专利名称：毛葡萄离体快速繁殖培养方法
技术领域：
本发明涉及农业科学领域，尤其是一种毛葡萄离体快速繁殖培养方法。
背景技术：
毛葡萄(Kids heyneana Roem. & Schult.)又名绒毛葡萄、五角叶葡萄,在我国华中、华东、西南、华南北部、西北的陕、甘及华北的山西均有分布，是分布最为广泛的野生葡萄种类之一。毛葡萄抗性强、适应性好，既是葡萄嫁接栽培的优良抗性砧木，也是我国野生葡萄红酒的优质原料。随着野生毛葡萄酒消费量的增加和西南地区石漠化生态治理的需要，生产上对毛葡萄种苗的需求量巨大。毛葡萄实生繁殖后代优良性状易发生分离，扦插繁殖生根困难，繁殖率低下。研究者虽然采用组织培养技术进行毛葡萄离体培养，但因培养基和培养方法不适宜，繁殖系数均在4. 5以下，不能满足产业化需求。
发明内容
本发明的目的是提供一种毛葡萄离体快速繁殖培养方法，它解决毛葡萄种苗繁殖率低下的问题，为生产提供大量的优质毛葡萄种苗，以满足农业生产需要。本发明是这样实现的毛葡萄离体快速繁殖培养方法，包括以下步骤，
步骤一、无菌系的建立在生长季节选取生长健壮的毛葡萄新梢作为外植体，用自来水冲洗干净，在超净工作台上，先用体积百分比为70%的酒精漂洗30s，再用无菌水冲洗3次后，用质量百分比为0. 1%的升汞溶液(即相当于Ig氯化汞溶解在I升水中)浸泡消毒8-lOmin后，用无菌水冲洗5-6次，然后剪除新梢两端褐化部分后，剪成单芽茎段，接种到MS培养基中，在温度为25±1°C,光照强度为40umol s_1 nT2,光照时间为12h/d的培养条件下，培养诱导至腋芽萌发，获得腋芽萌发产生的带芽茎段；
步骤二、腋芽增殖取步骤一中获得的腋芽萌发产生的带芽茎段剪成单芽茎段，芽眼向上接种到MS培养基上，在温度为25±1°C，光照强度为40umol s—1 m_2，光照时间为12h/d的条件下培养30d，腋芽增殖产生大量丛生不定芽；
步骤三、生根培养取步骤二中产生的不定芽，将其接种到1/2MS生根培养基中，先光下培养7d,再暗培养7d后，然后转入光下继续培养至正常生根，获得试管苗；培养温度为25±1°C,光照强度为40umol s_1 nT2，光照时间为12h/d ；
步骤四、炼苗移栽选取步骤三中生有3-4条根，长为4-5cm的试管苗，在102. Sumol -S-1 .m-2的光照条件下炼苗7d，然后从培养瓶中取出试管苗，洗净试管苗根部培养基，用质量百分比为0. 1% KMnO4溶液浸根10s，再移栽到灭菌的珍珠岩基质中，用1/8MS营养液浇透，之后每隔7d浇灌I次营养液，并从移栽后第2-3d始每隔7d浇灌I次1000倍质量百分比为40%的多菌灵溶液，加盖与营养钵相同大小的塑料杯保持湿度，置于温度为25土 1°C的培养室内培养至植株长出3-5条新根后移栽到盛有营养土的营养钵中，置于温室内炼苗30d，最后定植到大田即可。步骤一中采用的MS培养基为国际通用的培养基，并在该MS培养基中每升添加2.Omg的6-苄基嘌呤，0. 2mg的吲哚乙酸，20g蔗糖和5g琼脂粉，其pH值为5. 8-6. O。步骤二中采用的MS培养基为国际通用的培养基，并在该MS培养基中每升添加
2.0-3. Omg的6-苄基嘌呤，0. 01-0. 07mg的吲哚丁酸，20g蔗糖和5g琼脂粉，pH5. 8-6. O。步骤三中采用的1/2MS培养基是指MS培养基中的大量元素减半，其它元素不变，并在该MS培养基中每升添加0. 05-0. 5g吲哚丁酸，0-0. 20g吲哚乙酸，20g蔗糖和5g琼脂粉，pH5. 8-6. O。步骤四中采用的1/8MS营养液是指MS培养基中的大量元素为1/8，其它元素不变，并在该MS培养基中每升添加0. 05mg吲哚乙酸。由于采用上述的技术方案，与现有技术相比，本发明采用植物组织培养技术，对腋芽萌发产生的带芽茎段进行组培，并配置适合的培养基，使毛葡萄无菌单芽茎段腋芽增殖率达97%以上，繁殖系数达17. 0-20. 2，生根率达93%以上，炼苗成活率可达100%，解决毛 葡萄种苗繁殖率低下的问题，为生产提供大量的优质毛葡萄种苗；本发明方法简单，成本低廉，使用效果好，产业化应用前景广阔。本发明的实施例I :毛葡萄离体快速繁殖培养方法，包括以下步骤，
步骤一、无菌系的建立在生长季节选取生长健壮的毛葡萄“花溪-9”新梢为外植体，在自来水下冲洗干净后，先在体积百分比70%的酒精中浸泡30s，无菌水冲洗3次，再用质量百分比为0. 1%升汞溶液浸泡消毒8min，无菌水冲洗5次，剪成单芽茎段，接种到MS培养基上(每升MS培养基附加2. Omg的6-苄基嘌呤，0. 2mg的吲哚乙酸，20g蔗糖和5g琼脂粉，PH5. 8-6. 0)，MS培养基的温度为25土1°C，光照强度为40umol s-1 m_2，光照时间为12h/d ;培养诱导至腋芽萌发，获得腋芽萌发产生的带芽茎段；
步骤二、腋芽增殖取步骤一中获得的腋芽萌发产生的带芽茎段剪成单芽茎段，芽眼向上接种到MS培养基上(每升培养基添加2.0-3. 0 mg的6-苄基嘌呤，0. 01-0. 07 mg的吲哚丁酸，20 g蔗糖和5g琼脂粉，pH5. 8-6. 0)，在温度为25±1°C，光照强度为40umol .s—1 .nT2，光照时间为12h/d的条件下培养30d，腋芽增殖产生大量丛生不定芽，无菌单芽茎段腋芽增殖率达100%，繁殖系数达17. 0 ；
步骤三、生根培养取步骤二中产生的不定芽，将其接种到1/2MS生根培养基中(1/2MS培养基是指MS培养基中的大量元素减半，其它元素不变，并在该MS培养基中每升添加
0.08-0. 5g吲哚丁酸，0-0. 20g吲哚乙酸，20g蔗糖和5g琼脂粉，pH5. 8-6. 0)，先光下培养7d,再暗培养7d后，然后转入光下继续培养至正常生根，获得试管苗；培养温度为25 ± I °C，光照强度为40umol S-1 nT2，光照时间为12h/d ;30d后生根率可达93. 7% ；
步骤四、炼苗移栽选取步骤三中生有3-4条根，长为4-5cm的试管苗，在102. Sumol -S-1 .m-2的光照条件下炼苗7d，然后从培养瓶中取出试管苗，洗净试管苗根部培养基，用质量百分比为0. 1% KMnO4溶液浸根10s，再移栽到灭菌的珍珠岩基质中，用1/8MS营养液(1/8MS营养液是指MS培养基中的大量元素为1/8，其它元素不变，并在该MS培养基中每升添加0. 05mg吲哚乙酸)浇透，之后每隔7d浇灌I次营养液，并从移栽后第2-3d始每隔7d浇灌I次1000倍质量百分比为40%的多菌灵溶液，加盖与营养钵相同大小的塑料杯保持湿度，置于温度为25土TC的培养室内培养至植株长出3-5条新根后移栽到盛有营养土的营养钵中，置于温室内炼苗30d，最后定植到大田，成活率100%。本发明的实施例2 :毛葡萄离体快速繁殖培养方法，包括以下步骤，步骤一、无菌系的建立在生长季节选取生长健壮的毛葡萄“农院-11”新梢为外植体，在自来水下冲洗干净后，先在体积百分比70%的酒精中浸泡30s，无菌水冲洗3次，再用质量百分比为0. 1%升汞溶液浸泡消毒8min，无菌水冲洗5次，剪成单芽茎段，接种到MS培养基上(每升MS培养基附加2. Omg的6-苄基嘌呤，0. 2mg的吲哚乙酸，20g蔗糖和5g琼脂粉，PH5. 8-6. 0)，MS培养基的温度为25土1°C，光照强度为40umol s-1 m_2，光照时间为12h/d ;培养诱导至腋芽萌发，获得腋芽萌发产生的带芽茎段；
步骤二、腋芽增殖取步骤一中获得的腋芽萌发产生的带芽茎段剪成单芽茎段，芽眼向上接种到MS培养基上(每升培养基添加2. 0-3. Omg的6-苄基嘌呤，0. 01-0. 07mg的吲哚丁酸，20g蔗糖和5g琼脂粉，pH5. 8-6. 0)，在温度为25± 1°C，光照强度为40umol s-1 m_2，光照时间为12h/d的条件下培养30d，腋芽增殖产生大量丛生不定芽，无菌单芽茎段腋芽增殖率达97%，繁殖系数达20. 2 ；
步骤三、生根培养取步骤二中产生的不定芽，将其接种到1/2MS生根培养基中(1/2MS培养基是指MS培养基中的大量元素减半，其它元素不变，并在该MS培养基中每升添加
0.08-0. 5g吲哚丁酸，0-0. 20 g吲哚乙酸，20g蔗糖和5g琼脂粉，pH5. 8-6. 0)，先光下培养7d,再暗培养7d后，然后转入光下继续培养至正常生根，获得试管苗；培养温度为25 ± I °C，光照强度为40umol S-1 nT2，光照时间为12h/d ;30d后生根率可达100% ；
步骤四、炼苗移栽选取步骤三中生有3-4条根，长为4-5cm的试管苗，在102. Sumol -S-1 .m-2的光照条件下炼苗7d，然后从培养瓶中取出试管苗，洗净试管苗根部培养基，用质量百分比为0. 1% KMnO4溶液浸根10s，再移栽到灭菌的珍珠岩基质中，用1/8MS营养液(1/8MS营养液是指MS培养基中的大量元素为1/8，其它元素不变，并在该MS培养基中每升添加0. 05mg吲哚乙酸)浇透，之后每隔7d浇灌I次营养液，并从移栽后第2-3d始每隔7d浇灌I次1000倍质量百分比为40%的多菌灵溶液，加盖与营养钵相同大小的塑料杯保持湿度，置于温度为25土TC的培养室内培养至植株长出3-5条新根后移栽到盛有营养土的营养钵中，置于温室内炼苗30d，最后定植到大田，成活率100%。花溪-9及农院-11均是从野外收集的贵州野生毛葡萄优良单株，与栽培葡萄品种相比，果粒小，含糖量较低、含酸量较高，风味独特，抗病性及抗旱性强，既可作为酿酒葡萄栽培，也可作为抗性砧木利用。
权利要求
1.一种毛葡萄离体快速繁殖培养方法，其特征在于包括以下步骤， 步骤一、无菌系的建立在生长季节选取生长健壮的毛葡萄新梢作为外植体，用自来水冲洗干净，在超净工作台上，先用体积百分比为70%的酒精漂洗30s，再用无菌水冲洗3次后，用质量百分比为O. 1%的升汞溶液浸泡消毒8-lOmin后，用无菌水冲洗5-6次，然后剪除新梢两端褐化部分后，剪成单芽茎段，接种到MS培养基中，在温度为25土 1°C，光照强度为40umol · s—1 · m_2,光照时间为12h/d的培养条件下,培养诱导至腋芽萌发,获得腋芽萌发产生的带芽茎段； 步骤二、腋芽增殖取步骤一中获得的腋芽萌发产生的带芽茎段剪成单芽茎段，芽眼向上接种到MS培养基上，在温度为25± 1°C，光照强度为40umol · s—1 · m_2，光照时间为12h/d的条件下培养30d，腋芽增殖产生大量丛生不定芽； 步骤三、生根培养取步骤二中产生的不定芽，将其接种到1/2MS生根培养基中，先光 下培养7d,再暗培养7d后，然后转入光下继续培养至正常生根，获得试管苗；培养温度为25±1°C,光照强度为40umol · s_1 · πΓ2，光照时间为12h/d ； 步骤四、炼苗移栽选取步骤三中生有3-4条根，长为4-5cm的试管苗，在102. Sumol -S-1 ·πΓ2的光照条件下炼苗7d，然后从培养瓶中取出试管苗，洗净试管苗根部培养基，用质量百分比为O. 1% KMnO4溶液浸根10s，再移栽到灭菌的珍珠岩基质中，用1/8MS营养液浇透，之后每隔7d浇灌I次营养液，并从移栽后第2-3d始每隔7d浇灌I次1000倍质量百分比为40%的多菌灵溶液，加盖与营养钵相同大小的塑料杯保持湿度，置于温度为25土 1°C的培养室内培养至植株长出3-5条新根后移栽到盛有营养土的营养钵中，置于温室内炼苗30d，最后定植到大田即可。
2.根据权利要求I所述的毛葡萄离体快速繁殖培养方法，其特征在于步骤一中采用的MS培养基为国际通用的培养基，并在该MS培养基中每升添加2. Omg的6-苄基嘌呤，O.2mg的吲哚乙酸，20g蔗糖和5g琼脂粉，其pH值为5. 8-6. O。
3.根据权利要求I所述的毛葡萄离体快速繁殖培养方法，其特征在于步骤二中采用的MS培养基为国际通用的培养基，并在该MS培养基中每升添加2. 0-3. Omg的6-苄基嘌呤，O. 01-0. 07mg的吲哚丁酸，20g蔗糖和5g琼脂粉，pH5. 8-6. O。
4.根据权利要求I所述的毛葡萄离体快速繁殖培养方法，其特征在于步骤三中采用的1/2MS培养基是指MS培养基中的大量元素减半，其它元素不变，并在该MS培养基中每升添加O. 05-0. 5g吲哚丁酸，0-0. 20g吲哚乙酸，20g蔗糖和5g琼脂粉，ρΗ5· 8-6. O。
5.根据权利要求I所述的毛葡萄离体快速繁殖培养方法，其特征在于步骤四中采用的1/8MS营养液是指MS培养基中的大量元素为1/8，其它元素不变，并在该MS培养基中每升添加O. 05mg Π引哚乙酸。
全文摘要
本发明公开了一种毛葡萄离体快速繁殖培养方法，包括以下步骤，无菌系的建立、不定芽诱导、生根培养及炼苗移栽。本发明采用植物组织培养技术成功实现毛葡萄离体快速繁殖，使毛葡萄无菌单芽茎段腋芽增殖率达97%以上，繁殖系数达17.0-20.2，生根率达93%以上，炼苗成活率可达100%，解决毛葡萄种苗繁殖率低下的问题，为生产提供大量的优质毛葡萄种苗；本发明方法简单，成本低廉，使用效果好，产业化应用前景广阔。
文档编号A01H4/00GK102823502SQ20121035555
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月24日 优先权日2012年9月24日
发明者潘学军, 刘伟, 张文娥, 甘专 申请人:贵州大学