专利名称：以叶片为外植体的光叶蔷薇植株的再生方法
技术领域：
本发明涉及以叶片为外植体的光叶蔷薇植株的再生方法，属于植物组织与细胞培养技术领域。
背景技术：
光叶蔷薇(Rosawichuriana Crep.)属于蔷薇科(Rosaceae)蔷薇属(Rosa)攀援灌木，是现代月季原始亲本之一。主要分布在我国的浙江、广东、广西、福建、台湾等省及日本、朝鲜等国。现已培育出很多园艺品种，并广泛栽培。目前，尚未见到光叶蔷薇及其杂交种的体细胞再生途径研究的系统报道，制约了研究者对月季优良性状的深入研究和应用。Lloyd等(1988)在仅含有BA和NAA的培养基 上直接从光叶蔷薇的叶上诱导出不定芽，但未报道诱导率。郭艳超等(2008)通过类原球茎途径以光叶蔷薇的叶片为外植体得到了类原球茎，但未报道得到再生植株。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种以叶片为外植体的光叶蔷薇植株的再生方法，以光叶蔷薇顶生幼嫩小叶为材料，通过体器官发生途径，建立光叶蔷薇再生体系的方法，同时本发明方法所获得的胚性愈伤组织，可作为光叶蔷薇遗传转化的材料。本发明通过下列技术方案实现一种以叶片为外植体的光叶蔷薇植株的再生方法，其特征在于经过下列各步骤
(O将光叶蔷薇的健壮幼嫩枝条灭菌后切成单芽茎段，接种于下列培养基上MS基本培养基 +1. 0mg/L6-BA+0. lmg/LNAA+6. 5g/L 琼脂 +30g/L 蔗糖，ρΗ=5· 8 6. 0，于 24 士 2°C,光照强度为1500 20001χ，光照时间为16h/d的条件下，继代培养2 4周，得到光叶蔷薇的无菌苗；
(2)切取步骤(I)所得光叶蔷薇无菌苗的顶生幼嫩小叶，将其接种于下列诱导培养基上MS基本培养基+5. O 9. Omg/L α -萘乙酸+30. Og/L葡萄糖+2. 5g/L植物凝胶，pH=5. 8 6. 0，并将叶背朝向培养基，在24 士 2°C的黑暗条件下，培养至诱导出胚性愈伤组织；
(3)将步骤(2)得到的胚性愈伤组织接种到下列增殖分化培养基上MS基本培养基+3. O 6. Omg/L N-苯基-N，-1, 2，3-噻重氮-5-基脲+30g/L葡萄糖+2. 5g/L植物凝胶，pH=5. 8 6. 0，先在24 士 2°C的黑暗条件下培养10 11天，然后在24 士 2°C、光照强度为1500 20001x、光照时间为16h/d的条件下，培养至分化出不定芽；
(4)切下步骤(3)得到的不定芽，接种到下列成苗培养基上MS基本培养基+0.1 1. 0mg/L 6-苄基腺嘌呤+0. 01 0. lmg/L α -萘乙酸+30. 0g/L蔗糖+6. 5g/L琼脂粉，pH=5. 8 6. 0，在温度为24 士 2°C、光照强度为1500 20001x、光照时间为16h/d的条件下，培养至不定芽再生出植株；
(5)将步骤(4)得到的植株接种到下列生根培养基上1/2MS基本培养基+0.Olmg/La-萘乙酸+30. Og/L蔗糖+6. 5g/L琼脂粉，pH=5. 8 6. 0，在温度为24 士 2°C、光照强度为1500 20001x、光照时间为16h/d的条件下，进行生根培养，直至培养出完整的植株。所述步骤(I)的茎段灭菌是先用1%的洗衣粉漂洗lOmin，再在自来水下冲洗60min,然后用1%升萊消毒8min,再以无菌水洗4 5次。作为优选方案，所述步骤(2)的诱导培养基中的a -萘乙酸为5. Omg/L
作为优选方案，所述步骤(3)的增殖分化培养基中N-苯基-N’ -1, 2，3-噻重氮-5-基脲(TDZ)为 5. Omg/L ο作为优选方案，所述步骤(3)的黑暗培养天数为10天。作为优选方案，所述步骤(4)的成苗培养基中6-苄基腺嘌呤为O. lmg/L、a -萘乙酸为 O. 05mg/L。 所述的植物激素定义及简称如下植物生长调节物质包括a -萘乙酸(NAA)，植物细胞分裂素包括N-苯基-N’ -1, 2，3-噻重氮-5-基脲(TDZ)、6-苄基腺嘌呤(6-BA)。所述植物凝胶为市购产品，作为培养基的凝固剂，其作用类似于琼脂。本发明以光叶蔷薇叶片为外植体，通过器官发生途径进行光叶蔷薇植株再生，以光叶蔷薇顶生幼嫩小叶为外植体，直接诱导胚性愈伤组织，继而分化不定芽得到完整的再生植株；这些胚性愈伤组织为农杆菌介导的遗传转化提供了良好的受体；同时，该再生体系也是光叶蔷薇遗传转化的理想受体并为研究转基因月季新品种奠定了一定的技术基础。本发明具备的优点和效果是
(1)本发明所采用的外植体来源不受季节限制，可以周年进行光叶蔷薇的组织和细胞培养；
(2)本发明得到的胚性愈伤组织，可以作为遗传转化的良好受体，为光叶蔷薇遗传转化体系的建立提供受体；
(3)本发明建立的再生体系可以解决光叶蔷薇繁殖上的难题，以更好的保护和利用该资源。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明做进一步说明。实验材料光叶蔷薇采自云南省昆明市云南农业科学院花卉研究所雨树村野生资源圃，为通过光叶蔷薇培育出的园艺杂交品种‘Rosa wichuraina ‘Basye’ s Thornless’，二倍体，该种引种于美国A&M大学。该材料具有一年一次开花，花白色，五瓣花，茎干无皮刺，匍匐，抗白粉病等性状特点，是研究蔷薇属植株性状发育的理想模式材料，并已在月季花发育研究领域得到广泛应用。实施例1
(1)将上述光叶蔷薇的健壮幼嫩枝条先用1%的洗衣粉漂洗lOmin，再在自来水下冲洗60min,然后在超净工作台上用1%升汞消毒8min，再以无菌水洗5次后，切成单芽茎段，接种于下列培养基上MS基本培养基+1. 0mg/L6-BA+0. lmg/LNAA+6. 5g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH=6.0，于25°C、光照强度为15001x、光照时间为16h/d的条件下，进行继代培养2周，得到光叶蔷薇的无菌苗；
(2)切取步骤(I)所得光叶蔷薇无菌苗的顶生幼嫩小叶，自小叶柄处将其切成带有小叶柄的单叶，将其接种于诱导培养基上MS基本培养基+5. Omg/L α -萘乙酸+30. Og/L葡萄糖+2. 5g/L植物凝胶，pH=6. 0，并将叶背朝向培养基，在温度为24°C的黑暗条件下，培养诱导胚性愈伤组织，培养25天后小叶柄处形成胚性愈伤；
(3)将步骤(2)得到的胚性愈伤组织接种到增殖分化培养基上MS基本培养基+5.Omg/L N-苯基-N，-1, 2，3-噻重氮-5-基脲(TDZ)+30g/L葡萄糖+2. 5g/L植物凝胶，pH=6. O,先在温度为24°C的黑暗条件下培养10天，然后在温度24°C、光照强度为20001x、光照时间为16h/d的条件下，进行分化培养25天，得到I 2cm的不定芽；
(4)将步骤(3)得到的不定芽从外植体上切下接种到成苗培养基上MS基本培养基+0. lmg/L 6-苄基腺嘌呤 +0. 05mg/L α -萘乙酸 +30. Og/L 蔗糖 +6. 5g/L 琼脂粉，ρΗ=6· O,在温度为24°C、光照强度为20001x、光照时间为16h/d的的条件下，培养2周，使其再生出2 3cm植株；
(5)将步骤(4)中得到的植株接种到生根培养基上1/2MS基本培养基+0.01mg/La -萘 乙酸+30. Og/L蔗糖+6. 5g/L琼脂粉，pH=6. 0，在温度为24°C、光照强度为20001x、光照时间为16h/d的条件下，进行生根培养2周，得到完整的根系发育良好的光叶蔷薇植株；
(6 )将步骤(5 )的光叶蔷薇植株在散射光下炼苗一周，然后移栽到经高压灭菌的泥炭土中室内种植，成活后移到室外。
实施例2
(1)将上述光叶蔷薇的健壮幼嫩枝条先用1%的洗衣粉漂洗lOmin，再在自来水下冲洗60min,然后在超净工作台上用1%升汞消毒8min，再以无菌水洗4次后，切成单芽茎段，接种于下列培养基上MS基本培养基+1. 0mg/L6-BA+0. lmg/LNAA+6. 5g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH=5.8，于22°C、光照强度为18001x、光照时间为16h/d的条件下，进行继代培养3周，得到光叶蔷薇的无菌苗；
(2)切取步骤(I)所得光叶蔷薇无菌苗的顶生幼嫩小叶，将其接种于诱导培养基上MS基本培养基+不同浓度7. 0mg/L的a -萘乙酸+30. 0g/L葡萄糖+2. 5g/L植物凝胶，pH=5. 8，并将叶背朝向培养基，在温度为26°C的黑暗条件下，培养21天后小叶柄处有胚性愈伤形成；
(3)将步骤(2)得到的胚性愈伤组织接种到增殖分化培养基上MS基本培养基+6.Omg/L N-苯基-N，-1, 2，3-噻重氮-5-基脲(TDZ)+30g/L葡萄糖+2. 5g/L植物凝胶，pH=5. 8，先在温度为26°C的黑暗条件下培养11天，然后在温度为26°C、光照强度为18001x、光照时间为16h/d的条件下，进行分化培养21天，得到不定芽；
(4)将步骤(3)得到的不定芽接种到成苗培养基上MS基本培养基+0.5mg/L 6-苄基腺嘌呤+0. O lmg/L α-萘乙酸+30. 0g/L蔗糖+6. 5g/L琼脂粉，ρΗ=5· 8，在温度为26°C、光照强度为15001x、光照时间为16h/d的条件下，培养2周，使其再生出2 3cm植株；
(5)将步骤(4)中得到的植株接种到生根培养基上1/2MS基本培养基+0.01mg/La -萘乙酸+30. 0g/L蔗糖+6. 5g/L琼脂粉，pH=5. 8，在温度为26°C、光照强度为15001x、光照时间为16h/d的条件下，进行生根培养，2周后可获得完整的植株。实施例3
(O将光叶蔷薇的健壮幼嫩枝条先用1%的洗衣粉漂洗lOmin，再在自来水下冲洗60min,然后在超净工作台上用1%升汞消毒8min，再以无菌水洗5次后，切成单芽茎段，接种于下列培养基上MS基本培养基+1. 0mg/L6-BA+0. lmg/LNAA+6. 5g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH=5. 9，于温度为24°C、光照强度为20001x光照时间为16h/d的条件下，进行继代培养4周得到光叶蔷薇的无菌苗；
(2)切取步骤(I)所得光叶蔷薇无菌苗的顶生幼嫩小叶，将其接种于诱导培养基上MS基本培养基+9. Omg/L α -萘乙酸+30. Og/L葡萄糖+2. 5g/L植物凝胶，pH=6. O,并将叶背朝向培养基，在温度为22°C的黑暗条件下，培养24天诱导胚性愈伤组织；
(3)将步骤(2)得到的胚性愈伤组织接种到增殖分化培养基上MS基本培养基+4.Omg/L的N-苯基-N，-1, 2，3-噻重氮-5-基脲(TDZ)+30g/L葡萄糖+2. 5g/L植物凝胶，pH=6. 0，先在温度22°C的黑暗条件下培养10天，然后在温度22°C、光照强度为15001x光照时间为16h/d的条件下培养24天后得到不定芽；
(4)将步骤(3)得到的不定芽接种到成苗培养基上MS基本培养基+1.Omg/L 6-苄基腺嘌呤+0. lmg/L α -萘乙酸+30. Og/L蔗糖+6. 5g/L琼脂粉，pH=6. 0，在温度22°C的光照强 度为18001x光照时间为16h/d的条件下，培养2周，使其再生出2 3cm植株；
(5)将步骤(4)中得到的植株接种到生根培养基上1/2MS基本培养基+0.01mg/La -萘乙酸+30. 0g/L蔗糖+6. 5g/L琼脂粉，pH=5. 9，在温度22°C、光照强度为18001x光照时间为16h/d的条件下进行生根培养，2周后即可得到完整的植株。实施例4
(O将光叶蔷薇的健壮幼嫩枝条先用1%的洗衣粉漂洗lOmin，再在自来水下冲洗60min,然后在超净工作台上用1%升汞消毒8min，再以无菌水洗5次后，切成单芽茎段，接种于下列培养基上MS基本培养基+1. 0mg/L6-BA+0. lmg/LNAA+6. 5g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH=6. O,于26°C光照强度为20001x，光照时间16h/d的条件下，进行继代培养2周得到光叶蔷薇的无菌苗；
(2)切取步骤(I)所得光叶蔷薇无菌苗的顶生幼嫩小叶，将其接种于诱导培养基上MS基本培养基+8. 0mg/L a -萘乙酸+30. 0g/L葡萄糖+2. 5g/L植物凝胶，pH=6. O,并将叶背朝向培养基，在温度25°C的黑暗条件下培养诱导胚性愈伤组织；
(3)将步骤(2)得到的胚性愈伤组织接种到增殖分化培养基上MS基本培养基+3.Omg/L N-苯基-N，-1, 2，3-噻重氮-5-基脲(TDZ) +30g/L葡萄糖+2. 5g/L植物凝胶，pH=6. 0，先在温度25°C的黑暗条件下培养11天，然后在温度25°C、光照强度为20001x光照时间为16h/d的条件下培养25天可得到不定芽；
(4)将步骤(3)得到的不定芽接种到成苗培养基上MS基本培养基+0.5mg/L 6-苄基腺嘌呤+0. 05mg/L a -萘乙酸+30. 0g/L蔗糖+6. 5g/L琼脂粉，ρΗ=5· 8，在温度为25°C，光照强度为20001x光照时间为16h/d的条件下培养，使其生长成植株；
(5)将步骤(4)中得到的植株接种到生根培养基上1/2MS基本培养基+0.01mg/La -萘乙酸+30. 0g/L蔗糖+6. 5g/L琼脂粉，pH=5. 8，在温度25°C、光照强度为20001x光照时间为16h/d的条件下生根培养，2周后即可得到完整的植株。实施例5
(O将光叶蔷薇的健壮幼嫩枝条先用1%的洗衣粉漂洗lOmin，再在自来水下冲洗60min,然后在超净工作台上用1%升汞消毒8min，再以无菌水洗5次后，切成单芽茎段，接种于下列培养基上MS基本培养基+1. 0mg/L6-BA+0. lmg/LNAA+6. 5g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH=5.8，于温度为26°C、光照强度为20001x、光照时间为16h/d的条件下，进行继代培养4周得到光叶蔷薇的无菌苗；
(2)切取步骤(I)所得光叶蔷薇无菌苗的顶生幼嫩小叶，将其接种于诱导培养基上MS基本培养基+9. Omg/L α -萘乙酸+30. Og/L葡萄糖+2. 5g/L植物凝胶，pH=5. 8，并将叶背朝向培养基，在温度25°C的黑暗条件下，培养23天诱导胚性愈伤组织；
(3)将步骤(2)得到的胚性愈伤组织接种到增殖分化培养基上MS基本培养基+3.Omg/L N-苯基-N’-1，2，3-噻重氮-5-基脲(TDZ)+30g/L葡萄糖+2. 5g/L植物凝胶，pH=5. 9，先在温度25°C的黑暗条件下培养10天，然后在温度25°C、光照强度为20001x光照时间为16小时的条件下培养25天，可得到不定芽；
(4)将步骤(3)得到的不定芽接种到成苗培养基上MS基本培养基+0.5mg/L 6-苄基 腺嘌呤+0. lmg/L α -萘乙酸+30. Og/L蔗糖+6. 5g/L琼脂粉，pH=5. 9，在温度25°C、光照强度为20001x光照时间为16h/d的条件下培养，使其生长为植株；
(5)将步骤(4)中得到的植株接种到生根培养基上1/2MS基本培养基+0.01mg/La -萘乙酸+30. Og/L蔗糖+6. 5g/L琼脂粉，pH=5. 8，在温度25°C、光照强度为20001x光照时间为16小时的条件下进行生根培养，2周即得到完整的植株。
权利要求
1.一种以叶片为外植体的光叶蔷薇植株的再生方法，其特征在于经过下列各步骤(O将光叶蔷薇的健壮幼嫩枝条灭菌后切成单芽茎段，接种于下列培养基上MS基本培养基 +1. 0mg/L6-BA+0. lmg/LNAA+6. 5g/L 琼脂 +30g/L 蔗糖，ρΗ=5· 8 6. O，于 24 士 2°C, 光照强度为1500 20001χ，光照时间为16h/d的条件下，继代培养2-4周，得到光叶蔷薇的无菌苗；(2)切取步骤(I)所得光叶蔷薇无菌苗的顶生幼嫩小叶，将其接种于下列诱导培养基上MS基本培养基+5. O 9. Omg/L α -萘乙酸+30. Og/L葡萄糖+2. 5g/L植物凝胶， pH=5. 8 6. 0，并将叶背朝向培养基，在24 士 2°C的黑暗条件下，培养至诱导出胚性愈伤组织；(3)将步骤(2)得到的胚性愈伤组织接种到下列增殖分化培养基上MS基本培养基 +3. O 6. Omg/L N-苯基-N，-1, 2，3-噻重氮-5-基脲+30g/L葡萄糖+2. 5g/L植物凝胶， pH=5. 8 6. 0，先在24 士 2°C的黑暗条件下培养10 11天，然后在24 士 2°C、光照强度为 1500 20001x、光照时间为16h/d的条件下，培养至分化出不定芽；(4)切下步骤(3)得到的不定芽，接种到下列成苗培养基上MS基本培养基+0.1 1.Omg/L 6-苄基腺嘌呤+0. 01 O. lmg/L α -萘乙酸+30. Og/L蔗糖+6. 5g/L琼脂粉， pH=5. 8 6. 0，在温度为24 士 2°C、光照强度为1500 20001x、光照时间为16h/d的条件下，培养至不定芽再生出植株；(5)将步骤(4)得到的植株接种到下列生根培养基上1/2MS基本培养基+0.Olmg/ L α -萘乙酸+30. 0g/L蔗糖+6. 5g/L琼脂粉，pH=5. 8 6. 0，在温度为24 士 2°C、光照强度为1500 20001x、光照时间为16h/d的条件下，进行生根培养，直至培养出完整的植株。
2.根据权利要求1所述的以叶片为外植体的光叶蔷薇植株的再生方法，其特征在于所述步骤(I)的茎段灭菌是先用1%的洗衣粉漂洗lOmin，再在自来水下冲洗60min，然后用 1%升萊消毒8min,再以无菌水洗4 5次。
全文摘要
本发明涉及一种以叶片为外植体的光叶蔷薇植株的再生方法，先在继代培养基上培养出无菌苗，再在诱导培养基上培养愈伤组织，又在增殖分化培养基上培养分化出不定芽，在成苗培养基上培养再生出植株，最后在生根培养基上培养得到完整的植株。本发明的方法具有外植体来源广泛、取材方便等优点。所得到的胚性愈伤组织可以作为农杆菌介导的遗传转化的良好受体，可用于光叶蔷薇遗传转化的研究。本发明还涉及用于该方法的培养基组成。
文档编号A01H4/00GK103004600SQ20121056194
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月22日 优先权日2012年12月22日
发明者吕经娟, 唐开学, 李淑斌, 蹇洪英, 晏慧君, 周宁宁, 张颢 申请人:云南省农业科学院花卉研究所