专利名称：两条水稻mar序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程领域，更具体地，本发明涉及两条水稻来源的MAR序列及其应用。
背景技术：
植物转基因技术的飞速发展使其成为解决全球性粮食危机、资源短缺、生态恶化和劳动力减少等问题的有效途径，对农业、医药、环保和能源等领域产生了深远的影响。在植物转基因技术的发展过程中，转基因沉默(transgene silencing)的现象是影响其发展的重要因素之一。如何克服转基因沉默的现象已成为植物转基因技术发展的热点之一。目前，研究人员主要通过修饰改造外源基因或者加入调控序列的方法来克服转基因沉默的现象。
MAR/SAR (Matrix/Scaffold attachment region or Matrix/Scaffold association region,核基质结合区/核骨架附着区)是真核基因组中能够特异性紧密结合在核基质上的一段DNA序列，在真核基因组中大量存在。现有的研究表明，MAR序列之间不存在序列同源性，没有保守序列，但却含有多个共通的核心基元。这些核心基元包括富含AT、复制起始位点、弯曲DNA、扭结DNA、富含TG、拓扑异构酶II识别位点、植物保守基元、 ATC原则和MAR识别特征等。一般而言，MAR序列均富含AT，其他基元并非每个MAR序列都具备。MAR序列长度波动范围较大,最短的才几十个碱基对,最长的可达近8000碱基对,但多数MAR序列长度位于600至1200碱基对之间。MAR序列和核基质的特异性结合在进化上具有高度保守性，不同物种来源的MAR序列和核基质可以紧密结合。同时，研究也表明， MAR序列大量存在于染色体上，一般都位于基因间隔区，大多数MAR序列与微型反向重复转座元件共存。
由于MAR序列本身的特征，不具有保守性和序列同源性，再加上MAR序列分布范围极广泛，数量众多，且大多数MAR序列又不具有较强的外源基因调控功能，因此，要分离和克隆好用的MAR序列是相当困难的。随着生物信息学的发展和基因组测序的完善，诞生了一些新的MAR预测技术，为MAR的分离和克隆提供了一种新的途径。其中的 MarFinder (MAR-Wiz)是由英国科学家Dr. Singh开发的最早用于MAR序列预测的技术,具有更高的预测可靠性。
自MAR序列被分离纯化以来，其特征和功能就备受研究人员的关注，研究人员将 MAR序列连在报告基因的两侧进行共转化，发现MAR序列可以在并未改变报告基因拷贝数的情况下使其在受体内高效、稳定表达。目前，MAR序列的作用机制仍无定论，但其调控功能确已被广泛认同。基本认同MAR序列在植物转基因技术中对外源基因的转化效率、表达水平和稳定性以及遗传稳定性都具有明显的调控作用，能有效降低或消除转基因沉默现象的发生。
在植物转基因技术中，所有来源于非宿主来源的外源DNA片段都被认为是不安全的，都可能存在生物安全性的问题。选择宿主来源的DNA片段来尽可能替换外源DNA的使CN 102911936 A书明说2/8页用，已经成为目前研究人员在植物转基因技术中的一大趋势。在转基因水稻的研究中，选择水稻来源的MAR序列来调控外源基因的表达被认为是一种更安全的方式。发明内容
鉴于以上情况，为了获得水稻来源的MAR(matrix attachment region,MAR)序列， 降低或消除转基因沉默现象给植物转基因技术发展造成的阻碍和负面影响，本发明提供了两条水稻来源的MAR序列，并将其应用于植物转基因技术中，提高了外源基因的表达水平和稳定性，有效地降低或消除了转基因沉默现象的发生。
本发明提供了两条水稻来源的MAR的核苷酸序列，所述MAR的核苷酸序列如SEQ ID NO. I 和 SEQ ID NO. 2 所示。
所述MAR的核苷酸序列包括MAR序列的核心基元；所述MAR序列的核心基元包括富含AT、复制起始位点、弯曲DNA、扭结DNA、拓扑异构酶II识别位点、ATC原则和MAR识别特征。
本发明的另外一个目的在于将所述的水稻来源的MAR的核苷酸序列应用于植物转基因技术中，并获得稳定高效表达外源基因的转基因植株。该应用是将所述水稻来源的 MAR的核苷酸序列连入外源基因的两侧，构建表达载体，并将表达载体转化植株并获得转基因植物； 所述外源基因为GUS基因；所述植物为单子叶植物；所述植物是双子叶植物；所述单子叶植物为水稻、玉米、小麦、高粱、燕麦、黑麦、大麦、小米、糖甘蔗和禾草中的任一种；所述双子叶植物为大豆、荚果、油菜籽、棉花、向日葵、番茄、土豆、甜菜、紫花苜蓿、丁香和花生中的任一种。
本发明的显著优点本发明获得了两条新的水稻来源的MAR序列，并将其应用于植物转基因技术中，能够大大地提高外源基因的表达水平和稳定性，有效地降低或消除转基因沉默现象的发生，有助于促进植物转基因技术的发展和应用，具有显著的经济效益和社会效益。
图I为人工设计合成的多克隆位点短片段的序列及其所包含的限制酶酶切位点。
图2为植物表达载体pCAMBIA1300-Ml-济As的质粒图谱。
图3为植物表达载体pCAMBIA1300-M2-济As的质粒图谱。
图4为阳性对照表达载体pCAMBIA1300-^as的质粒图谱。
图5为潮霉素基因Hyg的PCR检测的电泳结果。第I至第3泳道为转 pCAMBIAl300-^5阳性对照转基因水稻的植株；第4至第6泳道为转pCAMBIA1300_Ml-#s 的水稻的阳性植株；第7和第8泳道为非转基因水稻的阴性对照；第9至第11泳道为转 pCAMBIA1300-M2-^5的水稻的阳性植株；第12泳道为ddH20的阴性对照 ’第13泳道为DNA Marker。4
图6为转基因水稻叶片的⑶S酶活分析。转Ml水稻是指转pCAMBIA1300-Ml-典s 质粒的转基因水稻；转M2水稻是指转pCAMBIA1300-M2-^as质粒的转基因水稻；阳性对照是指转pCAMBIAUOO^as质粒的转基因水稻；阴性对照是指非转基因水稻。
具体实施方式
本发明的两条水稻来源的MAR序列是通过如下步骤获得的1)利用水稻基因组数据库的信息结合MAR序列预测技术MAR-Wiz的预测分析确定候选的MAR序列；2)根据确定候选的MAR序列设计合成引物，通过PCR扩增的方法从水稻基因组DNA中克隆出候选MAR序列，并经过测序验证；分离和克隆候选MAR序列；3)将分离和克隆到水稻的候选MAR序列经序列分析，验证候选MAR序列是否符合MAR 的序列特征；4)将验证后的候选MAR序列构建于植物转基因(报告基因GUS)的两侧，并将构建物转化水稻，获得转基因水稻植株；5)通过检测转基因水稻叶片中报告基因GUS的表达水平与不含MAR序列的对照转基因水稻的比较，来分析和判断候选MAR序列是否提高了外源基因的表达水平和稳定性，从而确定候选MAR序列是否为所需要的水稻MAR序列。
以下结合具体实施例进一步阐述本发明，但是本发明不限于此。本发明所用的实验材料如无特别说明均为市售购买产品。(以下实施例的实验材料为日本晴水稻(Piyza sativa L. japonica cv.))实施例I :候选MAR序列的筛选根据AT-Richness、高表达基因的含量，选取富含AT-Richness和高表达基因的染色体用于筛选候选MAR序列。在BGI (Beijing Genomics Institute, BGI)水稻基因组数据库中查看染色体的基因图谱，选定基因密集区的功能基因(簇)间隔间的DNA序列作为待分析序列，长度一般为3 5kb。选择AT含量位于“65% ( AT% ( 80%”的序列，再通过MAR-Wiz在线分析(网址http://genomecluster. secs. Oakland, edu/)进行复筛。
MAR-ffiz不仅含有常见的MAR序列特征基兀，如ORI Pattern、TG-Richness Pattern、Curved DNA Pattern、Kinked DNA Pattern、Topo II Pattern、AT-Richness Pattern和ATC Rule等，还包括了适应本研究从水稻基因组筛选MAR序列的需要的“Plant MAR Consensus，，。
使用MAR-Wiz分析待测序列时,首先在MAR Finder Home Page递交待测序列,根据需要选择MAR Rules(本研究选中了 Core MAR Rules和New MAR Rules中所有基元和规则)， 使用默认参数或者重新设定相关参数(如Sliding Window Parameters和Peak Detection Parameter，本研究一般选用默认参数)。递交序列后，MAR-Wiz将待测序列的详细分析结果输出，根据MAR-Wiz分析结果，选择“Minimum Potential ^ I. 0000,具备核心区间(Core Region)和全部MAR Motifs”的序列作为候选MAR序列。正如文献综述中所说,TG-Richness 仅为一些MAR序列所有。同时，复筛序列中仅有少数序列含有TG-Richness。因此，也可将 “不含TG-Richness,但含有核心区间或具备较高MAR Potential ”的复筛序列纳入候选MAR 序列。候选MAR序列的特征分析如表I所示。
表I候选MAR序列中所含MAR序列的核心基元种类及其数目实施例2 :候选MAR序列的克隆2.I水稻叶片基因组DNA的提取提取植物基因组DNA，采用CTAB法，过程如下取约O. Ig的水稻叶片在液氮中磨成粉末，将适量的粉末材料转移至I. 5mlEP管中。加 Λ 600μ1预热(95°C)的I. 5X CTAB缓冲液，然后65°C温浴45min。取出EP管，冷却至室温后加入600μ1氯仿异戊醇(24:1)混合均匀，然后IOOOOrpm离心lOmin，取出后吸取上清液到另一新的EP管中。加入2/3体积的异丙醇混合均匀，冰浴至DNA丝状物出现。稍微离心沉淀DNA，倒掉上清液。加入600μ175%乙醇洗涤，放置30min。倒掉上清液，室温下吹干 DNA。加入ΙΟΟμΙ ddH20溶解DNA。电泳检测植物总DNA含量。
2. 2 PCR扩增候选MAR序列根据候选的两条MAR序列，分别设计合成两对引物(SEQ ID NO. 3) M1F 5’-GCGCAGCTGATTCCTCCCTCTACCTATGTTTG-3’(SEQ ID NO. 4) M1R 5’-GCGCAGCTGCATCCCTGTAAAAGGAAGAGTAG-3’ 和 (SEQ ID NO. 5)M2F 5’-GCGCAGCTGTCAATACACAAGTCCGAGTCGC-3’(SEQ ID NO. 6)M2R 5’-GCGCAGCTGACCTCCTCCAAAACCTAATCAC-3’ 用来扩增候选 MAR 序列Ml和M2。
PCR反应体系如下成分浓度体积基因组模板DNA50 ng/μ II uldNTP2. 5 mM4 ulTaq酶缓冲液10倍5 ul引物10 μ M5 ulTaq酶2. 5 U加ddH20至总体积50ul οPCR反应程序分别为Ml :94°C，5分钟;94°C，1分钟，58°C，1分钟，72°C，1分钟，29个循环；72°C延伸10分钟。
M2 :94°C，5 分钟；94°C，I 分钟，57°C，I 分钟，72°C，2 分钟，29 个循环；72°C延伸 10分钟。
Ml和M2的PCR扩增产物分别回收连入T载体pMD19_T (TaKaRa公司，大连)中， 经测序验证和序列比对，克隆MAR序列符合实验预期。
实施例3 :植物表达载体的构建3.I候选MAR中间载体pMD19T-Ml和pMD19T_M2的获得将Ml和M2的PCR扩增产物经过琼脂糖凝胶回收之后，TA克隆的方法连入T载体 PMD19-T中，分别获得中间载体PMD19T-M1和pMD19T_M2。
3. 2 GUS 表达盒 CaMV35S GUS Tnos 的获得限制酶历ζ /ΠΙ和&ORI双酶切质粒PCAMBIA1300-AGS获得⑶S片段，经过Klenow 大片段酶处理补平末端之后，插入到被单切并经过T4聚合酶补平处理的质粒pSPROK中，得到质粒pSPGUSA。
3. 3多克隆位点短片段的人工合成与中间载体pMD19-Ts_MCS的获得为了方便载体的构建，人工设计合成了一段短片段的多克隆位点(设计方案如图I 所示)，并将合成好的多克隆位点插入到T载体pMD19T-Simple (TaKaRa公司，大连)中得到质粒 pMD19-Ts-MCS。
3. 4 植物表达载体 pCAMBIA1300-Ml-讲S 和 pCAMBIA1300_M2_讲的获得限制酶A^zII单酶切质粒pMD19T-Ml获得MAR序列Ml片段，分别先后以反向重复的方式插入到质粒pMD19-Ts-MCS的Stul位点和&oRV位点获得质粒pMD19Ts_MCS_Ml。再用限制酶JktII酶切质粒pMD19Ts-MCS_Ml获得两个反向重复的Ml片段并用Klenow补平末端， 插入到Λ / /ΙΙΙ单切并Klenow补平末端的质粒pC AMBIA1300中获得质粒pCAMBIA1300_Ml。 用Hindlll和&oRI双酶切质粒pSP⑶SA并Klenow补平末端获得⑶S表达盒片段，插入到质粒PCAMBIA1300-M1的功位点，构建得到植物表达载体ρ0ΑΜΒΙΑ1300-Μ1-#Λ5，质粒图谱如图2所示。
通过同样的构建流程获得植物表达载体ρ0ΑΜΒΙΑ1300-Μ2^Λ5，质粒图谱如图3所/Jn ο
3.5阳性对照表达载体PCAMBIA1300-典s的获得限制酶和&oRI双酶切质粒pSP⑶SA获得⑶S表达盒片段，插入到同样双酶切的质粒PCAMBIA1300中，构建得到植物表达载体pCAMBIA1300 质粒图谱如图4所/Jn ο
实施例4 :转基因水稻的获得4.I NB培养基配方(基本培养基)N6 大量硝酸钾 KNO3 2830 mg. Γ1，硫酸氨(NH4) 2S04 4 6 3 mg. L_\ 磷酸二氢钾 KH2PO4 400 mg. Γ1，硫酸镁 MgSO4 · 7Η20 185 mg. Λ 氯化钙 CaC12 · 2H20 166 mg. L-1 ；B5 微量硼酸 H3BO4 3 mg. Λ 硫酸錳 MnSO4 .H2O 7. 58 mg. Λ 硫酸锌 ZnSO4 · 7Η20 2 mg. ΙΛ 碘化钾 KI O. 75 mg. Λ 钥酸钠 Na2Mo04 · 2H20 0. 25 mg. Λ 硫酸铜 CuSO4 · 5H20 0. 025 mg. ΙΛ 氯化钴 CoCl2 · 6H20 0. 025 mg. L-1 ；铁盐硫酸亚铁 FeSO4 · 7H20 27. 8 mg. Γ1，乙二胺四乙酸二钠 Na2EDTA 37. 3 mg. Γ1 ； 肌醇肌醇 Myo-inositol 100 mg. L-1 ；有机成分盐酸硫胺素ThiamineHCl 10 mg. I71,盐酸批卩多醇PyridoxineHCl I mg. I71,尼克酸 Niacin I mg. I71,水解酪蛋白 Casamino acids 300 mg.L—1，谷氨酰胺 Glutamine 250 mg. L-1,脑氨酸 Proline 500 mg. L-1,甘氨酸 Glycine 2 mg. L-1,鹿糖 Sucrose 30000 mg. L-1,琼脂 Phytagel 2400 mg. L-1 pH 值 5· 8-5. 9。
注意有机成分不能高压灭菌，须用滤器抽滤，分装后-20°C保存 4.2愈伤组织的培养取水稻幼穗开花12-15 d后的幼嫩种子，剥去颖壳，于75%的乙醇灭菌O. 5-1 min, 再用10-30%次氯酸纳溶液灭菌15-30 min,超净台中无菌水冲洗3_4遍，置于无菌滤纸上晾干。用镊子及解剖针取出幼胚，置于诱导培养基(基本培养基+ 2，4 - D 2 mg L-1 ；pH 5.S-5.9)上，27° C暗培养。10-15 d后切除幼胚的芽鞘等，只留下末端的细胞膨大体，转7接于新的诱导培养基(基本培养基+ 2，4 - D 2 mg Γ1 ；pH 5. 8-5.9)中，其后每20 d在诱导培养基上继代培养I次，3次后获得生长迅速的胚性愈伤组织作农杆菌转化。
4. 3农杆菌介导转化参照BIO-RAD公司电激仪的说明书，将植物表达载体P1300-LF-AGCSGS通过电激法转化到根癌农杆菌LBA4404中。
取生长旺盛的胚性愈伤组织于灭菌培养皿中，加入相应浓度(0D_值1-2)的农杆菌液(上述载体转化后的根癌农杆菌LBA4404)浸泡3-5 min后将愈伤组织取出晾干，然后转接于铺有一张无菌滤纸的共培养基(基本培养基+ 2，4 - D 2 mg L—1+ AS ΙΟΟμΜ ； pH 5. 2)上，28°C避光共培养2-3 d。共培养后，将愈伤组织转移到无菌培养皿中，超净台中无菌水漂洗3次，再用含羧苄青霉素250 mg L—1的无菌水洗I次以杀除农杆菌，取出愈伤组织后用无菌滤纸吸干，转接于含羧苄青霉素250 mg L—1和hygromycin 50 mg L—1或PPT 15 mg L—1的筛选培养基(基本培养基+ 2， 4 - D 2 mg Γ1 +羧苄青霉素250 mg Γ1 + hygromycin 50 mg Γ1 (或 PPT 15 mg L'pH 5· 8-5.9)上 28 °C避光培养筛选抗性愈伤组织。侵染过的愈伤组织在筛选培养基上培养20-30 d后，将边缘长出的抗性愈伤组织转接于新的筛选培养基上继续筛选1-2次。
在筛选培养基筛选获得的抗性愈伤组织转接于分化培养基(基本培养基+ KT 10 mg I/1+ NAA 0.4 mg Γ1 ；ρΗ 5. 8-5. 9)上，28°C暗培养 7-10 d，然后移至光照下(14 h/d) 培养，随后逐渐长出绿点，最后分化成小苗。小苗完全分化后，转接于生根培养基中(1/2 MS无机盐(指无机盐含量减半)+ MS有机成分(是指NB培养基配方(基本培养基)中的有机成分，包含盐酸硫胺素ThiamineHCl 10 mg.厂1,盐酸批卩多醇PyridoxineHCl I mg. I71, 尼克酸 Niacin I mg. I71,水解酪蛋白 Casamino acids 300 mg. I71,谷氨酸胺 Glutamine 250 mg. L \ 脑氛酸 Proline 500 mg. L S 甘氛酸 Glycine 2 mg. L \ 鹿糖 Sucrose 30000 mg. I71,琼脂 Phytagel 2400 mg. L-1) + hygromycin 30 mg L-1 (或 PPT 10 mg L-1) ；pH 5. 8-5.9)28 °C，光照14 h/d培养14-21 d进行生根并筛选。生根后获得的抗性小苗洗去根部培养基后，移于1/10 MS营养液水培3-5 d可长出新根，然后移栽于温室或网室水田。
4.4转基因水稻的PCR检测采用CTAB法提取植物基因组DNA，过程如实施例2的2. I节所述。
PCR检测再生植株中潮霉素(hyg)抗性基因，根据潮霉素(hyg)抗性基因的序列特异性合成一对引物，如下(SEQ ID NO. 7)上游引物为5’ -TACACAGCCATCGGTCCAGA-3’(SEQ ID NO. 8)下游引物为5’-TAGGAGGGCGTGGATATGTC-3’PCR反应体系如实施例2的2. 2节所述。
PCR反应程序-MV，5分钟-MV，I分钟，56。。，I分钟，72°C，I分钟，35个循环； 72°C延伸10分钟。
转基因PCR检测的结果参见图5所示，能扩增出840bp条带的样品为转基因水稻阳性植株，结果表明样品1-6和9-11均为转基因阳性植株。
实施例5 :转基因水稻叶片的⑶S酶活分析5.I水稻叶片GUS蛋白的提取叶片选取幼嫩叶片靠近叶尖部位，约5-10mg，放入2ml离心管中，每管加600 μ I⑶SCN 102911936 A书明说7/8页extraction buffer (50mM NaHPO4 (憐酸缓冲液)，pH7. O, 10 mM 2-mercaptoethanol, IOmM Na2EDTA, O. I % sodium lauryl sarcosine, 0. 1% Triton X-100)。然后每管加入一粒直径约6mm不锈钢珠，在QIAGEN公司的磨样器TissueLyser上以每分钟20次的频率震动磨样5分钟。接着于冷冻离心机上4°C 13000转/分钟离心10分钟，将上清转入96孔微孔板中，注意记录样品所对应的孔号。硅胶板密封，保存于4°C备用，尽快于2天之内检测完成。
5.2总蛋白的测定总蛋白的定量测定采用经典的Bradford法(1976)，具体操作参照天根生物(北京)公司的Bradford蛋白质定量试剂盒(目录号PA102)的说明书进行。考马斯亮蓝G-250染液为自己配制，BSA标准品采用上述试剂盒提供的，试验采用96孔微孔板进行测定。反应体系采用285 μ I考马斯亮蓝G-250染液+15 μ I蛋白溶液，标准曲线制作中增加标准品BSA的浓度范围，标准品浓度分别选取 0、1/15、2/15、3/15、4/15、5/15、6/15、7/15、8/15、9/15 mg/ ml进行测定。以不同的BSA标准品浓度与对应的OD595值在Excel表里制作散点图，并求出两者的相关性方程以及变异程度R2值。待测样品的浓度若超出该标准曲线的范围，则需要适当稀释之后重新测定，最终的浓度值需要根据具体的稀释度换算回去。
5. 3⑶S酶活荧光测定标准曲线的制作GUS 酶活测定主要参照 Pharmacia Biotech 公司的 DyNA Quant 200 Fluorometer 的使用手册进行。称取4-MU钠盐(分子量198. 20)19. 8mg溶于IOOml去离子水中，得到4-MU stock solution A。取 10μ1 4-MU stock solution A加入到 10ml 去离子水中，得到 4-MU stock solution B。按照每管加 0、25、50、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、 1000 μ I 的 4-MU stock solution B,然后分别用 0. 2M 的 Carbonate stop buffer 补足到 1000 μ 1，每管取200 μ I去荧光检测仪上读数测定。以不同的4-MU浓度对应不同的荧光读数在Excel表里制作散点图，并求出两者的相关性方程以及变异程度R2值。
5. 4⑶S蛋白酶的酶促催化反应取一块96孔微孔板置于冰上预冷，然后每孔迅速加入50 μ I预冷的⑶S assay buffer,再快速加入每孔50 μ I的待测样品蛋白溶液，封板纸进行密封。快速放入37°C培养箱中保温45分钟，然后每孔迅速加入900 μ I 0. 2Μ的Carbonate stop buffer (0. 2M Na2CO3)终止反应。
5. 5⑶S酶活的荧光测定基本参照Thermo Scientific公司的荧光测量仪FLU0R0SCAN ASCENT FL说明书进行操作。滤光片组选择激发波长为355nm的滤光片和发射波长为460nm的滤光片,放大系数为5/1，扫描方式为终点测定，以不加任何样品的空白孔作为空白阴性对照。采用96孔酶标板的微孔板进行测定，每孔加样200 μ I。若样品的荧光值大于或接近标准曲线中的最大值，则该样品需要适当稀释之后重测。
5.6⑶S酶活数据的分析GUS酶活力的单位定义为单位时间内单位质量的GUS酶蛋白催化产生的具有荧光活性的4-MU的摩尔数，具体为每分钟每毫克酶蛋白催化所产生的4-MU的皮摩尔数(即pmol/mg/ min)。GUS酶活数据均换算成标准的酶活力单位，根据不同的酶活力单位来判断济As基因的表达水平。9
转表达载体pCAMBIA1300-Ml-济As、pCAMBIA1300_M2-济As 和阳性对照转 pCAMBIAl300-^5的转基因水稻以及阴性对照非转基因水稻的单株叶片的GUS酶活的测定结果如图6所示。阴性对照的⑶ S酶活接近于零的水平，可以忽略不计。阳性对照的⑶S 酶活大多处于300-1400 (单位pmol/mg/min)之间,平均约660 (单位pmol/mg/min)。转 pCAMBIA1300-Ml-^5的转基因水稻的⑶S酶活大多处于2000-5000 (单位pmol/mg/min) 之间,平均约3300 (单位pmol/mg/min)。转pCAMBIA1300_M2_典s的转基因水稻的⑶S酶活大多处于 9000-13000 (单位pmol/mg/min)之间，平均约 12400 (单位pmol/mg/min)。 结果说明，无论从转基因水稻的单株GUS酶活水平还是群体的GUS酶活均值，MAR序列的存在都有效提高了外源基因的表达水平。另外，从单株之间的差异来看，带有MAR序列的转基因水稻明显比阳性对照的群体内的差异要小，表明MAR序列的存在提高了外源基因的表达稳定性。
以上对本发明的详细描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明做出各种改变和变形，这些改变和变形均应属于本发明所附权利要求的范围。
权利要求
1.一条水稻来源的MAR的核苷酸序列，其特征在于所述MAR的核苷酸序列如SEQ IDNO. I所示。
2.一条水稻来源的MAR的核苷酸序列，其特征在于所述MAR的核苷酸序列如SEQ IDNO. 2所示。
3.根据权利要求I或2所述的MAR的核苷酸序列，其特征在于所述MAR的核苷酸序列包括MAR序列的核心基元；所述MAR序列的核心基元包括富含AT、复制起始位点、弯曲DNA、扭结DNA、拓扑异构酶II识别位点、ATC原则和MAR识别特征。
4.如权利要求I或2所述的水稻来源的MAR的核苷酸序列的应用，其特征在于该应用是将所述水稻来源的MAR的核苷酸序列连入外源基因的两侧，构建表达载体，并将表达载体转化植株并获得转基因植物。
5.根据权利要求4所述的水稻来源的MAR的核苷酸序列的应用，其特征在于所述外源基因为GUS基因。
6.根据权利要求4所述的水稻来源的MAR的核苷酸序列的应用，其特征在于所述植物为单子叶植物。
7.根据权利要求4所述的水稻来源的MAR的核苷酸序列的应用，其特征在于 所述植物是双子叶植物。
8.根据权利要求6所述的水稻来源的MAR的核苷酸序列的应用，其特征在于所述单子叶植物为水稻、玉米、小麦、高粱、燕麦、黑麦、大麦、小米、糖甘蔗和禾草中的任一种。
9.根据权利要求7所述的水稻来源的MAR的核苷酸序列的应用，其特征在于所述双子叶植物为大豆、荚果、油菜籽、棉花、向日葵、番茄、土豆、甜菜、紫花苜蓿、丁香和花生中的任一种。
全文摘要
本发明提供了两条水稻来源的MAR的核苷酸序列，所述MAR的核苷酸序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。所述MAR的核苷酸序列包括MAR序列的核心基元；所述MAR序列的核心基元包括富含AT、复制起始位点、弯曲DNA、扭结DNA、拓扑异构酶II识别位点、ATC原则和MAR识别特征。本发明将所述水稻来源的MAR的核苷酸序列连入外源基因的两侧，构建表达载体，并将表达载体转化植株，能够大大地提高外源基因的表达水平和稳定性，有效地降低或消除转基因沉默现象的发生，有助于促进植物转基因技术的发展和应用，具有显著的经济效益和社会效益。
文档编号A01H5/00GK102911936SQ20121047628
公开日2013年2月6日 申请日期2012年11月22日 优先权日2012年11月22日
发明者王 锋, 胡太蛟, 武建伟 申请人:福建省农业科学院生物技术研究所