专利名称：一种花药愈伤组织继代培养获得橡胶树胚状体的方法
技术领域：
本发明属于植物组织和细胞工程领域，具体地说，涉及一种花药愈伤组织继代培养获得橡胶树胚状体的方法。
背景技术：
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橡胶树体胚植株具有生长快、产量高等优点，其产量较同源老态芽接无性系増加25. 8% 66. 3%，生长快10% 20%，是天然橡胶产业发展的新一代种植材料。世界上最早的橡胶树体胚植株是我国于1977年通过花药再生的。随后，马来西亚、印度也得到了花药植株。但是植株诱导频率均很低。在组织培养过程中发现，体胚诱导频率低、正常胚状体比例低是影响橡胶树花药培养发展的重要限制因子，因此如何培养出数量多、质量好的胚状体成为橡胶树组织培养工作者30多年来的主要研究方向。研究者主要从愈伤诱导及体胚分化培养基的大量元素、激素配比、蔗糖纯度、椰子水的质量、活性炭的添加及培养温度等进行研究。经过30多年的努力，体胚诱导频率得到了有效提升，但总体仍偏低。培养基必须与好的培养方式搭配才能取得最好的效果。而至今依然沿用最初的培养方式，即花药一愈伤组织一体胚一植株再生。组织切片结果表明，花药愈伤组织在I 4周处于细胞启动期和细胞分裂期，此时愈伤组织开始形成并迅速増殖。4周后开始启动分化，愈伤组织边增殖边分化，5周看到大量的胚性细胞团。因此推断4周是花药愈伤组织分化的关键时期，与此前愈伤诱导担负着完全不同的使命，是启动体胚分化的时间节点。而一直沿用的培养方式仍将其放在诱导愈伤组织的培养基，可能是导致胚状体诱导频率偏低的ー个原因。2011年梁国平等研究了继代次数对橡胶树花药愈伤组织体胚分化的影响，研究以40天的愈伤组织作为继代的起始材料，继代培养基同愈伤诱导培养基，共继代8次，结果表明继代I次的体胚分化率最高。最优条件下，体胚分化率为70. 8%，而不继代时体胚分化率为39.8%。但是在研究中发现，直接以初代培养基作为继代培养基并不能提高体胚分化率，不继代的体胚分化率为35%，而直接以初代培养基作为继代培养基的体胚分化率为21.8%。而且2011年梁国平等的研究以40天的花药愈伤组织作为起始材料，此时已达最大愈伤生长量，组织切片可看到胚性母细胞或原胚，不适合继代培养。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效获得橡胶树体细胞胚状体的方法，以满足生产和实验的需要。为了实现本发明的目的，本发明所述的ー种花药愈伤组织继代培养获得橡胶树胚状体的方法，包括如下步骤(I)花药初代愈伤组织的诱导以巴西橡胶树花蕾为外植体，将花蕾进行表面消毒，花蕾的消毒过程是将花蕾用75%酒精表面消毒30 60秒后，用0. 1%氯化汞消毒10 15分钟，再用无菌水冲洗3 6次，毎次3 5分钟；然后将消毒好的花蕾中的雄蕊剥出，接种到诱导愈伤组织的诱导培养基上进行暗培养，培养温度为24°C 30°C，暗培养28 35天，以诱导出橡胶树花药初代愈伤组织；所述的愈伤组织诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，并将MS培养基中磷酸ニ氢钾、无水氯化钙、一水硫酸锰、七水硫酸镁的含量调整为磷酸ニ氢钾350 500mg/L、无水氯化钙150 400mg/L，一水硫酸锰10 40mg/L，七水硫酸镁400 600mg/L ;并添加2,4-D (2，4-ニ氯苯氧こ酸)0.5 31^/しKT(激动素)0. 5 3mg/L、NAA (a-萘こ酸)
0.5 3mg/L、Phytage I (植物凝胶)2 4g/L、鹿糖50 90g/L和椰子水50 100ml/L。(2)愈伤组织继代培养选取培养期处于28 35天的橡胶树花药初代愈伤组织，转入愈伤组织继代培养基暗培养，培养温度为24°C 30°C，暗培养15 30天，培养出继代胚性愈伤组织；
所述的橡胶树花药初代愈伤组织转入愈伤组织继代培养基的继代培养次数为I次，待愈伤组织停止增殖时，立即转入橡胶树胚状体诱导培养基；所述的愈伤组织继代培养基的有效成份为改良的MS培养基和附加成份，改良的MS培养基的成份为七水硫酸镁400 600mg/L，磷酸ニ氢钾350 500mg/L，无水氯化钙200 350mg/L，一水硫酸锰20 40mg/L，五水硫酸铜0. I 0. 3mg/L ；附加成份为6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)0. 01 I. 0mg/L、KT (激动素)0. 01 I. Omg/L, 3, 4-D (3，4- ニ氯苯氧こ酸)0. 05 I. Omg/L、ABA (脱落酸)0. 001 0. lmg/L、Phytagel (植物凝胶)2 3g/L、鹿糖50 90g/L、椰子水40 90ml/L。(3)胚状体的诱导将继代胚性愈伤组织转入橡胶树胚状体诱导培养基进行暗培养，培养温度为24°C 30°C，暗培养30 60天，以诱导出胚状体；所述胚状体诱导培养基的有效成分为改良的MS培养基，并添加6-BA0. 5 2mg/L、KT0. 5 4mg/L、NAAO. 05 lmg/L、GA3 (赤霉素)0. 01-lmg/L、Phytagel2 3g/L、鹿糖50 90g/L、活性碳I 2g/L、椰子水40 90ml/L。本发明ー种花药愈伤组织继代培养获得橡胶树胚状体的方法的有益效果是(I)本发明通过愈伤组织继代及对应愈伤组织继代培养基的筛选，使愈伤组织更契合其发育过程，从而有效提高了胚状体的诱导率。(2)本发明通过继代培养基对橡胶树花药愈伤组织继代，使其更利于胚性表达，经继代培养基继代后，体胚分化率大幅提高，比不继代或继代到愈伤组织诱导培养提高150% 200%，使得基于花药再生体系的研究和生产效率大大提高，加速相关领域的发展。(3)本发明正常胚状体诱导率高，获得橡胶树正常体细胞胚状体的比例较对照大幅提高，是不继代的2 3倍，很大程度上解决了橡胶树组织培养畸形胚比例高的难题，为提高橡胶树体胚植株诱导率奠定了良好的基础。(4)本发明エ艺流程简单，生产成本低，所采用的培养基成分易于获取，具有很大的应用价值。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。选用橡胶树优良无性系热研7-33-97花蕾为外植体，将花蕾用75%酒精表面消毒30秒后，再用0. 1%氯化汞消毒15分钟，最后用无菌水冲洗3次，毎次5分钟。然后剥出雄蕊，接种到愈伤组织诱导培养基上进行暗培养，培养温度为27°C，暗培养30天，诱导出橡胶树花药初代愈伤组织；接着选取花药初代愈伤组织转入继代培养基暗培养，培养温度为27°C，培养20天，培养出继代胚性愈伤组织；最后将继代胚性愈伤组织转入橡胶树胚状体诱导培养基进行暗培养，培养温度为25°C，暗培养60天，诱导出胚状体。所述的愈伤组织诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，并将MS培养基中磷酸ニ氢钾、无水氯化钙、一水硫酸锰、七水硫酸镁的含量调整为磷酸ニ氢钾350mg/L、无水氯化钙 200mg/L，一水硫酸锰 20mg/L，七水硫酸镁 400mg/L ;并添加 2，4-D1. 5mg/L、KTL Omg/L、NAAI. Omg/L、Phytagel 2. 2g/L、鹿糖 80g/L、椰子水 70ml/L。 所述的愈伤组织继代培养基的有效成份为改良的MS培养基和附加成份，改良的MS培养基的成份为七水硫酸镁400mg/L，磷酸ニ氢钾350mg/L，无水氯化钙200mg/L，一水硫酸锰 20mg/L，五水硫酸铜 0. lmg/L ;附加成份为 6-BA0. 0lmg/L, KTO. 01mg/L,3, 4-DO. 05mg/L> ABAO. 001mg/L、Phytagel 2. 2g/L、鹿糖 50g/L、椰子水 40ml/L。所述的胚状体诱导培养基的有效成分为改良的MS培养基，并添加6-BAlmg/L、KT2mg/L、NAAlmg/L、GA30. 01mg/L、Phytagel 2. 2g/L、鹿糖 70g/L、活性碳 lg/L、椰子水 40ml/し虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明创造作了详尽的描述，但在本发明创造基础上，可以对之作ー些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明创造精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明创造要求保护的范围。
权利要求
1.一种花药愈伤组织继代培养获得橡胶树胚状体的方法，包括花药初代愈伤组织的诱导、愈伤组织继代培养、胚状体的诱导，其特征在于选取培养期处于28 35天的橡胶树花药初代愈伤组织，转入愈伤组织继代培养基暗培养，培养温度为24°C 30°C，暗培养15 30天，培养出继代胚性愈伤组织； 所述的愈伤组织继代培养基的有效成份为改良的MS培养基和附加成份，改良的MS培养基的成份为七水硫酸镁400 600mg/L，磷酸二氢钾350 500mg/L，无水氯化钙200 350mg/L, 一水硫酸锰20 40mg/L，五水硫酸铜O. I O. 3mg/L ;附加成份为6-BA (6-苄氨基腺嘌呤)O. 01 I. Omg/L、KT (激动素)O. 01 I. Omg/L, 3, 4-D (3，4- 二氯苯氧乙酸)O.05 I. Omg/L、ABA (脱落酸)O. 001 O. lmg/L、Phytagel (植物凝胶)2 3g/L、鹿糖50 90g/L、挪子水 40 90ml/L。
2.根据权利要求I所述的一种花药愈伤组织继代培养获得橡胶树胚状体的方法，其特征在于花药初代愈伤组织转入愈伤组织继代培养基的继代培养次数为I次。
全文摘要
本发明涉及一种花药愈伤组织继代培养获得橡胶树胚状体的方法，包括花药初代愈伤组织的诱导、愈伤组织继代培养、胚状体的诱导。所述的愈伤组织继代培养是选取培养期处于28～35天的橡胶树花药初代愈伤组织，转入愈伤组织继代培养基暗培养，培养温度为24℃～30℃，暗培养15～30天，培养出继代胚性愈伤组织。本发明愈伤组织继代培养的体胚分化率比不继代培养提高150%～200%，正常胚状体诱导率高,工艺流程简单，生产成本低，所采用的培养基成分易于获取，具有很大的应用价值。
文档编号A01H4/00GK102845307SQ20121035513
公开日2013年1月2日 申请日期2012年9月21日 优先权日2012年9月21日
发明者黄天带, 华玉伟, 黄华孙, 孙爱花, 周权男, 戴雪梅 申请人:中国热带农业科学院橡胶研究所