化技术及靶植物物种的特性进行选择。上述选择可体现在载体中的抗性标记的选择上。对于一些靶物种，可以优选不同的抗生素或除草剂选择性标记。通常用在转化中的选择性标记包括赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptll基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因,和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因,赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因，和提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。
[0044]本发明的实验证明，本发明发现了一个GmMYB174a基因，其在大豆中的表达受到高盐、干旱、低温及植物激素ABA处理的诱导。将GmMYB174a基因导入大豆科丰一号根中，获得转GmMYB174a基因的毛状根。在盐和干旱分别胁迫后的毛状根的表型分析证明，转GmMYB174a基因的毛状根生长状态均明显好于对照(转空载体毛状根)，说明本发明提供的转GmMYB174a基因的毛状根能够显著提高植物的耐盐/旱性。本发明对于培育耐逆植物品种，特别是培育耐非生物胁迫(耐盐)的作物、林草等新品种具有重要价值，可用于农牧业和生态环境治理所需的耐逆性植物品种的培育和鉴定，对在干旱/高盐土壤中农作物产量的提高有重要意义。
[0045]下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步说明。
【专利附图】

【附图说明】
[0046]图1为GmMYB174a基因在各种处理下的表达特征
[0047]图2为植物表达载体pPR0KI1-GmMYB174a示意图
[0048]图3为GmMYB174a过表达毛状根在正常条件下的生长
[0049]图4为转GmMYB174a基因毛状根的耐盐性分析
[0050]图5为转GmMYB174a基因毛状根的耐旱性分析
【具体实施方式】
[0051 ] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0052]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0053]下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值土标准差。
[0054]所有植物材料均生长于22° C每天的光照为16h/8h (光照/黑暗)。
[0055]大?科丰I 号(Glycine max L.Merr.Kefeng I)记载在 W.K.Zhang, Y.J.Wang, G.Z.Luoj J.S.Zhang, C.Y.He，X.L Wuj J.Y.Gaij S.Y.Chen, QTL mapping of ten agronomictraits on the soybean (Glycine max L.Merr.) genetic map and their associationwith EST markers, Theor.App1.Genet, 2004，108:1131-1139 ；也记载在王修强、盖钧溢、喻德跃，广谱抗源科丰I号对大豆花叶病毒强毒株系群SC-8抗性的遗传研究，大豆科学，2003年03期；公众可从中科院遗传与发育生物学研究所获得；
[0056]pROKII 载体(双兀表达载体)记载在 D.C.Baulcombej G.R.Saunders, M.W.Bevanj Μ.A.Mayo and B.D.Harrison, Expression of biologically active viral satellite RNAfrom the nuclear genome of transformed plants.Nature 321 (1986)，pp.446 - 449 中，公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
[0057]发根农杆菌K599 记载在 Attila Keresztj et al., Agrobacteriumrhizogenes-mediaded transformation of soybean to study of root biology, NatureProtocols，2007，2 (4)，549-552)中，公众可从Peter M Gressnon教授，The University ofQueensland, St Lucia, Queensland 4072，Australia，获得，或经Peter M Gressnon教授同意(书面同意书)后由中科院遗传与发育生物学研究所获得。
[0058]哥伦比亚生态型拟南芥(col-0):种子购自Arabidopsis Biological ResourceCenter (ABRC)。
[0059]实施例1、大豆转录因子GmMYB174a基因的克隆和表达
[0060]在对大豆转录因子MYB家族在高盐、干旱和低温胁迫应答反应研究中发现有个基因受上述处理的诱导，将其命名为GmMYB174a ;具体如下:[0061]一、大豆转录因子GmMYB174a基因的克隆
[0062]大豆科丰I号3周龄幼苗经200mM NaCl处理6小时，取2克新鲜叶片，在液氮中研碎，悬于4mol/L硫氢酸胍水溶液中，混合物用酸性苯酚、氯仿抽提，上清液中加入无水乙醇沉淀得到总RNA。提取的总RNA，反转录为cDNA。以cDNA为模板，用Primer-F和Primer-R进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，得到分子量约为IKb的条带，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(TIANGEN)回收该片段。
[0063]Primer-F:5’ -CCCTCTAGA ATGGCGATTCAAGATCAAAATG-3’(下划线标注 Xba I 酶切识别位点)(序列3)；
[0064]Primer-R:5? -CCCGGTACC CTACAAGGAAAGATGGATGCAT-3’ (下划线标注 Kpn I 酶切识别位点)(序列4)。
[0065]PCR 扩增体系(50yl):cDNA I μ I, IOXbuffer 5 μ I，dNTP(IOmM) I μ I，Primer-Fl μ I, Primer-R I μ I, Pfu DNA Polymerase (TaKaRa) I μ I, ddH20 40 μ I。扩增条件为:94°C 3min ；94°C 30s, 50°C 30s, 72°C 30s，30 个循环；72°C 10m。
[0066]将该回收片段(PCR产物)与pGEM-T Easy (Promega)连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，根据pGEM-T Easy载体上的羧卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的T7和SP6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定，测序结果表明该PCR产物具有序列表中序列2所示的核苷酸，该PCR产物的基因命名为GmMYB174a，该基因的编码区为序列表中序列2自5’末端第1-1086位核苷酸，该基因编码的蛋白命名为GmMYB174a,该蛋白的氣基酸序列为序列表中的序列I所不。序列表中序列2由1086个核苷酸组成，序列表中序列I由361个氨基酸残基组成。
[0067]也可人工合成序列表中序列2,用Primer-F和Primer-R进行PCR,得到同样的PCR产物。
[0068]二、大豆转录因子GmMYB174a基因的表达受非生物胁迫诱导
[0069]将大豆科丰I号3周龄幼苗作如下胁迫处理:
[0070]I)盐胁迫处理(200mM NaCl处理):将幼苗移入200mM NaCl水溶液中，室温，约25。C ；
[0071]2)渗透胁迫处理(干旱处理):将幼苗根部小心的吸去水分，置于滤纸上暴露于室温空气(25°C)中；
[0072]3)低温胁迫处理(4°C低温处理):将幼苗浸入预冷的水中，置于4°C冰箱；
[0073]4)脱落酸(ABA)处理(100 μ M ABA处理)，将幼苗根浸入100 μ M ABA水溶液中，室温，约25° C。
[0074]5) CK处理:幼苗未经任何处理记作CK ；
[0075]6)水处理:将幼苗浸入蒸馏水中，处理温度约25°C ；
[0076]每种处理在1、3、6、12小时分别收集新鲜叶片Ig在液氮中研碎(CK组直接收集叶片)，悬于4mol/L硫氢酸胍水溶液中，混合物用酸性苯酚、氯仿抽提，上清液中加入无水乙醇沉淀得到总RNA。对GmMYB174a基因在上述处理时的表达特征进行定量PCR分析，引物为Primer-F 和 Primer-R。大豆 GmTubulin 基因为内标，所用引物为 Primer-TF 和 Primer-TR。Q-PCR得到的值是基因相对于GmTubulin的表达量。RT-PCR需要先通过调整模板cDNA的量来使GmTubulin的表达量一致，再进行基因的扩增。实验重复三次，结果取平均值土标准差。
[0077]Primer-F:5，-ATGGCGATTCAAGATCAAAATG-3’
[0078]Primer-R:5，-CTACAAGGAAAGATGGATGCAT-3J
[0079]Primer-TF:5，-AACTCCATTTCGTCCATTCCTTC-3，
[0080]Primer-TR:5，-TTGAGTGGATTCCCAACAACG-3’[0081]结果如图1所示，A为干旱处理；B为200mM NaCl处理；C为4°C低温处理；D为100 μ M ABA处理；从图中看出，GmMYB174a基因对低温、干旱、高盐和ABA处理均有应答反应，但是应答反应的模式不同。除了 ABA处理外，GmMYB174a表达在上述处理I小时时均明显受诱导，GmMYB174a表达在干旱处理时持续升高至12小时，高盐和低温处理3小时时均升至最高，之后下降，高盐处理12时时将至最低，而低温处理12小时时复又升高。在ABA处理I小时时，略下降，至3小时明显升高,至6小时复又下降。
[0082]实施例2、大豆转录因子GmMYB174a基因的应用
[0083]一、转GmMYB174a毛状根的获得
[0084]1、重组表达载体pPR0KI1-GmMYB174a的构建
[0085]用限制性内切酶Xba I和Kpn I双酶切由实施例1用Primer-F和Primer-R作为引物获得的PCR产物，回收酶切产物，将该酶切产物与经过同样酶切植物表达载体pROK II得到的载体骨架连接，得到连接产物。将连接产物转入大肠杆菌中，得到转化子。提取转化子的质粒，送去测序，该质粒为将序列表中的序列2插入pROK II的Xba I和Kpn I酶切位点之间得到的载体，将该载体命名为pROK I1-GmMYB174a,且序列表中的序列2位于CaMV 35S启动子之后。重组表达载体pROK I1-GmMYB174a结构示意图如图2所示。
[0086]2、转GmMYB174a毛状根(过量表达GmMYB174a基因毛状根)的获得
[0087]I)将上述I得到的重组表达载体pROK I1-GmMYB174a,通过电击法导入发根农杆菌K599，得到重组农杆菌。
[0088]提取重组农杆菌的质粒，经测序验证，结果为该质粒为pROK I1-GmMYB174a,将含有该质粒的重组农杆菌命名为K599/pR0K II _GmMYB174a。
[0089]2)用注射器将重组农杆菌K599/pR0K I1-GmMYB174a接种生长6天含两片真叶的大豆科丰I号幼苗，保湿生长:光照16小时，温度25°C，湿度50%。2周后，长出毛状根即为转化的毛状根。共获得32个转GmMYB174a毛状根根系，待毛状根生长至4_6cm时可进一步作转基因鉴定和耐逆性检测。以相同的方法将空载体pROK II转入大豆科丰I号幼苗，得到27个转空载体毛状根根系，以作为实验对照。
[0090]3)分别提取编号为1-32的转GmMYB174a毛状根和编号为1_27的转空载体毛状根的总RNA，将其反转录为cDNA。以cDNA为模板，用Primer-F和Primer-R进行GmMYB174a基因表达量分析。Real-Time PCR反应使用Τ0Υ0Β0公司的RealTime PCR Master Mix试剂盒，并按照说明进行操作。GmMYB174a基因表达量检测所用引物为Primer-F和Primer-R ；大豆GmTubulin基因为内标,所用引物为Primer-TF和Primer-TR。实验重复三次,结果取平均值土标准差。
[0091]Primer-F:5’ -ATGGCGATTCAAGATCAAAATG-3’
[0092]Primer-R:5，-CTACAAGGAAAGATGGATGCAT-3，
[0093]Primer-TF:5，-AACTCCATTTCGTCCATTCCTTC-3，[0094]Primer-TR:5’ -TTGAGTGGATTCCCAACAACG-3J
[0095]编号为1-15的转GmMYB174a毛状根和编号为1_15的转空载体毛状根分子鉴定中的GmMYB174a的平均相对表达量如图4A所示，其中，OE为转GmMYB174a毛状根，对照为转空载体毛状根，从图中看出，转GmMYB174a毛状根中GmMYB174a的相对表达量为3.65±0.3 ;转空载体毛状根中检测出的GmMYB174a的相对表达量是大豆原有的GmMYB174a的表达，为
0.50±0.15。
[0096]编号为16-32的转GmMYB174a毛状根和编号为16_27的转空载体毛状根分子鉴定中的GmMYB174a的平均相对表达量如图5A所示，其中，OE为转GmMYB174a毛状根，对照为转空载体毛状根，从图中看出，转GmMYB174a毛状根中GmMYB174a的相对表达量为
3.35±0.25 ;转空载体毛状根中GmMYB174a的相对表达量为0.40±0.2。
[0097]上述结果表明，转GmMYB174a基因根系中GmMYB174a的表达量远高于转空载体根系中GmMYB174a的表达量。
[0098]二、转GmMYB174a毛状根系的耐旱、耐盐和耐低温鉴定
[0099]实验样本如下:转空载体毛状根，记为对照；转GmMYB174a毛状根，记为0E。
[0100]在水中培养10天的对照和OE的毛状根生长没有明显差异，长度为8.1±3.9cm和
7.8±3.7cm,见图 3。
[0101]1、耐盐性鉴定
[0102]将转GmMYB174a毛状根(OE)和转空载体毛状根(对照)各取10个经IOOmM NaCl水溶液处理3天，即浸入IOOmM NaCl水溶液中25°处理3天。每个株系各10个单株。
[0103]处理3天后，拍照观察，结果如图4B所示，经IOOmM NaCl处理3天的转空载体毛状根和转GmMYB174a毛状根的表型，可以看出，在IOOmM NaCl处理下，二者毛状根的生长速
度有显著差异。
[0104]测量毛状根长度，实验重复三次，结果取平均值土标准差，具体如下:经IOOmMNaCl水溶液处理前转GmMYB174a基因毛状根和转空载体毛状根的长度分别为4.3±2.8cm和4.5±2.7cm,两者间没有显著差异；经IOOmM NaCl水溶液处理后转GmMYB174a基因毛状根和转空载体毛状根的长度分别为6.2 ±2.3cm和5.2 ±2.1cm ；
[0105]毛状根的增长率=(处理后根长-处理前根长)/处理前根长
[0106]将增长率作图如图4C所示，经IOOmM NaCl水溶液处理转GmMYB174a基因毛状根的长度增长率为42±28%。而经IOOmM NaCl水溶液处理转空载体毛状根的长度增长率为16 ±35%,两者有显著差异。
[0107]2、耐旱性鉴定:
[0108]将转GmMYB174a基因毛状根(OE)和转空载体毛状根(对照)分别浸入1% (体积百分含量)PEG (聚乙二醇6000) 25°处理3天。每个株系各10个单株。
[0109]处理3天后，拍照观察，结果如图5B所示，经1%PEG处理3天的转空载体毛状根和转GmMYB174a毛状根的表型，可以看出，在1%PEG处理下二者的生长状态有显著差异。
[0110]测量毛状根长度，实验重复三次，结果取平均值土标准差，具体如下:经1%PEG处理前转GmMYB174a基因毛状根和转空载体毛状根的长度分别为4.6±2.1cm和4.1±2.3cm ；经1%PEG处理后转GmMYB174a基因毛状根和转空载体毛状根的长度分别为6.4±2.0cm和
5.7 ±2.4cm ；[0111]毛状根的增长率=(处理后根长-处理前根长)/处理前根长
[0112]将增长率作图如图5C所示，PEG浓度为1%时，转空载体毛状根(对照)增长率约为3923%，而转GmMYB174a毛状根(OE)的增长率约为63±21%。
[0113]转GmMYB174a基因毛状`根的增长率与转空载体毛状根的增长率有明细差异。
【权利要求】
1.一种蛋白，是如下(a)或(b): Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列表中序列I所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列I衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于:所述基因是如下(I)或(2)或(3)的DNA分子: (1)序列表中序列2所不的DNA分子； (2)在严格条件下与(I)限定的DNA序列杂交且编码植物耐逆性相关蛋白的DNA分子； (3)与(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码植物耐逆性相关蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于: 所述重组载体为将权利要求1所述蛋白的编码基因插入表达载体中，得到表达权利要求I所述蛋白的重组载体。
6.扩增权利要求2或3所述基因全长或其任意片段的引物对。
7.如权利要求6所述的引物对，其特征在于:所述引物对中的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列3，所述引物对中的另一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列4。
8.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述基因或权利要求4所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在培育耐逆性植物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于: 所述耐逆性为耐旱性和/或耐盐性； 所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
10.如权利要求8或9所述的应用，其特征在于:所述双子叶植物为大豆。
【文档编号】A01H5/00GK103588867SQ201210293058
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2012年8月16日 优先权日:2012年8月16日
【发明者】陈受宜, 张劲松, 王昉, 陈昊伟, 张万科, 马彪, 林晴 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所